蘇文文，吳 迪，韓振誠(chéng)，李良良，李葦潔，任春光

(貴州省山地資源研究所，貴州 貴陽(yáng) 550001)

獼猴桃是我國(guó)重要的藤本果樹(shù)，由于風(fēng)味獨(dú)特，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，近年來(lái)已逐漸成為多個(gè)地區(qū)的支柱產(chǎn)業(yè)[1-2]。貴州生態(tài)環(huán)境優(yōu)良，小氣候多樣，獼猴桃種質(zhì)資源豐富，是我國(guó)獼猴桃種植大省。紅陽(yáng)和貴長(zhǎng)作為貴州獼猴桃主栽品種，對(duì)大力推進(jìn)貴州省經(jīng)濟(jì)發(fā)展發(fā)揮了重要作用[3]。近年來(lái)，隨著種植面積的不斷擴(kuò)大，獼猴桃果實(shí)病害日益嚴(yán)重。研究表明，大多數(shù)病害主要由真菌侵染造成，影響獼猴桃的貯藏，給獼猴桃產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了一定的經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。獼猴桃果實(shí)腐爛病主要發(fā)生在采摘后及貯藏期，發(fā)病初期果實(shí)表面沒(méi)有明顯特征，后期果實(shí)明顯變軟、腐爛，且伴有酒味，嚴(yán)重影響獼猴桃的外觀及風(fēng)味[6]。

獼猴桃果實(shí)腐爛病主要包括軟腐病、蒂腐病、青霉病、日灼病。其中，對(duì)果實(shí)危害程度較大的為軟腐病、蒂腐病[7-8]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于獼猴桃軟腐病病原菌的報(bào)道主要有葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)、間座殼菌(Diaporthephaseolorum)、擬莖點(diǎn)霉菌(Phomopsiscauloides)、盤(pán)多毛孢菌(pestalotiopsismicrospora)、交鏈格孢菌(Alternariaalternata)等[9-11]。關(guān)于獼猴桃蒂腐病病原菌的報(bào)道主要有間座殼菌和灰霉菌(Botrytiscinerea)[12-15]。隨著病原菌的致病性分化以及環(huán)境等因素的影響，危害獼猴桃果實(shí)的病原菌種類(lèi)在不斷增加，其鑒定及相應(yīng)的防控需要更多關(guān)注和研究。鑒于此，通過(guò)形態(tài)學(xué)及病原菌rDNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS序列對(duì)獼猴桃果實(shí)主要病原菌進(jìn)行鑒定，通過(guò)致病性檢測(cè)了解不同病原菌的致病性，明確引起貴州省獼猴桃果實(shí)腐爛病的病原菌種類(lèi)，為獼猴桃果實(shí)病害防控及貯藏提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試病樣及果實(shí)：于2018—2019年7—10月在貴州省水城縣及修文縣采集發(fā)病果實(shí)30個(gè)，病果分別為貴州獼猴桃主栽品種紅陽(yáng)和貴長(zhǎng)。致病性檢測(cè)所用果實(shí)為健康無(wú)病、大小一致的紅陽(yáng)和貴長(zhǎng)，其中，紅陽(yáng)于水城主產(chǎn)區(qū)果園采購(gòu)，貴長(zhǎng)于修文縣農(nóng)戶(hù)果園采購(gòu)。

試劑及儀器：真菌基因組DNA快速抽提試劑盒及DNA Marker DL2000均從生工生物工程(上海)股份有限公司采購(gòu)，引物 ITS1/ITS4送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成。其余試驗(yàn)器材有超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、光學(xué)顯微鏡(日本尼康有限公司)、水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)、普通離心機(jī)(四川蜀科儀器有限公司)、移液槍(賽默飛世爾科技有限公司)、PCR儀(賽默飛世爾科技有限公司)、電泳儀(北京六一儀器廠)、凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)伯樂(lè)有限公司)、純水儀[威立雅水處理技術(shù)(上海)有限公司]。

PDA培養(yǎng)基制備：馬鈴薯 200 g、瓊脂粉17 g、葡萄糖20 g、去離子水1 L，調(diào)節(jié)pH值至7。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病樣采集與病原菌分離及純化 于獼猴桃成熟期定期到田間采集果實(shí)，用流水沖洗干凈，將果實(shí)病健交接部位的果皮撕下，放入75%的乙醇中消毒1 min。然后用滅菌的去離子水沖洗3次，放在滅菌的定性濾紙上，待殘留的水分揮發(fā)后將病樣置于PDA培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)基放入25 ℃、黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d。觀察菌絲生長(zhǎng)情況，并進(jìn)行菌株純化。具體方法：從培養(yǎng)基中挑取菌落邊緣菌絲，置于新的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，即可得到純化后的單個(gè)病原菌。

1.2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)觀察 將純化的病原菌接種至新的培養(yǎng)基中，置于25 ℃條件下培養(yǎng)，于接種后6 d后對(duì)病原菌菌落特征進(jìn)行觀察。同時(shí)取少量菌絲于載玻片上，滴入適量蒸餾水，在顯微鏡下觀察分生孢子形態(tài)特征，依據(jù)傳統(tǒng)的真菌分類(lèi)方法，初步確定病原菌種類(lèi)[16]。

1.2.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定 參照真菌基因組DNA提取試劑盒操作說(shuō)明提取菌株DNA。選取部分有代表性的菌株，利用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGC-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[17]對(duì)其rDNA-ITS區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系15 μL：模板DNA 2.1 μL、上游引物1.5 μL、下游引物1.5 μL、2×TaqPCR Master Mix 7.5 μL、蒸餾水2.4 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，16 ℃保存。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用NCBI的多序列比對(duì)工具BLAST在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列比較，進(jìn)一步明確病原菌的種類(lèi)。

1.2.4 病原菌的序列分析 將測(cè)序所得序列提交至NCBI核酸序列比對(duì)庫(kù)，獲得不同菌株的序列登錄號(hào)，下載各菌株的代表序列，對(duì)所得序列利用MEGA 7中的最大似然法(MI)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析及進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。

1.2.5 病原菌的致病性檢測(cè) 將健康無(wú)病的紅陽(yáng)和貴長(zhǎng)果實(shí)用蒸餾水沖洗后置于75%的乙醇中消毒1 min，用蒸餾水反復(fù)沖洗，置于通風(fēng)的超凈工作臺(tái)上晾干，進(jìn)行接種試驗(yàn)。

有傷接種：在獼猴桃健康果實(shí)上依次扎3個(gè)直徑5 mm、深3 mm的傷口，用無(wú)菌牙簽挑取新鮮的菌絲進(jìn)行接種。將從紅陽(yáng)病果上分離到的病原菌接種于紅陽(yáng)健康獼猴桃果實(shí)上，從貴長(zhǎng)病果上分離到的病原菌接種于貴長(zhǎng)健康獼猴桃果實(shí)上。

無(wú)傷接種：按上述病原菌與獼猴桃果實(shí)的對(duì)應(yīng)關(guān)系將病原菌分別接種于無(wú)傷口的健康獼猴桃果實(shí)上。

上述2個(gè)試驗(yàn)均以接種無(wú)菌的PDA培養(yǎng)基作對(duì)照(CK)。將不同處理的果實(shí)放入底部墊有無(wú)菌濾紙的容器中，蓋上蓋子，置于25 ℃條件下培養(yǎng)。定期對(duì)果實(shí)進(jìn)行觀察和拍照，記錄病斑大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離與形態(tài)學(xué)觀察

從紅陽(yáng)獼猴桃和貴長(zhǎng)獼猴桃果實(shí)上共分離到20株病原菌，依據(jù)病原菌的菌落形態(tài)及顯微鏡觀察，將其分為4類(lèi)，并依次編號(hào)為M1—M4(圖1)。其中，病原菌M1、M3分離于紅陽(yáng)獼猴桃果實(shí)上，分離率分別為10%、20%；病原菌M4分離于貴長(zhǎng)獼猴桃果實(shí)上，分離率為10%；病原菌M2在紅陽(yáng)和貴長(zhǎng)上都存在，分離率達(dá)到60%。

病原菌M1：病原菌培養(yǎng)至第6天，菌落直徑為8 cm，菌絲白色、稀疏，呈放射狀生長(zhǎng)，基質(zhì)初期為白色，后期為黃褐色(圖1A)。在顯微鏡下觀察，其分生孢子呈橢圓形，單胞，無(wú)隔膜，透明(圖1a)。依據(jù)病原菌形態(tài)特征初步將其鑒定為擬莖點(diǎn)霉菌(Phomopsiscauloides)。

病原菌M2：病原菌培養(yǎng)至第6天，菌落直徑為4.9 cm，氣生菌絲濃密、棉絮狀，初期為白色，后期菌落中央呈紅色，向四周擴(kuò)散(圖1B)。在顯微鏡下觀察，其分生孢子單胞，光滑，有卵圓形，有鐮刀形(圖1b)。依據(jù)病原菌形態(tài)特征初步將其鑒定為鐮刀菌(Fusarium)。

病原菌M3：病原菌培養(yǎng)至第6天，菌落直徑為4.4 cm，菌絲絨毛狀，生長(zhǎng)密集，初期為白色，后期逐漸變?yōu)辄S褐色(圖1C)。在顯微鏡下觀察，其分生孢子呈棒狀或者紡錘狀，有隔(圖1c)。依據(jù)病原菌形態(tài)特征初步將其鑒定為交鏈格孢菌(Alternariaalternata)

病原菌M4：病原菌培養(yǎng)至第6天，菌落直徑為4 cm，菌落形態(tài)呈米色，緊貼于培養(yǎng)基表面(圖1D)。在顯微鏡下觀察，其分生孢子呈橢圓形，單胞，透明，光滑，里面有3個(gè)小油球(圖1d)。病原菌形態(tài)特征與參考文獻(xiàn)[18]報(bào)道相同，初步將其鑒定為黃瓜織球殼菌 (Plectosphaerellacucumerina)。

A—D：M1—M4病原菌，上、下圖分別為菌落正面、背面；a—d：M1—M4病原菌分生孢子形態(tài)特征A—D:M1—M4 pathogens,the upper and lower pictures show the front and back of colony,respectively;a—d:Morphological characteristics of conidia of M1—M4 pathogens圖1 病原菌菌落及分生孢子形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of colony and conidia of pathogens M1—M4

2.2 病原菌的分子檢測(cè)及序列分析

將編號(hào)為M1—M4的菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到520 bp左右的片段。擴(kuò)增測(cè)序結(jié)果提交到GenBank后，與同源序列比對(duì)構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖2。由圖2可知，病原菌M1位于擬莖點(diǎn)霉菌(Phomopsiscauloides)分支，病原菌M2位于鐮刀菌(Fusarium)分支，病原菌M3位于交鏈格孢菌(Alternariaalternata)分支，病原菌M4位于黃瓜織球殼菌(Plectosphaerellacucumerina)分支，所比對(duì)序列的相似度均達(dá)到90%以上。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，判定此次分離得到的貴州獼猴桃果實(shí)腐爛病病原菌主要有擬莖點(diǎn)霉菌、鐮刀菌、交鏈格孢菌和黃瓜織球殼菌。

圖2 基于rDNA-ITS基因序列的病原菌系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic analysis of pathogens based on rDNA-ITS gene sequence

2.3 病原菌的致病性檢測(cè)

將病原菌M1—M4分別接種至大小一致、健康無(wú)病的果實(shí)后，無(wú)傷接種的果實(shí)均未發(fā)病。有傷接種的果實(shí)在接種后3 d開(kāi)始發(fā)病，但發(fā)病特征不明顯；接種后5 d，接種部位果實(shí)發(fā)生明顯腐爛，肉眼可以觀察到白色菌絲，有發(fā)酵汁液流出(圖3)，病斑最大直徑可達(dá)3.75 cm(表1)。將接種后的果實(shí)進(jìn)行組織分離，病原菌形態(tài)特征與前期分離的形態(tài)特征一致。

M1—M4：分別代表擬莖點(diǎn)霉菌、鐮刀菌、交鏈格孢菌、黃瓜織球殼菌，前面的M2來(lái)源于紅陽(yáng)獼猴桃病果，后面的M2來(lái)源于貴長(zhǎng)獼猴桃病果；a-f：CK和病原菌接種至果實(shí)后發(fā)病癥狀；a1-f1：CK和病原菌接種后發(fā)病果實(shí)截面M1—M4:Represents Phomopsis cauloides,Fusarium,Alternaria alternata and Plectosphaerella cucumerina respectively,the former M2 comes from the diseased fruit of Hongyang kiwifruit,and the latter M2 comes from the diseased fruit of Guichang kiwifruit;a-f:Symptoms of disease after inoculation of control and pathogens;a1-f1:Cross-section of diseased fruits after inoculation of control and pathogens圖3 獼猴桃果實(shí)腐爛病菌致病性檢測(cè)Fig.3 Detection of pathogenicity of the pathogens of kiwifruit rot disease

表1 病原菌分離物接種至獼猴桃果實(shí)后的病斑直徑Tab.1 Disease spot diameter of pathogen isolates inoculated into kiwifruit cm

3 結(jié)論與討論

獼猴桃果實(shí)腐爛病對(duì)獼猴桃的品質(zhì)和風(fēng)味有嚴(yán)重影響，鑒定獼猴桃果實(shí)腐爛病病原菌對(duì)提高獼猴桃產(chǎn)量及品質(zhì)有重要作用。馮麗等[19]通過(guò)對(duì)貴長(zhǎng)獼猴桃果實(shí)腐爛病進(jìn)行研究，主要分離到曲霉菌(Aspergillussp.)、枝孢菌(Cladosporiumsp.)、鐮刀菌和青霉菌(Penicilliumsp.)等；ZHOU等[9]從四川省獼猴桃主產(chǎn)區(qū)果實(shí)病害上鑒定出了葡萄座腔菌、小新殼梭孢菌(Neofusicoccumsp.)等；雷霽卿等[20]從貴州省紅陽(yáng)獼猴桃軟腐病果實(shí)上鑒定出葡萄座腔菌、交鏈格孢菌、擬莖點(diǎn)霉菌、小新殼梭孢菌和間座殼菌等。本研究通過(guò)對(duì)貴州省水城縣和修文縣兩地獼猴桃果實(shí)腐爛病病原菌的分離、純化、形態(tài)學(xué)觀察以及分子檢測(cè)，得到4種主要病原菌，分別是擬莖點(diǎn)霉菌、鐮刀菌、交鏈格孢菌和黃瓜織球殼菌。其中，擬莖點(diǎn)霉菌和交鏈格孢菌、鐮刀菌在前人研究中均有報(bào)道，而黃瓜織球殼菌是首次在貴州省獼猴桃腐爛病病原菌鑒定中發(fā)現(xiàn)的致病菌。

黃瓜織球殼菌是寄主范圍很廣的真菌，可引起多種作物和瓜果發(fā)生萎蔫和腐爛。SATOU等[21]報(bào)道該病原菌引起了南瓜疫??；VITALE等[22]和GARIBALDI等[23]通過(guò)對(duì)葫蘆科枯萎病和長(zhǎng)尾菊葉斑病進(jìn)行研究，認(rèn)為該病原菌是引起作物猝倒病發(fā)生的主要原因。近年來(lái)，由黃瓜織球殼菌引起的病害逐漸增加，如日本報(bào)道的鮮切菊(Cichoriumendivia)發(fā)生莖部腐爛[22]，意大利萵苣(Cichoriumendivia)出現(xiàn)葉斑病等[23]，該病原菌也給我國(guó)遼寧省部分地區(qū)的番茄造成了嚴(yán)重危害[24]。本研究通過(guò)對(duì)獼猴桃果實(shí)病害進(jìn)行病原菌分離，初步將黃瓜織球殼菌確定為侵染獼猴桃果實(shí)的一種新病原菌，其對(duì)獼猴桃果實(shí)造成的危害較擬莖點(diǎn)霉菌、鐮刀菌和交鏈格孢菌輕，并且發(fā)生范圍也較小，可能與該病原菌首次在獼猴桃果實(shí)上侵染有關(guān)。擬莖點(diǎn)霉菌、鐮刀菌和交鏈格孢菌可以侵染獼猴桃果實(shí)，在獼猴桃根部和葉片病害的研究中也有報(bào)道[25-26]，而黃瓜織球殼菌僅在獼猴桃果實(shí)病害中發(fā)生。黃瓜織球殼菌是在獼猴桃果實(shí)腐爛病鑒定中首次發(fā)現(xiàn)的一種病原菌，對(duì)獼猴桃果實(shí)病害的防控和生產(chǎn)實(shí)踐具有一定的理論指導(dǎo)意義。