王家歡 王曉藝 勞國娟 王川 楊川 嚴勵 任萌

糖尿病周圍神經病變是糖尿病最常見的一種并發(fā)癥，超過一半的糖尿病患者可能發(fā)生糖尿病周圍神經病變［1］。神經痛、麻木等癥狀嚴重影響患者的生活質量，且糖尿病周圍神經病變也是導致糖尿病足截肢率升高的主要原因［2］。髓鞘由施旺細胞包繞軸突形成，髓鞘的絕緣性可介導神經沖動準確而快速的傳導，并且在維持軸突的生理特性如軸突運輸和軸突直徑大小中起重要作用［3］。施旺細胞在病理情況下可以重編程即去分化，參與神經功能的修復再生及病理過程［4］。KROX20是髓鞘蛋白的主要調控因子，KROX20的敲除可引起極速的脫髓鞘及施旺細胞去分化。C?JUN及其磷酸化分子是施旺細胞成髓分化的負向調節(jié)因子，可拮抗KROX20 的作用，使施旺細胞去分化。信號通路p38 MAPK 及β?catenin 在髓鞘發(fā)生及神經修復等過程發(fā)揮不同的作用，但在糖尿病周圍神經施旺細胞去分化的作用尚不明確。本文旨在觀察糖尿病周圍神經病變的病理改變，探討施旺細胞去分化在糖尿病周圍神經病變發(fā)生中的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 （1）動物：5 周SD 大鼠8 只，體重約130 g，購自中山大學實驗動物中心。（2）主要試劑：KROX20 購自Abcam 公司，C?JUN 購自武漢賽維爾生物科技有限公司，p?c?JUN，p38 MAPK，p?p38 MAPK 購 自Cell Signaling Technology 公 司，免 疫 組化試劑盒購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 方法 （1）糖尿病大鼠模型的建立：SPF 級，5周齡雄性SD 大鼠適應性喂養(yǎng)1 周后，隨機分成正常組和糖尿病組，每組4 只。糖尿病組行STZ 65 mg/kg 腹腔注射，1 周后測隨機血糖≥16.7 mmol/L認為造模成功。糖尿病模型建立后第8 周，在用戊巴比妥鈉（45 mg/kg）腹腔注射麻醉滿意后，收取坐骨神經。（2）坐骨神經電鏡觀察：坐骨神經用電鏡固定液固定，1%鋨酸后固定。行環(huán)氧樹脂包埋，用Leica UC7 超薄切皮機制作60-80 nm 的超薄切片，于2%醋酸鈾飽和酒精溶液避光染色，6%枸櫞酸鉛溶液避二氧化碳染色。透射電子顯微鏡HT7800/HT7700 下觀察，采集圖像分析。每個組織選取5?8 個視野，用Image J 軟件進行分析。Gra?tio=軸突直徑/纖維直徑。（3）免疫組化：坐骨神經用4%多聚甲醛固定后，行石蠟包埋，切片后常規(guī)脫蠟，按相關免疫組化試劑盒說明書進行KROX20的標記。用IRS 評分系統(tǒng)進行分析，IRS= P×I，P 為染色陽性率：P=0，陰性；P=1，1%?24% 陽性率；P=2，25%?49%陽性率；P=3，50%?74% 陽性率；and P=4，75%?100% 陽性率。I 為染色強度：I=0，陰性；I=1，弱陽性；I=2，陽性；I=3，強陽性。（4）Western blot 檢測蛋白含量：用放射免疫沉淀法提取坐骨神經組織蛋白，電泳前按4∶1 體積比與上樣緩沖液混合熱變性，約取10 μg 蛋白上樣于10%聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后轉印至PVDF 膜上，封閉1 h，4℃過夜孵育特異性一抗，后與HRP 標記的特異性二抗，室溫孵育1 h，ECL 試劑處理曝光。用Image J 軟件分析條帶光密度。以內參β?actin 計算蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件包處理數據。計量數據以均值±標準差表示，兩組獨立組均值間采用t 檢驗，多組均值間采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 糖尿病大鼠的周圍神經病變髓鞘的病理改變 電鏡結果顯示，糖尿病大鼠坐骨神經的髓鞘出現明顯的病變。圖1A 示糖尿病大鼠神經髓鞘出現明顯的腫脹和松解，可見髓鞘脫失，軸突萎縮變性多見于髓鞘損傷嚴重的纖維。糖尿病大鼠神經髓鞘的G ratio 明顯比正常大鼠大，且在軸突直徑小的神經纖維中更明顯，說明糖尿病大鼠的小纖維更薄，提示髓鞘的再生現象（圖1B）；糖尿病大鼠的神經纖維面積明顯小于正常組大鼠，且髓鞘面積的比值下降（圖1C）。以上結果提示，糖尿病周圍神經病變以髓鞘病變?yōu)橹鳌?/p>

1.2 糖尿病神經病變存在施旺細胞去分化 糖尿病大鼠坐骨神經分化相關蛋白的表達結果顯示，髓鞘蛋白調控因子KROX20 在糖尿病神經明顯下調。同時，施旺細胞重編程的主要調控轉錄因子，p?C?JUN 在糖尿病神經中明顯上調（圖2），提示糖尿病狀態(tài)下，施旺細胞出現去分化。

1.3 糖尿病大鼠坐骨神經相關通路的變化 糖尿病大鼠坐骨神經中β?catenin 明顯上調，wnt 通路的激活；而磷酸化的p38 MAPK 在糖尿病大鼠坐骨神經中明顯下調，詳見圖3。

3 討 論

3.1 糖尿病大鼠周圍神經病變的主要病理改變 本研究結果發(fā)現，糖尿病大鼠周圍神經病變的病理改變主要是髓鞘腫脹、脫失，髓鞘變薄減少及軸突變性，伴有輕度的髓鞘再生，與人體標本的病理改變相符。也驗證了在糖尿病周圍神經病變的過程中，施旺細胞出現了去分化現象。髓鞘病變是神經傳導速度減弱，麻木等臨床癥狀的主要原因之一［5］。在糖尿病患者神經病變癥狀輕微時的神經標本發(fā)現明顯的脫髓鞘，但軸突病變不明顯，也有研究認為1 型糖尿病模型軸突病變更為突出，可能與模型建立的時間及方法不同有關［6］。

圖1 糖尿病周圍神經病變的髓鞘病理改變 A：大鼠坐骨神經髓鞘電鏡圖（標尺=20 μm）；B：神經髓鞘G Ratio 分析；C：大鼠坐骨神經纖維面積及髓鞘面積分析。*P＜0.05，***P＜0.001

圖2 糖尿病狀態(tài)下，施旺細胞發(fā)生去分化 A：Western blot 檢測大鼠坐骨神經中KROX20，C-JUN 及p-C-JUN 的蛋白表達水平。B：免疫組化檢測大鼠坐骨神經中KROX20 的表達（放大倍數：200×）。*P＜0.05，**P＜0.01

圖3 糖尿病大鼠坐骨神經通路改變 Western blot 檢測大鼠坐骨神經β-catenin，p38 MAPK 及其磷酸化蛋白的表達水平。*P＜0.05

3.2 糖尿病周圍神經病變的髓鞘病變與施旺細胞去分化之間的關系 尚不明確。施旺細胞的去分化主要表現在其成髓能力的下調。KROX20 是促進髓鞘形成及維持髓鞘結構的重要轉錄因子［7］，其表達下調提示施旺細胞的成髓能力下降和髓鞘結構的不穩(wěn)定。磷酸化的C?JUN 通過拮抗KROX20 的作用，抑制髓鞘蛋白的生成，誘導施旺細胞的去分化。在神經病變早期，神經脫髓鞘及施旺細胞去分化現象并存，提示施旺細胞去分化與脫髓鞘關系密切［8，9］。在多項脫髓鞘疾病模型研究中發(fā)現，體內外抑制施旺細胞去分化可改善脫髓鞘的發(fā)生［10］。高糖可以直接導致施旺細胞去分化，藥物干預后施旺細胞去分化被逆轉，脫髓鞘現象有所改善［11］，提示施旺細胞去分化可能導致脫髓鞘。此外，神經損傷修復過程中，施旺細胞去分化導致的脫髓鞘屬于正常生理過程［12］，但在糖尿病狀態(tài)下，神經功能修復發(fā)生障礙，施旺細胞異常去分化，可能是糖尿病周圍神經病理性脫髓鞘的原因之一。

3.3 糖尿病周圍神經病變的信號通路變化 本研究結果顯示β?catenin 在糖尿病大鼠坐骨神經中呈激活狀態(tài)，β?catenin 信號通路是神經系統(tǒng)十分重要的通路。β?catenin 信號通路的激活可通過炎癥反應引起脫髓鞘并抑制髓鞘再生［13］。抑制β?catenin信號通路可通過減輕內質網應激及炎癥因子改善糖尿病周圍神經病變［14］。因此，β?catenin 通路的激活可能直接引起糖尿病髓鞘病變。促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）在施旺細胞的去分化中起重要作用，p38 MAPK 是神經系統(tǒng)髓鞘形成的正向調控因子［22］。p38 MAPK 可通過調控KROX20 的表達影響施旺細胞的成髓能力［23］。本研究結果顯示，糖尿病大鼠p?p38 MAPK 及KROX20 表達明顯減少，提示糖尿病狀態(tài)下p38 MAPK 的活性下降引起KROX20 的表達下調而介導施旺細胞的去分化及脫髓鞘。因此，wnt 通路的激活及p38 MAPK 通路的抑制共同作用引起糖尿病周圍神經病變。

綜上所述，本研究通過建立糖尿病大鼠模型，闡述了糖尿病周圍神經病變早期以髓鞘腫脹脫失為主，施旺細胞發(fā)生去分化。其病理機制可能與β?catenin 及p38 MAPK 通路的改變相關，為糖尿病周圍神經病變的機制探討及臨床診治提供新思路。