錢曉濤，張媛媛

肝癌是中國第二大常見癌癥，是致命的癌癥之一。中國每年約有38.3萬人死于肝癌，占全球肝癌死亡人數(shù)的51%，嚴重影響人們的健康甚至危及生命[1]。中醫(yī)藥在肝癌內(nèi)科治療方面有著確切的療效,并且中醫(yī)獨特的理論體系和辨證論治原則可以使治療更加個體化[2]。小柴胡湯由柴胡、黃芩、半夏、生姜、人參、大棗、甘草7味中藥組成。其中柴胡、黃芩泄少陽郁熱；半夏、生姜辛散，可顧護腸胃同時疏散氣郁；人參、大棗益氣扶正；甘草調(diào)中；全方具有和解少陽、調(diào)暢三焦氣機的功效[3]。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學研究方法，篩選小柴胡湯的主要活性成分及作用靶點，進一步根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓撲分析篩選關(guān)鍵靶點，并進行GO富集分析和KEGG通路分析，有助于尋找治療肝癌的新途徑。

1 材料與方法

1.1 有效成分的篩選及靶點預測 檢索中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺[4](TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)，得到柴胡、黃芩、半夏、甘草、人參、生姜、大棗的有效成分及相關(guān)靶點，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(drug likeness，DL)≥0.18為篩選條件。

1.2 靶標蛋白基因名的確定 使用Uniprot數(shù)據(jù)庫[5]中的UniProKB檢索功能(https://www.uniprot.org/)，查詢靶標蛋白對應(yīng)的基因名，并限定物種為“Homo sapiens”，將查詢得到的靶點蛋白信息進行標準化。

1.3 肝癌的靶點篩選 以“l(fā)iver cancer”為關(guān)鍵詞，檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫[6](https://genealacart.genecards.org/)和OMIM數(shù)據(jù)庫[7](https://www.omim.org/)，得到疾病相關(guān)靶點。

1.4 小柴胡湯治療肝癌的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將小柴胡湯和肝癌的靶點上傳至在線作圖工具Venny 2.1，繪制韋恩圖(見圖1)，得到中藥藥對活性成分與疾病的交集靶點，然后利用Cytoscape軟件(V3.7.1)進行網(wǎng)絡(luò)可視化，得到活性成分-交集靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(見圖2)。其中節(jié)點的類型有活性成分、靶點。

1.5 靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點篩選 藥物對疾病治療的效應(yīng)最終表現(xiàn)在蛋白相互作用上。運用韋恩圖(Venn diagram)得到活性成分靶點與肝癌靶點的交集基因，導入STRING11.0(http://www.string-db.org/)，隱藏離散的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點，得到交集靶點的蛋白相互作用關(guān)系。

1.6 GO和KEGG富集分析 將1.4得到的活性成分與疾病的交集靶點利用R語言軟件的Bioconductor生物信息軟件包進行處理，得到GO功能富集分析(圖4A、4B、4C)和KEGG通路富集分析(圖5)，設(shè)定閾值P<0.05為標準進行篩選。

1.7 分子對接驗證 利用分子對接技術(shù)研究小柴胡湯的活性成分及其治療肝癌的相關(guān)靶點，能夠在一定程度上說明活性成分與靶點蛋白的作用機制與結(jié)合活性[8]。從PDB(https://www.rcsb.org/)數(shù)據(jù)庫下載關(guān)鍵靶點AKT1(PDB ID:4GV1)、ALB(PDB ID:1N5U)、JUN(PDB ID:2G01)、MYC(PDB ID:1EE4)、VEGFA(PDB ID:1MKK)、IL6(PDB ID:1N26)的PDB格式，從Pubchem數(shù)據(jù)庫下載關(guān)鍵活性成分槲皮素、山奈酚、漢黃芩素、柚皮素、β-胡蘿卜素、黃芩素sdf格式的3D結(jié)構(gòu)。采用Autodock Tools 1.5.6中的Edit模塊對蛋白進行加氫、計算電荷、添加原子類型等操作，采用Torsion Tree模塊判定配體的root并選擇配體可扭轉(zhuǎn)的鍵，完成后導出pdbqt格式的受體蛋白和小分子，采用Autodock Vina進行分子對接，采用Discovery Studio2020可視化分析對接構(gòu)象。

2 結(jié)果

2.1 活性成分及靶點的篩選 檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫中小柴胡湯所有成分及相關(guān)靶點，對篩選出的靶點添加基因名。根據(jù)OB和DL對小柴胡湯中的活性成分進行篩選，分別得到柴胡活性成分17個、黃芩活性成分36個、半夏活性成分13個、甘草活性成分92個、人參活性成分22個、生姜活性成分5個、大棗活性成分29個。

2.2 肝癌的靶點篩選 以“l(fā)iver cancer”為關(guān)鍵詞，檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫，得到靶點1 004個，檢索OMIM數(shù)據(jù)庫，得到靶點495個，刪除重復靶點后，共得到疾病相關(guān)靶點1 404個。

2.3 小柴胡湯-肝癌靶標的構(gòu)建 利用在線作圖工具Venny 2.1，輸入小柴胡湯活性成分靶點258個和肝癌疾病靶點1 402個，兩者取交集后得到127個交集靶點(見圖1)。

圖1 小柴胡湯與肝癌靶點

2.4 化合物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)包括135個化合物節(jié)點，279個靶點節(jié)點以及1 378條邊構(gòu)成。拓撲結(jié)果顯示，“degree”值較高的成分是槲皮素(quercetin，MOL000098)，山奈酚(kaempferol，MOL000422)，漢黃芩素(wogonin，MOL000173)，柚皮素(naringenin，MOL004328)，β-胡蘿卜素(beta-carotene，MOL002773)，黃芩素(baicalein，MOL002714)等，小柴胡湯主要通過135個活性成分作用于127個靶標基因，這127個靶標基因可能影響肝癌的發(fā)生。

圖2 化合物-活性成分-靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.5 靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)的構(gòu)建 在STRING v11.0數(shù)據(jù)庫構(gòu)建靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)，物種設(shè)為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設(shè)為中等置信度“Medium confidence”為0.4，其余參數(shù)保持默認設(shè)置。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中“degree”值較高的靶點是AKT1、ALB、JUN、MYC、VEGFA、IL6等，提示這些靶點可能是小柴胡湯治療肝癌的關(guān)鍵作用靶點。

2.6 GO功能富集分析 將上述得到的127個交集靶點通過R語言的Bioconductor生物信息軟件包進行GO功能富集分析。GO功能富集分析主要包括生物過程(biological process，BP)(圖4A)，細胞組分(cellular component，CC)(圖4B)和分子功能(molecular function ，MF)(圖4C)三部分。

2.7 KEGG通路富集分析 通過R語言軟件的Bioconductor生物信息軟件包進行KEGG通路富集分析后，富集比較明顯的前20個通路(圖5)包括：PI3K-Akt信號通路、丙型肝炎、乙型肝炎、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、人巨細胞病毒感染、EB病毒感染、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、凋亡、IL-17信號通路、內(nèi)分泌抵抗、腫瘤壞死因子信號通路等。

圖3 小柴胡湯治療肝癌的PPI網(wǎng)絡(luò)

4A 生物過程

4B 細胞組分

4C 分子功能圖4 GO功能富集分析結(jié)果

圖5 KEGG通路富集分析氣泡圖

2.8 核心成分的分子對接驗證 一般認為結(jié)合能越低，配體與受體結(jié)合越穩(wěn)定，≤-5.0 kcal/mol說明兩者可以結(jié)合，≤-7.0 kcal/mol說明兩者有較好的結(jié)合能力[9]。分子對接結(jié)果顯示，槲皮素、山奈酚、漢黃芩素、柚皮素、β-胡蘿卜素、黃芩素與AKT1、ALB、JUN、MYC、VEGFA、IL6有較好的結(jié)合能力。

2.9 分子對接結(jié)合模式分析 a、b環(huán)均與Asp292、Glu191形成π-陰離子作用；c環(huán)與Leu295形成π-sigma作用，其酚羥基與Lys276、Asp274形成氫鍵作用, 見圖6-1(B)2D作用圖和圖6-1(C)3D作用圖。a環(huán)與Val164形成π-sigma作用；c環(huán)與Val164、Ala177、Ala230形成疏水作用，與Met281形成硫-π作用, 見圖6-2(B)2D作用圖和圖6-2(C)3D作用圖。a環(huán)與Tyr138、Tyr161形成π-π堆積作用；b環(huán)與Tyr138形成酰胺-π堆積作用，與Tyr161形成π-π堆積作用，與Ile142形成疏水作用，其羥基與Leu135形成氫鍵作用；c環(huán)與Tyr161、Phe157形成π-π堆積作用，與Ile142形成疏水作用, 見圖6-3(B)2D作用圖和圖6-3(C)3D作用圖。a環(huán)與Val158、Ile32形成疏水作用，與Met111、Asn114形成氫鍵作用；b環(huán)與Val158、Ile32、Ala53、Val40形成疏水作用，其羰基與Met111、Leu110形成氫鍵作用；c環(huán)與Met108形成硫-π作用，與Val40、Lys55形成疏水作用，見圖6-4(B)2D作用圖和圖6-4(C)3D作用圖。a、b環(huán)均與Trp195形成π-π間環(huán)堆積效應(yīng)；b環(huán)羥基與Ser230形成氫鍵作用；c環(huán)與Glu191形成π-陰離子作用，其酚羥基與Glu192形成氫鍵作用，見圖6-5(B)2D作用圖和圖6-5(C)3D作用圖。a環(huán)與Leu149形成疏水作用；b、c環(huán)均與Glu191形成π-陰離子作用；c環(huán)酚羥基與Ser230形成氫鍵作用，見圖6-6(B)2D作用圖和圖6-6(C)3D作用圖。a環(huán)與Met94形成硫-π作用，與Arg82形成π-陽離子作用，與Gly92形成氫鍵作用；b環(huán)與Met94形成疏水作用，與Glu42形成π-陰離子作用；c環(huán)與Met94形成疏水作用，與Ser95、Tyr39形成氫鍵作用，見圖6-7(B)2D作用圖和圖6-7(C)3D作用圖。a環(huán)與Pro121、Pro117、Pro95形成疏水作用，與Thr120形成酰胺-π堆積作用，與Glu96形成氫鍵作用；b環(huán)與Val93形成π-sigma作用；c環(huán)與Val93形成疏水作用, 見圖6-8(B)2D作用圖和圖6-8(C)3D作用圖。

圖6-1 槲皮素與AKT1相互作用圖

圖6-2 柚皮素與AKT1相互作用圖

圖6-3 山奈酚與ALB相互作用圖

圖6-4 漢黃芩素與JUN相互作用圖

圖6-6 黃芩素與MYC相互作用圖

圖6-7 槲皮素與VEGFA相互作用圖

圖6-8 漢黃芩素與IL6相互作用圖

3 討論

本資料通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，構(gòu)建方中活性成分與肝癌交集靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，推測槲皮素、山奈酚、漢黃芩素、柚皮素、β-胡蘿卜素、黃芩素等可能是本方發(fā)揮作用的重要成分。分子對接提示，核心成分與肝癌關(guān)鍵靶點AKT1、ALB、JUN、MYC、VEGFA、IL-6之間均表現(xiàn)出了良好的對接活性。

槲皮素抑制了肝癌細胞的遷移和侵襲能力，使肝癌細胞惡性程度降低，防止了肝癌細胞的轉(zhuǎn)移和擴散[10]。山奈酚可以明顯抑制人肝癌細胞的生長，經(jīng)山奈酚處理的人肝癌Huh7細胞,細胞凋亡特征明顯,且隨著作用時間的延長, 細胞凋亡率逐步增高[11]。馮永波等[12]發(fā)現(xiàn)漢黃芩素可抑制人肝癌HepG2細胞的增殖, 具有明顯的抗腫瘤效果。通過Western Blot法檢測了漢黃芩素作用前后人肝癌SMMC-7721細胞中Pro-caspase-9和Pro-caspase-8表達水平的變化,漢黃芩素對肝癌細胞的作用機制是通過線粒體信號通路實現(xiàn)的[13]。柚皮素是食物中常見的類黃酮物質(zhì)，研究[14]發(fā)現(xiàn)柚皮素可以抑制多種腫瘤細胞的生長，并且對正常細胞無明顯細胞毒作用。流行病學研究[15]表明，在膳食中補充富含β-胡蘿卜素或類胡蘿卜素果蔬，可以使各種惡性腫瘤的發(fā)生率較低。黃芩素能下調(diào)肝癌干細胞中誘捕受體3的表達，進而影響肝癌干細胞的生長、細胞周期、細胞凋亡和細胞遷移這一系列生物學行為[16]。

研究[17]表明，AKT1基因rs1130214位點基因多態(tài)性可能與原發(fā)性肝癌的發(fā)生有關(guān),突變基因型(GT+TT)可能是原發(fā)性肝癌的易感基因。肝細胞癌患者常伴有肝臟功能異常以及伴隨的患者整體的營養(yǎng)消耗[18]。張穎超等[19]研究結(jié)果顯示, c-fos和c-jun在正常肝組織中只有低水平表達或不表達, 而在癌旁異型增生肝組織中均有表達,提示c-fos和c-jun的異常表達可能與HCC的發(fā)生密切相關(guān)，而使c-fos和c-jun滅活或下調(diào)其表達水平可能成為預防和治療HCC的一種新方法。謝斐[20]首次發(fā)現(xiàn)miR-320a在肝癌組織和肝癌細胞系中可以抑制靶基因c-Myc的表達，并發(fā)現(xiàn)通過抑制c-Myc可以抑制肝癌細胞增殖能力和侵襲能力。在肝癌細胞系BEL-7402 中，miR-195 能夠打靶腫瘤血管生成相關(guān)蛋白 FGF2和VEGFA[21]。血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)，是最重要的促血管生成介質(zhì)之一，直接作用于內(nèi)皮細胞，并激活 PI3K、ERK 及 AKT 等信號傳導通路，與肝臟惡性腫瘤的發(fā)生及預后有著密切的關(guān)系[22]。冀彤[23]發(fā)現(xiàn)IL-6通過調(diào)控NK細胞介導的腫瘤免疫監(jiān)視抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展。杜忠良等[24]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素抑制腫瘤生長，誘導腫瘤細胞凋亡和VEGF的表達可能與PI3K/AKT通路被抑制相關(guān)。

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與細胞應(yīng)答各種應(yīng)激的不同反應(yīng)密切相關(guān)。長期性的病毒感染、負面精神情緒、不良生活行為等形成的慢性應(yīng)激,往往促進腫瘤的發(fā)生[25]。在癌癥中，氧化應(yīng)激水平通常會增加，肝癌細胞的高增殖能力和持續(xù)性炎癥，都與氧化應(yīng)激有關(guān)。氧化應(yīng)激一方面直接在DNA上形成8-oxo G或脂質(zhì)過氧化引起畸變，另一方面通過表觀遺傳機制促進肝癌發(fā)生[26]。研究[27]表明在營養(yǎng)成分如葡萄糖缺乏的條件下，肝癌細胞從糖酵解途徑產(chǎn)生的ATP減少，為了維持ATP的穩(wěn)態(tài)，肝癌細胞通過動員甘油三酯，經(jīng)過脂肪分解產(chǎn)生ATP滿足自身需要，從而抵抗應(yīng)激反應(yīng)。

研究[28]證實，PI3K-Akt信號通路可以抑制肝癌細胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。流行病學研究[29]表明，乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染、黃曲霉素、飲水污染、酒精、肝硬化、亞硝胺類物質(zhì)、微量元素等都與肝癌發(fā)病相關(guān)。乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)是引起肝細胞癌(HCC)的主要原因。在世界上HCC發(fā)病率最高的國家如中國、韓國等，發(fā)現(xiàn)HBV和HCV陽性的比例均很高[30]。

由于網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接方法尚存在一定的局限性，本資料旨在為后期進一步探討小柴胡湯治療肝癌的機制奠定理論基礎(chǔ)。