黃子林 孔祥珍 張麗娜 華欲飛

(江南大學食品學院，無錫 214122)

蛋白質(zhì)是由不同的氨基酸組成的高度復雜的復合物，其廣泛存在于奶類、肉類、蛋類和油料種子中。多酚則以天然抗炎、抗病毒、抗氧化活性物質(zhì)著稱[1]。多酚與蛋白的相互作用近年來已經(jīng)逐漸稱為新的研究熱點，這些研究根據(jù)多酚來源的不同主要可以分兩種：一種是研究食品體系中天然存在的多酚與蛋白質(zhì)的相互作用，例如大豆、核桃、葵花籽等油料作物榨油后的殘渣中多酚與蛋白之間的相互作用[2-4]，通過研究粕中脫酚與未脫酚蛋白的性質(zhì)和營養(yǎng)價值的不同來探究二者的相互作用；另一種通過外加多酚，探究多酚與蛋白質(zhì)的相互作用及對二者各自性質(zhì)的影響，根據(jù)其性質(zhì)的改變以探究其應用潛力[5,6]。例如通過二者相互作用可以改善多酚穩(wěn)定性，故可將蛋白質(zhì)作為穩(wěn)定多酚的載體[7-9]；通過其相互作用可提高蛋白質(zhì)產(chǎn)品的抗氧化性，故將二者復合物作為易氧化食品的包裝材料[10]；也有研究發(fā)現(xiàn)二者的相互作用能夠改善蛋白質(zhì)的乳化性質(zhì)，從而將其用于制備乳液飲料等[11]。

廣泛的應用方向為蛋白質(zhì)與多酚相互作用的研究提供了不竭的動力。為了研究蛋白質(zhì)與多酚的相互作用對各自結構、功能和營養(yǎng)性質(zhì)的影響，首先需要了解二者相互作用的可能機理及其分析方法。蛋白質(zhì)與多酚的相互作用可以分為共價作用和非共價作用，其中非共價作用可逆，其作用力主要包括疏水相互作用、氫鍵、靜電相互作用和范德華力等。共價作用主要是源于多酚的氧化和親核加成過程，其作用力是共價鍵且反應不可逆。但多數(shù)情況下，共價和非共價作用可能同時發(fā)生，例如綠原酸與蛋白質(zhì)的結合[12]。本文主要從多酚與蛋白質(zhì)的相互作用機理、分析方法、影響因素和對蛋白與多酚的影響幾個方面進行綜述。

1 蛋白質(zhì)與多酚的相互作用機理

1.1 非共價相互作用機理

蛋白質(zhì)與多酚非共價作用包括疏水相互作用、氫鍵、范德華力、靜電相互作用等，如圖1所示。其中疏水相互作用被認為是蛋白質(zhì)與多酚非共價相互作用最主要的驅(qū)動力，氫鍵次之。疏水相互作用主要表現(xiàn)在蛋白質(zhì)脂肪族、芳香族氨基酸與多酚的苯環(huán)之間。Wei等[13]研究了花色苷與β-酪蛋白的非共價相互作用機理發(fā)現(xiàn)其主要由疏水相互作用驅(qū)動。氫鍵則主要通過多酚化合物中氫原子與蛋白質(zhì)中N、O或S原子等電負性原子的相互作用形成。Wang等[14]研究了富含多酚物質(zhì)的烏飯樹葉色素與大米蛋白的相互作用，發(fā)現(xiàn)其作用力主要包括疏水相互作用和氫鍵。

圖1 多酚與蛋白質(zhì)非共價作用機制[17]

有假說提出蛋白質(zhì)與多酚的非共價作用可以分為三個階段：第一階段，形成小的蛋白質(zhì)-酚類復合物，多酚物質(zhì)可以結合到蛋白質(zhì)分子疏水性基團等多個作用位點上，使得蛋白質(zhì)結構從隨機卷曲轉(zhuǎn)變?yōu)榕c酚類化合物結合更緊密的結構，疏水相互作用被認為是第一階段的主要作用力；第二階段，由蛋白質(zhì)-酚類復合物通過交聯(lián)自結合形成小聚集體，導致復合聚集體的形成，氫鍵起到穩(wěn)定和加強復合物的作用；第三階段，大尺寸復合物由于聚結而沉淀。此外，各階段主要驅(qū)動力還取決于蛋白質(zhì)的結構、酚類化合物結構、濃度和化學性質(zhì)[15]。

雖然非共價相互作用很弱，一般比通常共價鍵能小1～2 個數(shù)量級，但這些分子間弱相互作用力可在一定條件下起協(xié)同作用，形成具有一定方向性和選擇性的強作用力[16]。例如啤酒、葡萄酒、茶飲料等在銷售期間容易形成渾濁，其最常見、最重要的原因之一就是蛋白質(zhì)與多酚的非共價相互作用。

1.2 共價相互作用的機理

酚類化合物具有較高的反應活性，容易被氧化成相應的醌，它們能與親核試劑發(fā)生共價反應，例如蛋白質(zhì)的游離氨基、賴氨酸、半胱氨酸和色氨酸等。

圖2為鄰醌與氨基或巰基的親核加成示意圖，反應后酚環(huán)與蛋白質(zhì)上的氨基或巰基反應形成共價的C—N鍵或C—S鍵，鄰醌被還原成酚類。故該加成產(chǎn)物可以再次被氧化成醌類，進一步形成二聚體或繼續(xù)被還原，如圖3所示。鄰醌類物質(zhì)由于其親電性，易在后續(xù)反應中形成二聚體或多聚體，導致形成蛋白質(zhì)聚合物。關于鄰醌與蛋白質(zhì)形成共價鍵的作用位點說法不一，圖2、圖3中分別示意蛋白質(zhì)在酚羥基間位和鄰位取代形成共價鍵，但Tran等[1]則示意蛋白質(zhì)會取代苯環(huán)上的一個酚羥基從而使二者共價交聯(lián)。推測蛋白質(zhì)與多酚的種類不同會導致其共價交聯(lián)作用位點出現(xiàn)變化。

圖2 鄰醌與氨基、巰基的1，4-親核加成反應示意圖[17]

圖3 堿處理形成蛋白質(zhì)-多酚偶聯(lián)物的機理[18]

2 研究蛋白質(zhì)與多酚相互作用的分析方法

由于蛋白質(zhì)-多酚的相互作用較為復雜，沒有單一的技術能提供全面的信息，一般通過多種技術進行表征。這些技術包括熒光色譜、圓二色光譜、傅里葉變換紅外光譜、等溫滴定量熱法、差示掃描量熱法、核磁共振光譜等。本文對部分分析方法進行簡單闡述。

2.1 熒光光譜法

熒光光譜法又稱熒光猝滅法，是研究多酚與蛋白質(zhì)間相互作用的重要手段。熒光猝滅法又分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。此方法可以測得多酚與蛋白質(zhì)的結合點數(shù)和結合常數(shù)，分析多酚與蛋白質(zhì)間作用力類型，還可計算結合距離和能量轉(zhuǎn)移效率。Zou等[19]用熒光光譜法表征葡萄籽原花青素(GSP)與大豆分離蛋白(SPI)的相互作用，發(fā)現(xiàn)隨著GSP濃度的增加，GSP對SPI的熒光猝滅作用更加明顯且主要是靜態(tài)猝滅，即證明了二者確實形成了復合物。Ren等[20]的研究表明，相比β-伴大豆球蛋白，與氰基-3-O-葡萄糖苷(C3G)結合能力更強的大豆球蛋白在熒光猝滅中有更大的結合常數(shù)。

熒光猝滅法能得到較可靠的表征參數(shù)，但其也有對環(huán)境敏感，易受干擾，無法確定多酚與蛋白質(zhì)相互作用的結合位點等缺點。

2.2 圓二色譜法(CD)

蛋白質(zhì)的遠、近紫外圓二色譜可分別用于觀測蛋白質(zhì)的二、三級結構變化，也常被用于表征多酚與蛋白質(zhì)相互作用。如Al-Hanish等[21]通過圓二色譜發(fā)現(xiàn)EGCG與牛α-乳蛋白相互作用誘導了α-螺旋向β-結構的轉(zhuǎn)變；相反，Ren等[22]則通過圓二色譜發(fā)現(xiàn)大豆蛋白與C3G結合會誘導大豆蛋白的β-折疊結構轉(zhuǎn)變?yōu)棣?螺旋和無規(guī)卷曲?？梢园l(fā)現(xiàn)，不同的蛋白質(zhì)與多酚相互作用導致其二級結構的變化也不盡相同。

2.3 等溫滴定量熱法(ITC)

等溫滴定量熱法主要用于檢測多酚與蛋白質(zhì)相互作用過程中的熱力學變化，可得到如親和力、熵、焓、比熱容以及化學計量學的信息，因此可以直接和定量測量多酚與蛋白質(zhì)之間的相互作用及其對多酚或蛋白質(zhì)結構的影響。例如C3G與SPI的相互作用結合常數(shù)Ka較大，熵值為負值，焓值相對較低，即可分別說明二者相互作用親和力較高，反應為焓驅(qū)動且作用力為非共價作用[20]。

等溫滴定量熱法靈敏度高、重復性好，可一次性測定多個結合參數(shù)，受沉淀影響小，但也有加熱效應弱、測試耗時等缺點。

2.4 核磁共振光譜法(NMR)

核磁共振光譜法通過檢測分子結構中標記的碳元素的化學位移，來表明多酚與蛋白質(zhì)是否發(fā)生結合作用或構象的改變。多酚-蛋白質(zhì)相互作用的所有結合位點都與特定NMR峰相關。Faurie等[23]采用NMR成功表征了糖通過螯合部分多酚，降低其與唾液蛋白結合的有效濃度，間接起到抑制澀味的過程。Lucarini等[24]也通過此技術發(fā)現(xiàn)兒茶素與膠原蛋白的結合位點在兒茶素B環(huán)與膠原蛋白的脯氨酸(Pro)或羥脯氨酸(Hyp)之間。

NMR可精確識別結合位點信息，解釋相互作用機理，但也存在需樣量大、對樣品濃度和穩(wěn)定性要求較高、圖譜解析復雜等問題。

3 蛋白質(zhì)與多酚相互作用的影響因素

3.1 溫度

在蛋白質(zhì)與多酚的體系中，溫度主要會影響氫鍵和疏水相互作用。當溫度升高時，氫鍵作用力減弱甚至消失，疏水相互作用力增強。大部分研究報道指出，蛋白質(zhì)對多酚的親和力隨溫度升高而降低[12]。Kaspchak等[25]研究指出，溫度升高不利于BSA與單寧酸的相互作用，并解釋可能是溫度升高使蛋白質(zhì)空間結構改變所致。

溫度持續(xù)升高會還導致蛋白質(zhì)與多酚的作用形式發(fā)生改變，如Condict在[26]超高溫至140 ℃瞬時條件下研究了β-酪蛋白與阿魏酸之間的溫度誘導相互作用，發(fā)現(xiàn)阿魏酸在熱處理后與蛋白質(zhì)共價結合。即溫度過高會誘導蛋白質(zhì)與多酚之間共價鍵的產(chǎn)生。此外，溫度也會影響多酚的穩(wěn)定性，例如，紅酒和葡萄皮中的花青素在溫度升高時會發(fā)生降解[27]。

3.2 pH

pH對蛋白質(zhì)和多酚相互作用的影響較為復雜，其不僅能影響多酚與蛋白質(zhì)的結合程度；還能通過影響多酚在溶液中的化學結構進而影響相互作用力的種類，例如使多酚在堿性pH下產(chǎn)生自由基和醌式結構。

在酸性條件下，多酚與蛋白質(zhì)之間的相互作用主要為非共價相互作用。這種作用在稍低于蛋白質(zhì)等電點時的pH環(huán)境中最強，因為此時蛋白質(zhì)與多酚的靜電排斥力最弱[1]。在堿性條件下，多酚易被氧化，從而與蛋白質(zhì)生成共價鍵，且共價結合程度隨 pH的增加而加強。

pH的影響效果在具體反應中也有所差異，如Rawel等[12]發(fā)現(xiàn)在非堿性pH范圍內(nèi)，當pH升高時，BSA與槲皮黃酮和沒食子酸的結合常數(shù)增加，而BSA與阿魏酸、綠原酸的結合常數(shù)減小，結合量增大。

pH還可以在一定程度上決定蛋白與多酚結合的影響因素，例如Engstrom等[28]研究了BSA與7種水解單寧或表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)的相互作用。當pH為7.6時，單寧的氧化性是影響單寧-牛血清白蛋白絡合物形成的主要因素。然而，在稍低的pH即6.7左右，其他單寧特征，如單寧的大小和彈性，決定了高度穩(wěn)定的單寧-蛋白質(zhì)復合物的形成。

3.3 多酚化合物種類和結構

多酚化合物自身的分子大小、形狀和所帶沒食子酰基基團和羥基數(shù)量都會影響其與蛋白質(zhì)的反應。Dobreva等[29]研究了不同分子量和分子形狀的鞣花單寧與BSA的相互作用，結果發(fā)現(xiàn)，鞣花單寧的分子柔性越高、自由沒食子?；蕉鄷r，其與BSA的結合常數(shù)越大，結合位點越多。相似的，Liu等[9]發(fā)現(xiàn)玉米醇溶蛋白與EGCG和槲皮素的相互作用比與綠原酸強。EGCG和槲皮素的酚羥基數(shù)量多于綠原酸可能是這種現(xiàn)象發(fā)生的原因。

即使是結構上微小的差異也會導致酚類與蛋白質(zhì)相互作用發(fā)生改變[30]，例如Rezende等[31]研究人血清白蛋白(HSA)與白藜蘆醇(RES)及其類似物RESAn1結合的熱力學和動力學。結果表明RES和RESAn1的結構上的微小差異顯著影響了與HSA形成復合物的熱力學和動力學。

此外，酚類物質(zhì)羥基的位置和甲基化也會導致其與蛋白質(zhì)結合親和力的改變，例如Wu等[32]用71種酚酸及其衍生物來研究其與β-乳球蛋白結合的親和性關系，研究發(fā)現(xiàn)在3位上的羥基化增加了酚酸對β-乳球蛋白的親和力，而在2位或4位上的羥基化產(chǎn)生了負面影響。用2位甲基取代羥基對結合也具有積極作用。

3.4 蛋白質(zhì)結構和性質(zhì)

蛋白質(zhì)與多酚間的相互作用也受蛋白質(zhì)分子量、疏水性、等電點和氨基酸組成等因素影響。未折疊蛋白質(zhì)比致密和球形蛋白質(zhì)對多酚有更強的親和力[33,34]。Girard等[35]用縮合單寧(PA)與不同分子量的面筋蛋白反應發(fā)現(xiàn)PA優(yōu)先結合更大的蛋白質(zhì)組分。這進一步表明了多酚更傾向于與分子量大的蛋白組分反應。

此外，蛋白質(zhì)表面的脯氨酸含量也決定了蛋白質(zhì)和多酚之間的結合能力。富含脯氨酸的蛋白質(zhì)通常分子柔性好，例如明膠的特殊結構大大增加了肽鍵與多酚形成氫鍵的幾率[36]。Chanphai等[37]的研究成果也證明了這一點，即三種蛋白質(zhì)對多酚的親和力順序為β-酪蛋白>α-酪蛋白>β-乳球蛋白，其中β-酪蛋白脯氨酸含量最高。

3.5 其他因素

溶劑中鹽濃度、超聲輻射、高壓條件等因素也可以影響多酚與蛋白的相互作用。例如Kaspchak等[38]研究發(fā)現(xiàn)離子強度會影響B(tài)SA與單寧酸的相互作用，即高離子強度可使單寧酸與牛血清白蛋白之間的親和力更大。研究發(fā)現(xiàn)二價陽離子可以增加蛋白質(zhì)與單寧結合的親和力，影響蛋白質(zhì)與單寧結合的焓和熵的變化[39]。

其他方面，Chen等[40]研究發(fā)現(xiàn)高靜水壓(HHP)可以通過改變大豆蛋白的二級結構來影響其與茶多酚的相互作用。在HHP處理下，茶多酚使蛋白質(zhì)溶解度提高，乳化活性提高近3倍，最高可達43.5%。Zhang等[41]研究發(fā)現(xiàn)，超聲處理可以有規(guī)律地影響EGCG與BSA的相互作用，并能誘導BSA的構象變化。

4 多酚與蛋白質(zhì)相互作用對其性質(zhì)的影響

4.1 對加工性質(zhì)的影響

蛋白質(zhì)與多酚的相互作用會引起蛋白質(zhì)結構的改變，包括其親-疏水性，熱穩(wěn)定性和溶解度等，從而進一步影響蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，包括其乳化性、起泡性等。同時，蛋白質(zhì)-多酚結合物的功能性質(zhì)受蛋白質(zhì)類型、多酚類型和它們發(fā)生相互作用的環(huán)境的影響很大。

多酚和蛋白質(zhì)之間的反應既可能促進蛋白質(zhì)溶解[7]，也可能降低它們的水溶性[10]。例如Jiang等[42]研究乳清分離蛋白和酪蛋白與綠原酸在pH 7.0的室溫下的非共價相互作用，發(fā)現(xiàn)其蛋白質(zhì)-多酚復合物的溶解性相比原蛋白得到了提高，這一發(fā)現(xiàn)可以使綠原酸應用于乳制品中，從而改善其中蛋白質(zhì)的溶解性和起泡性，提高產(chǎn)品的氧化穩(wěn)定性。當非極性多酚與蛋白質(zhì)發(fā)生非共價相互作用時，結果則可能相反，例如縮合單寧與絲素蛋白在中性條件下形成非共價相互作用會顯著導致其溶解度顯著降低[10]。但由于其抗溶性提高，也增加了其在生物醫(yī)藥、食品包裝和其他領域的應用價值。共價作用方面，在pH≥8.0時，溶菌酶在綠原酸存在下的溶解度下降，是由于綠原酸堿性條件下氧化形成醌[43]。故蛋白質(zhì)與多酚相互作用一般會使溶解度降低，但影響也存在一定差異性。另一方面，蛋白質(zhì)與多酚的相互作用形成復合物，也有助于提高多酚的溶解性和穩(wěn)定性。Xu等[30]研究指出β-LG與蒽酮類物質(zhì)的絡合可顯著提高蒽醌類化合物的水溶性。類似地，Liu等[44]研究發(fā)現(xiàn)卵清蛋白作為載體能顯著提高姜黃素的水溶性和光穩(wěn)定性，姜黃素的溶解度比游離姜黃素提高了370倍，光穩(wěn)定性也顯著提高。

乳化性質(zhì)方面則表現(xiàn)為極性多酚與蛋白質(zhì)反應常常能夠改善原蛋白質(zhì)的乳化性質(zhì)，如Sui等[45]研究花青素與SPI的相互作用發(fā)現(xiàn)二者傾向于發(fā)生共價結合。與花青素絡合后，SPI的乳化和發(fā)泡性能得到改善，這一發(fā)現(xiàn)為花青素在豆奶飲品中的添加應用提供了理論基礎。Karefyllakis等[11]也發(fā)現(xiàn)綠原酸和向日葵分離蛋白(SFPI)形成復合物對SFPI界面和乳化性質(zhì)有利，這種作用除了使乳化性質(zhì)增強外，還能在油水界面處增強其抗氧化能力，故復合物有作為胃腸道中的載體系統(tǒng)的潛力。

相互作用也會導致產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性發(fā)生變化，例如Yan等[46]研究發(fā)現(xiàn)鞣花酸可以改善了卵清蛋白的熱穩(wěn)定性。此外，EGCG與SPI結合得到的共價復合物有更高的熱穩(wěn)定性，即熱變性溫度提高[47]。可以看出，蛋白質(zhì)與多酚相互作用是一種潛在的提高蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的方法。

4.2 對營養(yǎng)價值的影響

蛋白與多酚的相互作用也會影響蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值和消化率，且產(chǎn)生的主要是不利影響。這主要是由于相互作用對必需氨基酸的破壞和酚類成分對消化酶活性的抑制。Zhou等[47]研究EGCG與SPI的相互作用發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生共價復合物的相應抗消化能力更強，因此在腸道消化率降低。另一方面，Sun等[48]研究多種多酚對豬胰腺α-淀粉酶(PPA)的體外活性抑制作用發(fā)現(xiàn)單寧酸、綠原酸和咖啡酸對PPA的抑制作用較強。證實了多酚類物質(zhì)對消化酶活性的抑制能力。Rawel等[12]通過研究類黃酮、黃酮、芹菜素、山奈酚、槲皮素和楊梅素與大豆蛋白的相互作用會導致大豆蛋白中的賴氨酸、半胱氨酸和色氨酸殘基的減少。由此看出多酚與蛋白質(zhì)相互作用可影響必需氨基酸的生物利用率從而改變蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值。

除此之外，蛋白與多酚的相互作用也能在一定條件下起到有益作用，如Wu等[49]通過將β-LG與EGCG和綠原酸共價結合成功降低了β-LG的致敏性。

4.3 對抗氧化活性的影響

抗氧化活性也是蛋白質(zhì)多酚復合物的重要性質(zhì)之一。大量研究表明，不論形成共價或非共價復合物，其抗氧化活性都顯著高于對照蛋白。Jiang等[42]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度綠原酸和兩種蛋白質(zhì)在中性條件下形成的非共價復合物均表現(xiàn)出相較于對照蛋白更強的清除自由基活性。Zhou等[47]則用SPI與EGCG堿性條件下共價結合，生成的復合物抗氧化活性更高。同樣的，Ma等[10]的研究也有相似的結論，絲素蛋白-單寧復合膜展現(xiàn)出了絲素蛋白本身不存在的抗氧化活性，且其活性與單寧濃度呈正相關。蛋白質(zhì)與多酚復合物的抗氧化活性由于多酚中的羥基引入蛋白質(zhì)中而增加。Wu等[32]研究酚酸與β-乳球蛋白相互作用發(fā)現(xiàn)酚酸-β-乳球蛋白復合物的抗氧化活性高于單獨的酚酸，推測是β-乳球蛋白與酚酸的抗氧化活性產(chǎn)生的協(xié)同作用。因此，蛋白質(zhì)多酚復合物可以用來增強抗氧化性能，改善食品的氧化穩(wěn)定性。

5 結論與展望

蛋白質(zhì)和多酚都有其獨特的功能特性和營養(yǎng)價值。蛋白質(zhì)除了作為營養(yǎng)物質(zhì)外還擁有乳化性和起泡性等加工特性；多酚具有生物活性，與蛋白質(zhì)有較高親和度的同時還對人體健康有利。蛋白質(zhì)與多酚的相互作用受到環(huán)境條件以及蛋白質(zhì)和多酚的類型或結構的影響，并且會引起其加工性質(zhì)、營養(yǎng)價值、抗氧化活性等方面的變化。蛋白質(zhì)與多酚的相互作用能夠拓寬蛋白和多酚的應用領域，賦予其新的價值，并可能進一步影響其所在食品體系，如增強食品的抗氧化活性、改善乳化性、改變營養(yǎng)價值等。因此，可通過研究來自不同食物來源的蛋白質(zhì)和多酚的結合，以開發(fā)具有更好的營養(yǎng)、功能、感官質(zhì)量以及生物活性的新食物成分或產(chǎn)品。