劉 璐，萬(wàn)偉杰，鄭通文，龍欣鈺，孫正祥，周 燚

(長(zhǎng)江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/湖北省農(nóng)林病蟲(chóng)害預(yù)警與調(diào)控工程技術(shù)研究中心，湖北 荊州 434025)

棉花(MalvaceaegossypiumL.)是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，世界上約有60%的棉花產(chǎn)自亞洲大陸[1-2]。由大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)引起的棉花黃萎病是導(dǎo)致我國(guó)棉花受危害最嚴(yán)重的病害[3]，該病害分布廣、危害重，是一種土傳的維管束病害[4]，最早于1914年在美國(guó)被報(bào)道，1935年傳入我國(guó)，并不斷蔓延擴(kuò)散[5]。棉花黃萎菌的防治目前主要有選育抗病品種和化學(xué)防治，抗病品種的防效雖好，但選育周期長(zhǎng)；化學(xué)防治效果有限，耗費(fèi)大，且影響環(huán)境和人類(lèi)健康[6]。而生物防治因具有成本低、污染小、可持續(xù)發(fā)展等優(yōu)點(diǎn)，逐漸被人們重視。

目前，用于植物病害防治的生物因子包括微生物、抗生素和植物誘導(dǎo)劑等，其中，微生物應(yīng)用最廣泛。用于防治棉花黃萎病的生防菌株較多的是芽孢桿菌(Bacillussp.)[7]，如多黏類(lèi)芽孢桿菌[8]、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌[9]、枯草芽孢桿菌[10]，而關(guān)于吡咯伯克霍爾德氏菌防治棉花黃萎病害的報(bào)道較少。菌株YZU-377(S377)是本實(shí)驗(yàn)室(長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物與微生物互作實(shí)驗(yàn)室)前期獲得的1株植物根際細(xì)菌，具有廣譜抑菌作用，經(jīng)鑒定為吡咯伯克霍爾德氏菌(Burkholderiapyrrocinia)[11]。為進(jìn)一步拓展棉花黃萎病的生防菌資源，測(cè)定了菌株S377對(duì)棉花黃萎病的防效、對(duì)棉花的促生作用及其在棉花植株內(nèi)的定殖動(dòng)態(tài)，以期為棉花黃萎病生防菌的基礎(chǔ)研究和開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株及棉花品種 菌株S377：由本實(shí)驗(yàn)室從水稻根際分離篩選并保存。

標(biāo)記菌株YZU-S377GFP(S377GFP)：將pBBR1MCS2-Tac-EGFP質(zhì)粒導(dǎo)入YZU-S377，由本實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)化完成。

棉花黃萎病菌Vd080(Vd)和冀棉11：均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所惠贈(zèng)。

1.1.2 培養(yǎng)基 NA培養(yǎng)基(營(yíng)養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基)、PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基)、NB培養(yǎng)液(營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基)、察氏培養(yǎng)基，配方見(jiàn)參考文獻(xiàn)[12]。

1.2 菌株S377對(duì)棉花黃萎病菌的抑制作用測(cè)定

1.2.1 菌株S377發(fā)酵液對(duì)棉花黃萎病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用 在NA上活化S377，挑取單菌落接種到NB中，28 ℃、130 r/min振蕩培養(yǎng)24 h作為種子液。以1%的接種量接種至200 mL NB中，28 ℃、130 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，獲得發(fā)酵液，備用。

選取棉花黃萎病菌Vd菌餅(5 mm)置于PDA平板中央，在距離菌餅25 mm處呈3點(diǎn)對(duì)稱(chēng)打孔(直徑5 mm)，每孔分別注入100 μL S377發(fā)酵液，以每孔加入100 μL NB為對(duì)照(CK)。25 ℃恒溫培養(yǎng)15 d后，測(cè)定抑菌帶的大小，并計(jì)算抑菌率[13]。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 菌株S377無(wú)菌濾液對(duì)棉花黃萎病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用 參照1.2.1的方法，將菌株S377培養(yǎng)7 d后離心收集上清液，通過(guò)濾膜(0.22 μm)過(guò)濾，獲得無(wú)菌濾液。待PDA培養(yǎng)基冷卻至55 ℃左右，將S377無(wú)菌濾液分別按10%、20%、30%、40%比例混合倒板，在平板中央接種Vd菌餅(直徑5 mm)，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。以加入同體積NB作為對(duì)照(CK)，25 ℃恒溫培養(yǎng)，待對(duì)照Vd長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿的2/3時(shí)，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑并計(jì)算抑菌率[13]。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 菌株S377對(duì)棉花黃萎病的盆栽防效測(cè)定

播種：棉花種子經(jīng)4% NaClO處理5 min，無(wú)菌水漂洗3次后溫湯浸種3 h，播種于盆缽(11 cm×11 cm×10 cm)中，每個(gè)盆缽中盛有800 g滅菌土壤。出苗后，每盆保留4株健康植株。Vd孢子懸浮液制備：將Vd接種于PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)7 d，然后接種到察氏培養(yǎng)基中，25 ℃、130 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，3層紗布過(guò)濾，獲得孢子懸浮液。菌株S377發(fā)酵液的制備：將活化的S377菌液按1∶100(V/V)接入NB，130 r/min、28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h。

試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)處理：1)S377；2)NB+Vd(對(duì)照)；3)S377+Vd；4)NB。播種21 d后，灌根接入S377菌液(1×109cfu/mL)，每株棉苗灌10 mL，同時(shí)灌根接種Vd孢子懸浮液(1×107個(gè)/mL)[14]，每株棉苗灌10 mL。每處理10盆，3次重復(fù)。將盆缽置于光照溫室中，光照∶黑暗=16 h∶8 h，(25±2)℃培養(yǎng)。接種30 d后，觀察病害發(fā)生情況和計(jì)算病情指數(shù)等指標(biāo)[15]。

1.4 菌株S377對(duì)棉花種子萌發(fā)及幼苗的促生作用測(cè)定

1.4.1 菌株S377無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)棉花種子萌發(fā)的促生作用 參照1.2.2的方法制備S377無(wú)菌發(fā)酵液，消毒后的棉花種子浸泡于S377無(wú)菌發(fā)酵液[16]，28 ℃、130 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后置于鋪有2層濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿15粒種子，以NB培養(yǎng)液為對(duì)照，每處理3次重復(fù)。置于25 ℃、光照∶黑暗=16 h∶8 h的培養(yǎng)箱中。分別于7、14 d后計(jì)算種子的發(fā)芽率和生長(zhǎng)參數(shù)[17]。

1.4.2 菌株S377發(fā)酵液對(duì)棉花幼苗生長(zhǎng)的促生作用 參照1.3的方法播種棉花種子，然后灌根接入S377菌液(1.0×107cfu/mL)，每粒種子10 mL，以倒入等量的NB為對(duì)照。將盆缽置于光照溫室中，光照∶黑暗=16 h∶8 h，(25 ± 2)℃培養(yǎng)。每個(gè)處理20株棉苗，3次重復(fù)。在播種15 d后，測(cè)定幼苗長(zhǎng)度、根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量和光合作用SPAD值[15]。

1.5 菌株S377生物被膜形成強(qiáng)度的測(cè)定

采用結(jié)晶紫染色法[18]，分別測(cè)定菌株S377在OD600為0.10、0.15、0.20、0.25、0.30時(shí)的生物被膜形成強(qiáng)度，重復(fù)3次。

1.6 菌株S377在棉花根部的定殖動(dòng)態(tài)測(cè)定

常規(guī)溫室育苗，待棉苗長(zhǎng)至2片真葉期時(shí)，灌根接種S377GFP培養(yǎng)液(1×109cfu/mL)，每株10 mL。接種1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21 d后分別取棉花根尖組織，制片置于熒光顯微鏡下觀察菌株定殖情況。另取上述不同時(shí)間的棉花根部組織，清洗干凈，稱(chēng)鮮質(zhì)量1.0 g，剪碎后充分研磨，梯度稀釋。取100 μL稀釋液涂布于50 μg/mL的卡那霉素NA平板上，計(jì)數(shù)菌落，3次重復(fù)[19]。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 7處理和分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株S377對(duì)棉花黃萎病菌的抑制作用

平板對(duì)峙結(jié)果表明，菌株S377能顯著抑制棉花黃萎病菌(Vd)菌絲的生長(zhǎng)，相對(duì)抑制率為89.22%(圖1)。

a：對(duì)照; b：S377發(fā)酵液a: Control; b: S377 fermentation broth圖1 菌株S377對(duì)棉花黃萎病菌(Vd)菌絲生長(zhǎng)的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of strain S377 on mycelial growth of Verticillium dahliae (Vd)

S377無(wú)菌濾液對(duì)棉花黃萎病菌的抑制作用測(cè)度結(jié)果表明，10%、20%、30%和40% 4種比例的S377無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)Vd均具有抑制作用，其中，40%時(shí)抑制作用最顯著，為61.06%(表1)。

表1 菌株S377無(wú)菌濾液對(duì)Vd菌絲生長(zhǎng)的抑制作用Tab.1 Inhibitory effect of sterile filtrate of strain S377 on the growth of Vd mycelia %

2.2 菌株S377對(duì)棉花黃萎病的盆栽防效

盆栽防效測(cè)定結(jié)果(圖2)表明，菌株S377對(duì)棉花黃萎病具有良好的防效，對(duì)照組(NB+Vd)的病株率和病情指數(shù)分別為33.33%、25.04，而處理組S377+Vd的病株率和病情指數(shù)分別為25.04%、9.38，其相對(duì)防效為62.53%。

2.3 菌株S377對(duì)棉花種子及幼苗的促生作用

2.3.1 菌株S377無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)棉花種子萌發(fā)的影響 S377無(wú)菌發(fā)酵液處理棉花種子后，種子的發(fā)芽率和幼根總鮮質(zhì)量顯著高于對(duì)照。棉花種子發(fā)芽率提高了22.22個(gè)百分點(diǎn)；7 d時(shí)鮮質(zhì)量相對(duì)對(duì)照組增加了0.06 g，14 d時(shí)增加了0.08 g；7 d時(shí)根長(zhǎng)與對(duì)照組無(wú)顯著差異，但14 d時(shí)顯著高于對(duì)照組，棉花種子根長(zhǎng)增加了17.34 mm，差異顯著(表2)。

圖2 菌株S377對(duì)棉花黃萎病的盆栽防效Fig.2 Control effect of strain S377 on Verticillium wilt of cotton

表2 菌株S377 無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)棉花種子萌發(fā)的影響Tab.2 Effects of sterile fermentation broth of strain S377 on cotton seed germination

2.3.2 菌株S377發(fā)酵液對(duì)棉花幼苗的促生作用 S377發(fā)酵液處理棉花幼苗后，處理組苗長(zhǎng)、根長(zhǎng)和鮮質(zhì)量均顯著高于對(duì)照，苗長(zhǎng)增加了4.00 mm，根長(zhǎng)增加了27.78 mm，苗鮮質(zhì)量增加了0.73 g，根鮮質(zhì)量增加了0.05 g。SPAD值與對(duì)照組無(wú)顯著差異(表3)。

2.4 菌株S377的生物被膜形成強(qiáng)度

生物被膜測(cè)定結(jié)果(表4)表明，菌株S377在OD600等于0.15、0.25 時(shí)的生物被膜形成強(qiáng)度較顯著，分別為1.336、1.148。

表4 菌株S377 生物被膜形成強(qiáng)度Tab.4 Biofilm formation intensity of strain S377

2.5 菌株S377在棉花植株的定殖動(dòng)態(tài)能力

定殖動(dòng)態(tài)檢測(cè)結(jié)果(圖3)表明，S377GFP灌根處理棉花植株后，1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21 d均能在棉花根尖組織觀察到綠色熒光信號(hào)，持續(xù)達(dá)到21 d。

a：1 d；b：3 d；c：5 d；d：7 d；e：9 d；f：11 d；g：13 d；h：15 d；i：17 d；j：19 d；k：21 d圖3 S377 在棉花根部的熒光觀察Fig.3 Fluorescence observation of S377 in cotton roots

經(jīng)回收檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，菌株S377GFP接種到棉花根部以后，菌株的數(shù)量呈先增后減趨勢(shì)，即在第1～7天是持續(xù)增長(zhǎng)的過(guò)程，在第7 天達(dá)到最高水平后逐漸降低(圖4)。

3 結(jié)論與討論

棉花黃萎病是棉花生產(chǎn)中最嚴(yán)重的病害之一[20]。選育抗病品種是從根本上控制棉花黃萎病的有效防治策略，但是目前常規(guī)選育出的棉花品種對(duì)棉花黃萎病的控制效果尚不理想，且尚無(wú)殺真菌劑可高效防治棉花黃萎病[21]。篩選棉花黃萎病的生防菌及其開(kāi)發(fā)應(yīng)用，是目前該病害生物防治研究的主要內(nèi)容。迄今為止，關(guān)于吡咯伯克霍爾德氏菌防治棉花黃萎病害的報(bào)道較少，閔莉靜等[22]、楊欣等[23]研究的吡咯伯克霍爾德氏菌JK-SH007對(duì)3種楊樹(shù)潰瘍病病原真菌具有較強(qiáng)的拮抗作用，同時(shí)JK-SH007能在楊樹(shù)體內(nèi)高效定殖，具有顯著的促生作用。

菌株S377對(duì)棉花黃萎病的盆栽防效為62.53%，表明該菌株在棉花黃萎病防治方面具有較好的應(yīng)用前景。此外，還發(fā)現(xiàn)菌株S377處理對(duì)棉花植株在苗長(zhǎng)、根長(zhǎng)和鮮質(zhì)量方面具有明顯的促生作用，可以增強(qiáng)棉花植株的抗病能力，提高其抵抗棉花黃萎病害侵染的能力。目前，生防菌的定殖能力及動(dòng)態(tài)規(guī)律研究已是生防微生物應(yīng)用和研發(fā)的前提條件[24]。有研究表明，根際細(xì)菌的定殖能力與生物被膜的形成有關(guān)[25]。生物被膜的產(chǎn)生促進(jìn)了枯草芽孢桿菌對(duì)由丁香假單胞菌感染引起的擬南芥根部病害的生物防治[26]。菌株S377具有形成生物被膜的能力，S377GFP可以在棉花根部定殖并進(jìn)行大量繁殖，說(shuō)明菌株具有定殖的能力。測(cè)定拮抗微生物在根系的定殖量是通過(guò)促生或生物防治提高作物生產(chǎn)力相關(guān)研究的重要手段[27]。

本研究表明，S377GFP可能成為有害化學(xué)物質(zhì)的生態(tài)友好型和可持續(xù)型替代品，用于促進(jìn)作物生長(zhǎng)和控制作物病害的。具有生物防治潛力的內(nèi)生細(xì)菌，其種群大小是控制植物病原體的重要因素之一[28]。這一事實(shí)可能是S377具有防治棉花黃萎病潛力的有力證據(jù)。但在病株棉花體內(nèi)S377的定殖情況以及將S377GFP導(dǎo)入棉花體內(nèi)有效且便捷的接種方式有待進(jìn)一步探究。本研究采用的盆栽試驗(yàn)方法是傳統(tǒng)的灌根法，一般認(rèn)為Vd的侵入點(diǎn)位于寄主植物的根尖部分，針刺法等是更有效且發(fā)病快速、均勻的方法[29]，今后可采取這些方法對(duì)S377GFP進(jìn)行盆栽防效試驗(yàn)。本研究測(cè)定了S377GFP在棉花根部的定殖動(dòng)態(tài)，但未探究在Vd存在的情況下，其在棉花體內(nèi)的定殖動(dòng)態(tài)。由于Vd一般從棉花根尖侵入，進(jìn)而侵染到維管束，再沿維管束向上侵染到莖葉，最后侵染全株植物，所以可進(jìn)一步探索S377GFP在棉花體內(nèi)的傳導(dǎo)過(guò)程。此外，菌株S377的拮抗物質(zhì)尚不明確，可進(jìn)一步探究，為棉花黃萎病的生物防治提供優(yōu)良的菌種資源。