楊祝強(qiáng)，王洪洋，唐 唯，李燦輝，劉 晶

(1.云南師范大學(xué) 云南省馬鈴薯生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；2.云南師范大學(xué) 云南省高校馬鈴薯生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500)

馬鈴薯作為全球第三大糧食作物，在人類糧食安全中發(fā)揮著重要作用[1-2]。然而，由致病疫霉(Phytophthorainfestans)引起的馬鈴薯晚疫病，在世界范圍內(nèi)導(dǎo)致馬鈴薯產(chǎn)量降低，甚至引起馬鈴薯絕收，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3-7]。1845年，馬鈴薯晚疫病在愛爾蘭大暴發(fā)并造成饑荒，致使數(shù)百萬人死亡[8]。當(dāng)前，晚疫病仍是現(xiàn)代馬鈴薯生產(chǎn)上的巨大問題[9]。致病疫霉屬于藻界(Chromista)卵菌門(Oomycota)鞭毛菌亞門(Mastigomycotina)卵菌綱(Ommycetes)霜霉目(Peronosporales)腐霉科(Pyhiaceae)疫霉屬(Phytophthora)[10]。致病疫霉的生活史分為無性世代和有性世代，在無性世代中，孢子囊是致病疫霉無性階段最主要的繁殖器官和侵染器官。與菌絲體相比，孢子囊抵抗不利環(huán)境的能力更強(qiáng)且更易于傳播。當(dāng)外界環(huán)境濕度較高、溫度在24～25 ℃時，孢子囊直接萌發(fā)產(chǎn)生芽管[11]；當(dāng)外界環(huán)境濕度較高、溫度較低(最適溫度10～15 ℃)時，孢子囊釋放出游動孢子[3]。致病疫霉的游動孢子呈腎形，具2根鞭毛，能在水中游動；游動孢子侵染寄主植物前，其鞭毛脫落，形成球形的休止孢，之后休止孢萌發(fā)產(chǎn)生芽管侵入寄主體內(nèi)[12]。游動孢子的主要作用是幫助病原菌擴(kuò)散到合適的侵染部位進(jìn)行侵染，并且游動孢子也是非常有效的繁殖體[13-14]。無論是孢子囊直接萌發(fā)還是孢子囊釋放游動孢子均能夠引起田間多次再侵染并造成病害大流行[15]。馬鈴薯種質(zhì)資源抗晚疫病評價、抗晚疫病基因挖掘及克隆、致病疫霉致病機(jī)制等相關(guān)研究中都需要大量的游動孢子作為接種菌源及研究材料。因此，探索游動孢子的最佳釋放條件至關(guān)重要。在辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)及大豆疫霉(Phytophthoranicotianae)等疫霉屬致病卵菌中，游動孢子制備的最佳條件不盡相同，但游動孢子的產(chǎn)生均離不開水[16-21]。目前，尚未有致病疫霉游動孢子最佳制備條件的相關(guān)報道，鑒于此，探索致病疫霉孢子囊和游動孢子制備的最佳條件，為今后致病疫霉致病機(jī)制及馬鈴薯抗晚疫病研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 供試菌株為致病疫霉88069菌株, 由云南師范大學(xué)馬鈴薯科學(xué)研究院保存并提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 供試培養(yǎng)基為黑麥-V8培養(yǎng)基，配制方法如下：向60 g浸泡過夜的黑麥中加入1 000 mL蒸餾水，121 ℃高壓蒸汽滅菌40 min，經(jīng)2層紗布過濾得到黑麥汁，向黑麥汁中加入V8蔬菜汁100 mL、瓊脂20 g、碳酸鈣1 g，調(diào)pH值至7.0，加ddH2O補(bǔ)足至1 000 mL，121 ℃高溫高壓滅菌20 min備用。

1.1.3 供試溶液 供試溶液為Petri’s溶液。50×Petri’s母液配制方法如下：CaCl21.39 g，MgSO46.02 g，KH2PO46.80 g，KCl 2.98 g，加ddH2O定容至1 000 mL，使用前稀釋成1×Petri’s溶液。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株培養(yǎng) 用接種針挑取保存的致病疫霉88069接種于黑麥-V8培養(yǎng)基上，18 ℃黑暗培養(yǎng)。

1.2.2 孢子囊的制備 將18 ℃黑暗培養(yǎng)9 d的88069菌株用直徑為0.8 cm的打孔器在培養(yǎng)平板上隨機(jī)均勻地打取菌絲塊，并接種于新的含黑麥-V8培養(yǎng)基的平板上，每個平板均勻接種3塊菌絲，18 ℃黑暗條件下分別培養(yǎng)7～12 d。向以上培養(yǎng)7～12 d的88069菌株中分別加入3 mL Petri’s溶液，用滅菌玻璃涂布棒將培養(yǎng)基上的孢子囊刮下，經(jīng)Microcloth過濾后轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的離心管中，統(tǒng)計(jì)1 mL孢子囊懸浮液中的孢子囊個數(shù)，并將其稀釋成104個/mL備用。

1.2.3 游動孢子的制備 分別采用5種不同低溫誘導(dǎo)組合方法制備游動孢子。方法M1：將孢子囊懸浮液于10 ℃下靜置30 min，再在18 ℃下靜置30 min；方法M2：將孢子囊懸浮液于4 ℃下靜置30 min，再在10 ℃下靜置90 min；方法M3：將孢子囊懸浮液于4 ℃下靜置30 min，再在10 ℃下靜置60 min；方法M4：將孢子囊懸浮液于4 ℃下靜置3 h；方法M5：將孢子囊懸浮液于4 ℃下靜置2 h，再在18 ℃下靜置1 h。

1.2.4 孢子囊及游動孢子的計(jì)數(shù) 用移液槍吸取5 μL孢子囊或游動孢子懸浮液，將懸浮液在載玻片上輕拉成一條細(xì)線，計(jì)算樣本中的孢子囊或游動孢子總數(shù)，每個樣本取樣5次，計(jì)算1 mL懸浮液中的孢子囊或游動孢子個數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism和SPSS 18.0軟件進(jìn)行作圖和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病疫霉孢子囊和游動孢子的形態(tài)特征

致病疫霉孢子囊呈長檸檬形，頂端有乳突，另一端有小柄，小柄易從菌絲上脫落(圖1)。當(dāng)環(huán)境濕度較高且溫度較低的條件下，孢子囊可從乳突釋放出游動孢子(圖2)。游動孢子呈腎形，從孢子囊中釋放后便無規(guī)則游動，40×10倍鏡下可隱約看到2根鞭毛(圖2A、B)。游動孢子釋放完畢后形成空孢子囊殼(圖2C) 。

A、B、C分別為10×10、20×10、40×10倍鏡下的孢子囊形態(tài)，黑色箭頭所指為孢子囊A,B,C are the sporangia morphology under 10×10,20×10 and 40×10 magnifications respectively,the black arrow points to the sporangium圖1 致病疫霉孢子囊的形態(tài)Fig.1 The morphology of P.infestans sporangium

A.孢子囊正在釋放游動孢子(40×10)； B.游動孢子(40×10); C.游動孢子及空孢子囊(20×10),黑色箭頭所指為游動孢子，白色箭頭所指為空孢子囊A.Sporangium is releasing zoospores (40×10); B.Zoospore (40×10); C.Zoospores and empty sporangium(20×10),the black arrow indicates zoospores while the white arrow indicates empty sporangium圖2 致病疫霉游動孢子的形態(tài)Fig.2 Morphology of zoospores of P.infestans

2.2 不同培養(yǎng)時間對致病疫霉孢子囊產(chǎn)量的影響

為測定不同培養(yǎng)天數(shù)對致病疫霉孢子囊產(chǎn)量的影響，將致病疫霉接種于黑麥-V8培養(yǎng)基上，在18 ℃黑暗條件下分別培養(yǎng)7～12 d并收集孢子囊。結(jié)果顯示，孢子囊產(chǎn)量先迅速增加，隨后增速放緩，直至基本不再增加(圖3)。培養(yǎng)7 d的致病疫霉孢子囊產(chǎn)量最低，為4.87×104個/mL，之后孢子囊產(chǎn)量迅速增加。第8、9天孢子囊產(chǎn)量分別比前1 d增加71.3%、79.2%。從第10 天開始，孢子囊產(chǎn)量增速稍有降低，相比第9天孢子囊產(chǎn)量增加了66.07%。第11天的孢子囊產(chǎn)量增速大幅下降，僅比第10天孢子囊產(chǎn)量增加了23.7%，孢子囊產(chǎn)量為3.07×105個/mL。隨后孢子囊產(chǎn)量進(jìn)入平臺期，第12天的孢子囊產(chǎn)量與前1 d相比無顯著差異，為3.15×105個/mL (圖3)。

2.3 不同培養(yǎng)時間及制備方法對致病疫霉游動孢子產(chǎn)量的影響

為測定不同培養(yǎng)時間及制備方法對致病疫霉游動孢子產(chǎn)量的影響，分別在黑麥-V8培養(yǎng)基上培養(yǎng)致病疫霉7～12 d收獲孢子囊，并用5種方法分別制備游動孢子。結(jié)果表明，用培養(yǎng)7～9 d的致病疫霉收獲的孢子囊制備游動孢子時，無論選擇哪種制備方法，游動孢子產(chǎn)量起初均隨著培養(yǎng)時間的延長而增加，并在第9天達(dá)到峰值；之后，當(dāng)培養(yǎng)時間延長到10～12 d時，游動孢子產(chǎn)量均顯著下降，尤其是方法M1，用培養(yǎng)12 d收獲的孢子囊制備游動孢子時，游動孢子產(chǎn)量較培養(yǎng)9 d的減少77.71%(圖4)。使用培養(yǎng)9 d得到的孢子囊制備游動孢子時，游動孢子產(chǎn)量最高，且5種不同方法得到的游動孢子產(chǎn)量差異不顯著。除使用培養(yǎng)9 d收獲的孢子囊制備的游動孢子產(chǎn)量最高外，其他培養(yǎng)時間下得到的游動孢子量根據(jù)制備方法的不同稍有差異。結(jié)合圖3及圖4的結(jié)果可知，孢子囊產(chǎn)量大時其游動孢子產(chǎn)量并不一定大，二者之間不完全呈正相關(guān)。因此，要快速得到大量的游動孢子，可以收集培養(yǎng)9 d的致病疫霉孢子囊，將其在10 ℃下靜置30 min，再在18 ℃下靜置30 min(M1)，收集游動孢子。如果不考慮制備時間，可以用培養(yǎng)9 d的致病疫霉孢子囊在4 ℃靜置2 h后再在18 ℃靜置1 h，即可獲得最大量的游動孢子。

不同小寫字母表示差異顯著(Tukey’s HSD,P<0.05)Different lowercase letters mean significantdifference among groups(Tukey’s HSD,P<0.05)圖3 不同培養(yǎng)時間致病疫霉的孢子囊產(chǎn)量Fig.3 The sporangia yield of P.infestans under different culture time

不同小寫字母表示同一時間不同方法差異顯著Different lowercase letters mean significant difference among different methods at the same time圖4 不同培養(yǎng)時間、不同制備方法對致病疫霉游動孢子產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of different culture time and different preparation methods on zoospore yield of P.infestans

3 結(jié)論與討論

由致病疫霉引起的馬鈴薯晚疫病是馬鈴薯生產(chǎn)上的主要病害之一，該病害嚴(yán)重威脅馬鈴薯的生產(chǎn)和全球糧食安全[2-3]。致病疫霉釋放的游動孢子是侵染馬鈴薯并引起晚疫病的主要田間因素之一。因此，優(yōu)化致病疫霉游動孢子的制備條件對篩選馬鈴薯抗晚疫病品種、挖掘其抗晚疫病基因以及解析致病疫霉的致病機(jī)制等具有重要意義。本研究探討了不同培養(yǎng)時間對致病疫霉孢子囊產(chǎn)量的影響，以及不同培養(yǎng)時間、不同制備方法對致病疫霉游動孢子產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，用培養(yǎng)9 d 的致病疫霉收獲的孢子囊能夠制備得到大量游動孢子，且不同制備方法得到的游動孢子產(chǎn)量差異不顯著。如要快速大量制備游動孢子，可收集培養(yǎng)9 d的致病疫霉孢子囊，將其在10 ℃下靜置30 min，再在18 ℃下靜置30 min。如要得到最大量的游動孢子且不考慮制備時間，可收集培養(yǎng)9 d的致病疫霉孢子囊，將其在4 ℃靜置2 h后再在18 ℃靜置1 h。

在疫霉屬其他植物致病菌中也有關(guān)于游動孢子最佳制備條件的報道，其中有關(guān)辣椒疫霉孢子囊及游動孢子的制備條件等研究報道相對較多，研究結(jié)果也不盡相同。張榮等[16]研究發(fā)現(xiàn)，辣椒疫霉游動孢子的最佳誘導(dǎo)條件是，該菌在玉米粉瓊脂培養(yǎng)基上26 ℃暗培養(yǎng)3 d并持續(xù)光照培養(yǎng)6 d，再加無菌水并置于16 ℃光照0.5 h。李立鳳等[17]研究表明，將長滿菌絲的辣椒疫霉培養(yǎng)皿加入30 mL滅菌水后于30 ℃全光照處理6 d時，游動孢子產(chǎn)量最大。許亞池等[18]對辣椒疫霉游動孢子的最佳產(chǎn)生方法進(jìn)行探究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，辣椒疫霉在5% V8培養(yǎng)基上28 ℃黑暗培養(yǎng)5 d，向培養(yǎng)皿內(nèi)加入無菌水后再在28 ℃下全光照培養(yǎng)5 d，可誘導(dǎo)該菌產(chǎn)生大量的游動孢子。此外，在煙草疫霉及大豆疫霉(Phytophthorasojae)中也有游動孢子制備方法的相關(guān)報道。楊建卿等[19]經(jīng)過試驗(yàn)研究得出，在滴加了土壤浸出液的皮氏培養(yǎng)液中，煙草疫霉菌絲可在3 d內(nèi)產(chǎn)生大量的游動孢子囊，游動孢子囊經(jīng)低溫處理后再培養(yǎng)24 h可產(chǎn)生大量游動孢子。AHONSI等[20]研究發(fā)現(xiàn)，溫度顯著影響煙草疫霉游動孢子的產(chǎn)生；22 ℃下游動孢子產(chǎn)量最高，36 ℃下游動孢子的形成被完全抑制。趙艷龍等[21]比較了不同培養(yǎng)方法對煙草疫霉游動孢子產(chǎn)生的影響，結(jié)果表明，菌絲塊-水培法產(chǎn)生游動孢子的速度最快、數(shù)量最多，且方法簡單，是最佳的培養(yǎng)方法。左豫虎等[22]研究發(fā)現(xiàn)，間歇性地給大豆疫霉菌絲塊換水可以誘導(dǎo)菌絲產(chǎn)生孢子囊，進(jìn)而釋放游動孢子。蘭成忠等[23]對誘發(fā)大豆疫霉產(chǎn)生游動孢子囊的10種方法進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，土壤浸出液法和皮氏液加土壤浸出液法能夠得到大量的游動孢子。綜合前人研究結(jié)果可以看出，疫霉屬卵菌的游動孢子釋放條件各不相同，但游動孢子的產(chǎn)生都離不開水。

本研究以致病疫霉為材料，探討了不同培養(yǎng)時間及不同低溫誘導(dǎo)組合的方法對其游動孢子釋放的影響。致病疫霉孢子囊的產(chǎn)量起初隨著菌株培養(yǎng)時間的延長而快速增加，隨后孢子囊產(chǎn)量增速放緩，當(dāng)培養(yǎng)時間繼續(xù)延長時，孢子囊產(chǎn)量基本不再增加，培養(yǎng)12 d得到的孢子囊產(chǎn)量與前1 d相比差異不顯著。收集不同培養(yǎng)時間收獲的孢子囊并制備游動孢子，游動孢子的產(chǎn)量隨著孢子囊培養(yǎng)日齡的增加均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當(dāng)培養(yǎng)時間為9 d時，游動孢子產(chǎn)量最高且不同制備方法得到的游動孢子產(chǎn)量差異不顯著；當(dāng)培養(yǎng)時間大于9 d時，不同制備方法得到的游動孢子產(chǎn)量均迅速下降。該研究結(jié)果表明，孢子囊產(chǎn)量與游動孢子產(chǎn)量并不完全呈正相關(guān)，這與張榮等[16]、王曉敏等[24]關(guān)于辣椒疫霉游動孢子誘導(dǎo)條件的研究結(jié)論一致。推測當(dāng)培養(yǎng)時間大于9 d時游動孢子產(chǎn)量下降的原因可能是由于后期孢子囊隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸成熟并衰老，從而影響到游動孢子的釋放。該研究結(jié)果為大量制備致病疫霉游動孢子提供了參考，為后續(xù)馬鈴薯抗晚疫病研究及致病疫霉的致病機(jī)制等相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。