彭小飛，張 涵，廖家李，麥孜悅，曾 健

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸腺體外科，廣西 南寧 530021）

乳腺癌（breast cancer）是全球女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因，血管生成在乳腺癌的發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用[1]。多項研究表明[2，3]，血管生成因子（如血管內(nèi)皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β 等）水平以及其形成的微血管密度是乳腺癌存活率的重要預(yù)測因素。研究表明，脂聯(lián)素與血管生成有關(guān)的差異表達(dá)基因密切相關(guān)，其由244 個氨基酸組成的3 kDa 蛋白，由脂肪細(xì)胞產(chǎn)生和分泌，是脂肪組織中分泌最多的蛋白類激素[4]，其受體在正常和惡性乳腺組織中均有表達(dá)[5]，具有抗炎和抗動脈粥樣硬化的特性，可以抑制細(xì)胞增殖，降低胰島素抵抗，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[6-8]。本研究主要探討脂聯(lián)素在乳腺癌組織中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 乳腺癌血管生成相關(guān)因子的篩選 基于癌癥基因組圖譜（TCGA）中的乳腺癌數(shù)據(jù)，結(jié)合AmiGO2 衍生的血管生成基因集，篩選出與乳腺癌血管生成有關(guān)的因子脂聯(lián)素。利用GEPIA2 數(shù)據(jù)庫（http：//gepia.cancer-pku.cn/）對癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，確定脂聯(lián)素在正常組織及癌組織表達(dá)差異，并對其進(jìn)行生存曲線分析。

1.2 一般資料 收集2019 年11 月～2020 年8 月廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院手術(shù)切除且病理檢查確診為乳腺癌的癌組織及癌旁組織80 例，所有病例術(shù)前均未行放、化療等治療。收集患者的臨床資料數(shù)據(jù)，包括年齡、月經(jīng)史、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級、ER、PR、HER2、Ki-67、臨床分期。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者或家屬均簽署知情同意書。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色 制作石蠟包埋的組織標(biāo)本，切片（厚4～5 μm），免疫組織化學(xué)采用S-P 法，一抗為兔抗人VEGF 單克隆抗體（福建邁新生物工程公司），工作濃度1∶20，S-P 免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），實(shí)驗步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。光學(xué)顯微鏡下觀察，胞質(zhì)或胞膜中呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色信號，每例切片隨機(jī)觀察10 個高倍視野。按腫瘤細(xì)胞著色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞率分別評分，其中細(xì)胞著色強(qiáng)度：無著色為0 分、淺黃色為1 分、棕黃色為2 分、棕褐色為3 分；陽性細(xì)胞率：無陽性細(xì)胞為0 分、陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為1 分、11%～50%為2 分、51%～75%為3 分、＞75%為4 分。上述兩者積分相乘為最后結(jié)果：0～2 分為－、3～5 分為+、6～8 分為++、9～12 分為+++。

1.3.2 qRT-PCR 法檢測 提取癌和癌旁組織中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共循環(huán)40 次。用2-△△CT法計算目的基因相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料以（）表示，兩組均數(shù)間比較采用t檢驗，組間比較采用方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)庫信息結(jié)果分析 利用GEPIA2 軟件（http：//gepia.cancer-pku.cn/）對腫瘤基因組圖譜項目數(shù)據(jù)庫中乳腺癌組織標(biāo)本和乳腺正常組織的mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,結(jié)果顯示脂聯(lián)素在乳腺正常組織中高表達(dá)（logFC＞1，P＜0.05），脂聯(lián)素表達(dá)高低對乳腺癌預(yù)后有影響，見圖1。

2.2 脂聯(lián)素在乳腺癌組織和正常組織中的表達(dá) 乳腺癌組織中脂聯(lián)素陽性表達(dá)率為65.00%（52/80），低于癌旁組織中的陽性率91.25%（73/80），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=7.864，P＜0.05）。

2.3 脂聯(lián)素mRNA 在乳腺癌組織和正常組織中的表達(dá)水平 乳腺癌組織中脂聯(lián)素mRNA 相對表達(dá)量為（0.683±0.317），高于癌旁組織中的（0.493±0.294），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.105，P＜0.05）。

2.4 脂聯(lián)素表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系不同年齡、月經(jīng)史、ER、PR、HER2、Ki-67 表達(dá)間脂聯(lián)素表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；不同腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級、臨床分期間脂聯(lián)素表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

圖1 脂聯(lián)素在乳腺癌組織和正常組織中的表達(dá)

表1 脂聯(lián)素表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系（n）

3 討論

血管生成因子可以促使內(nèi)皮細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞遷移，經(jīng)過增殖，最終管道化并分支形成血管環(huán)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的血管生成，導(dǎo)致乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。血管生成因子水平與乳腺癌的分期、分級和臨床預(yù)后密切相關(guān)，在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展中具有重要的作用[9,10]。除此之外，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）作為最重要的血管生成因子，其過度表達(dá)與人類的多種腫瘤（乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等）的發(fā)生密切相關(guān)[11,12]。有報道稱[13]，脂聯(lián)素可能通過促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞自噬小體的活性和降低隔離體1/GAP 相關(guān)的酪氨酸磷酸化蛋白p62 信號通路來抑制癌細(xì)胞的生長。此外，脂聯(lián)素通過調(diào)節(jié)LKB1-AMPK-SK6 軸抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，并刺激AMPK 磷酸化，導(dǎo)致mTOR 活性降低，表現(xiàn)為SK6 磷酸化降低，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤抑制因子LKB1 表達(dá)增加[14]。因此，脂聯(lián)素具有延緩腫瘤生長、血管生成和VEGF 的表達(dá)特性，通過直接調(diào)節(jié)與腫瘤生長相關(guān)的信號通路來降低惡性腫瘤的發(fā)展已成為脂聯(lián)素新的研究熱點(diǎn)[15]。

研究表明[16]，被診斷為乳腺癌的肥胖患者的預(yù)后往往更差，而且無論絕經(jīng)狀態(tài)如何，癌癥進(jìn)展和復(fù)發(fā)的風(fēng)險都會增加。另外，已證實(shí)肥胖和2 型糖尿病患者與其循環(huán)中脂聯(lián)素的水平呈負(fù)相關(guān)[17]。因此，研制重組脂聯(lián)素或脂聯(lián)素受體激動劑，提高血清脂聯(lián)素水平及脂聯(lián)素受體水平可能為乳腺癌的治療提供新的思路。本研究基于癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫和AmiGO2 衍生的血管生成基因集，篩選出與乳腺癌血管生成有關(guān)的因子脂聯(lián)素，通過免疫組織化學(xué)染色和RT-PCR 測定發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素在乳腺癌和正常組織中存在表達(dá)差異，脂聯(lián)素在乳腺正常組織中的表達(dá)含量高于乳腺癌組織（P＜0.05）。結(jié)合患者臨床病理特征分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同年齡、月經(jīng)史、ER、PR、HER2、Ki-67 表達(dá)間脂聯(lián)素表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；不同腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級、臨床分期間脂聯(lián)素表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），進(jìn)一步說明脂聯(lián)素具有抑制乳腺癌發(fā)生和發(fā)展的作用。

綜上所述，脂聯(lián)素在乳腺組織中呈高表達(dá)，乳腺癌組織中呈低表達(dá)，其可作為乳腺癌新的生物標(biāo)記物，預(yù)測乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后，并為乳腺癌的治療提供參考。