肖 賢，李 麗，李琳玲,，查三省，袁紅慧，鄧 坤，程水源，程 華,

(1.武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院,湖北 武漢 430023;2.經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黃岡師范學(xué)院,湖北 黃岡 438000)

銀杏(GinkgobilobaL.)葉具有重要的藥用價(jià)值，其中主要的活性成分是銀杏黃酮[1]。在醫(yī)藥上，黃酮類(lèi)化合物對(duì)預(yù)防和治療早期阿爾茨海默氏病、動(dòng)脈粥樣硬化、腦梗死和其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有特殊效果[2]。因此，銀杏葉總黃酮含量是衡量銀杏葉及相關(guān)藥用制劑品質(zhì)的重要指標(biāo)[3]。在植物中，黃酮類(lèi)化合物是多酚類(lèi)物質(zhì)的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是植物組織中重要的一類(lèi)抗氧化劑。黃酮類(lèi)化合物在植物生長(zhǎng)發(fā)育、防御和適應(yīng)環(huán)境脅迫中發(fā)揮重要作用。

硒(Se)是人體必需的微量元素，也是植物的有益元素[4-6]。研究表明，在各種生物和非生物脅迫下，低濃度硒能顯著提高植物的光合速率，增加生物量，降低重金屬脅迫對(duì)植物的損傷作用[7-9]。陳火云等[10]研究發(fā)現(xiàn)，施硒處理可促進(jìn)油菜生長(zhǎng)，增加籽粒中硒含量并且減少重金屬鎘的積累。李飛等[11]綜述了硒肥對(duì)茶樹(shù)的影響，對(duì)富硒茶品質(zhì)提升具有一定的借鑒意義。王政等[12]研究表明，有機(jī)硒肥與硼肥配施能改善煙葉品質(zhì)，提高煙葉硒含量。在正常栽培條件下，適當(dāng)濃度的硒處理也能提高農(nóng)作物各組織中黃酮和酚類(lèi)物質(zhì)的含量[13-14]。

關(guān)于硒肥對(duì)銀杏葉黃酮含量的影響研究，國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少，相關(guān)研究主要集中于無(wú)機(jī)硒處理對(duì)銀杏初生代謝和次生代謝的影響。陳軍[15]研究表明，低濃度亞硒酸鈉處理可有效促進(jìn)銀杏幼苗生長(zhǎng)，顯著提高葉片黃酮和萜內(nèi)酯含量。研究發(fā)現(xiàn)，亞硒酸鈉葉施和根施處理均能促進(jìn)銀杏幼苗生長(zhǎng)并提高葉片黃酮含量，低濃度無(wú)機(jī)硒對(duì)銀杏葉黃酮合成的影響與黃酮代謝相關(guān)基因PAL(苯丙氨酸解氨酶基因)、CHS(查爾酮合成酶基因)、FLS(黃酮醇合成酶基因)和FOMT(類(lèi)黃酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因)等的表達(dá)量升高有關(guān)[16-17]。而有機(jī)硒處理對(duì)銀杏的影響尚未見(jiàn)報(bào)道，而且有機(jī)硒因具有毒性小、環(huán)保、易被人體吸收等特點(diǎn)，極具研究?jī)r(jià)值。鑒于此，基于前期提高銀杏葉黃酮含量的栽培措施研究成果[18]，結(jié)合磷酸二氫鉀[19]和矮壯素[20]，探討葉施有機(jī)硒肥影響銀杏黃酮合成的生理和分子機(jī)制，為有效利用硒肥提高銀杏葉藥用品質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)，并為富硒地區(qū)銀杏種植業(yè)的健康發(fā)展提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2019年6月在湖北恩施白楊坪銀杏種植基地進(jìn)行，選擇生長(zhǎng)健康且長(zhǎng)勢(shì)一致的4年生銀杏幼苗作為試材。有機(jī)硒(硒含量≥155 μg/g)購(gòu)自寶來(lái)化肥(煙臺(tái))有限公司，矮壯素(≥98%)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，磷酸二氫鉀(≥99%)購(gòu)自河北硅谷肥業(yè)有限公司，槲皮素、山柰酚和異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料處理 待4月銀杏新葉長(zhǎng)出后，將用于試驗(yàn)研究的所有幼苗葉面噴施3.335 g/L磷酸二氫鉀溶液，每處理(120株)噴施5 L，以促進(jìn)銀杏生長(zhǎng)。

試驗(yàn)共設(shè)置7個(gè)葉施處理：無(wú)肥(對(duì)照)，記為CK；有機(jī)硒(0.835 g/L)，記為T(mén)1；低濃度矮壯素(1 g/L)，記為T(mén)2；高濃度矮壯素(2 g/L)，記為T(mén)3；低濃度矮壯素(1 g/L)+有機(jī)硒(0.835 g/L)，記為T(mén)4；高濃度矮壯素(2 g/L)+有機(jī)硒(0.835 g/L)，記為T(mén)5；磷酸二氫鉀(3.335 g/L)+有機(jī)硒(0.835 g/L)，記為T(mén)6。

2019年6月1日對(duì)銀杏進(jìn)行第1次葉施處理，除CK外，分別記為1-T1、1-T2、1-T3、1-T4、1-T5、1-T6，每種處理選擇1列共120株銀杏幼苗，設(shè)置成3個(gè)區(qū)塊(重復(fù))；2019年7月14日將第1次處理的每列銀杏選擇半列共60株進(jìn)行第2次葉施處理，除CK外，分別記為2-T1、2-T2、2-T3、2-T4、2-T5、2-T6，同樣也設(shè)置成3個(gè)區(qū)塊(重復(fù))。從2019年6月15日開(kāi)始采樣，每15 d左右進(jìn)行1次采樣，2019年9月15日完成最后1次采樣。采集的銀杏葉一部分液氮處理后保存于-80 ℃冰箱，另外一部分置于恒溫干燥箱中105 ℃殺酶20 min，65 ℃烘干至恒質(zhì)量，用粉碎機(jī)粉碎，做好標(biāo)記保存于陰涼干燥處[21]，用于檢測(cè)銀杏葉總黃酮含量。

1.2.2 總黃酮含量檢測(cè) 銀杏總黃酮(Total flavonoids，記為F)的主要成分為槲皮素(Quercetin，記為Q)、山柰酚(Kaempferol，記為K)和異鼠李素(Isorhamnetin，記為I)，F(xiàn)含量以Q、K、I含量總和乘以轉(zhuǎn)化系數(shù)2.51表示[22]。Q、K、I、F含量以mg/g表示。所有樣品均按照生物學(xué)重復(fù)測(cè)定3次。Q、K、I含量采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定，參考任紅等[22]試驗(yàn)方案稍作修改。用分析天平準(zhǔn)確稱(chēng)取銀杏葉粉末1 g于250 mL圓底燒瓶中，加入體積比為4∶1的甲醇-25%鹽酸溶液80 mL并稱(chēng)質(zhì)量，80 ℃冷凝回流45 min?；亓鹘Y(jié)束后用色譜級(jí)甲醇補(bǔ)足減少的溶液，趁熱抽濾，取濾液用0.45 μm濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。

1.2.3 部分樣品總RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析 根據(jù)1.2.2中總黃酮含量的測(cè)定結(jié)果，選取總黃酮含量差異較大的1-T1、2-T1、1-T5、2-T5及CK作為供試處理，6月15日、6月30日、7月14日、8月1日、8月15日、8月31日和9月15日每個(gè)處理分別采集5 g葉片樣品，液氮冷凍后放置于-80 ℃?zhèn)溆谩ｃy杏葉片總RNA提取方法參考程水源等[23]的方法略作改進(jìn)。樣品總RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序工作及后期數(shù)據(jù)分析交由北京諾禾致源生物科技有限公司代為完成。將差異表達(dá)基因分別與COG (Cluster of orthologous groups of proteins)、GO (Gene ontology)、KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes)、Swiss-Prot (Swiss-protein)和NR (Nun-redundant)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，并對(duì)相關(guān)基因的功能、類(lèi)別、代謝通路富集情況等進(jìn)行注釋。分別對(duì)銀杏黃酮代謝途徑中PAL、肉桂酸4-羥化酶(C4H)、4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)、CHS、查爾酮異構(gòu)酶(CHI)、異黃酮合成酶(IFS)、黃酮合成酶(FS)、黃烷酮3-羥化酶(F3H)、FLS、柚皮素2-氧戊二酸3-雙加氧酶(FL3H)、槲皮素O-甲基轉(zhuǎn)移酶(OMT)、類(lèi)黃酮3′, 5′羥化酶(F3′5′H)等基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，采用FPKM (Fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped)作為衡量轉(zhuǎn)錄本或基因表達(dá)水平的指標(biāo)[24]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Microsoft Excel軟件和DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示，采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05)，采用Origin軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉施有機(jī)硒、矮壯素和磷酸二氫鉀對(duì)銀杏葉黃酮含量的影響

2.1.1 葉施1次 由圖1可見(jiàn)，第1次葉施處理后，6月15日，與CK相比，1-T2處理銀杏葉槲皮素和異鼠李素含量顯著提高，山柰酚和總黃酮含量也有所提高；1-T3處理銀杏葉槲皮素含量顯著提高，山柰酚、異鼠李素和總黃酮含量也有所提高；1-T1、1-T4、1-T5、1-T6處理銀杏葉槲皮素、異鼠李素和總黃酮含量顯著降低。其中，1-T2、1-T3處理銀杏葉總黃酮含量分別為16.610、16.954 mg/g，分別比CK提高了9.64%、11.91%。

由圖2可見(jiàn)，第1次葉施處理后，6月30日，與CK相比，1-T1處理銀杏葉槲皮素、山柰酚、異鼠李素和總黃酮含量均顯著提高；1-T2、1-T3、1-T4處理銀杏葉槲皮素、山柰酚、異鼠李素和總黃酮含量差異均不顯著；1-T5處理銀杏葉山柰酚、異鼠李素和總黃酮含量均顯著提高，槲皮素含量也有所提高；1-T6處理銀杏葉山柰酚含量顯著提高，槲皮素、異鼠李素、總黃酮含量差異不顯著。其中，1-T1、1-T5處理總黃酮含量分別為19.181、17.167 mg/g，分別比CK提高36.71%、22.36%。

不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，下同Different letters indicate significant differences amongdifferent treatments(P<0.05)，the same below圖1 1次噴施處理后6月15日銀杏葉黃酮含量Fig.1 The flavonoid content of Ginkgo biloba leaves on June 15th after foliar sprayed once

圖2 1次噴施處理后6月30日銀杏葉黃酮含量Fig.2 The flavonoid content of Ginkgo biloba leaves on June 30th after foliar sprayed once

由圖3可見(jiàn)，第1次葉施處理后，7月14日，與CK相比，1-T1處理銀杏葉槲皮素、山柰酚、異鼠李素和總黃酮含量差異均不顯著；1-T2處理銀杏葉山柰酚含量和總黃酮含量顯著提高；1-T3處理銀杏葉異鼠李素含量顯著提高，槲皮素、山柰酚和總黃酮含量也有所提高，但差異不顯著；1-T4處理銀杏葉槲皮素、異鼠李素和總黃酮含量顯著降低；1-T5處理銀杏葉槲皮素、山柰酚、異鼠李素和總黃酮含量均顯著降低；T6處理銀杏葉異鼠李素、槲皮素、山柰酚和總黃酮含量差異不顯著。其中，1-T2、1-T3處理銀杏葉總黃酮含量分別為15.778、14.741 mg/g，分別比CK提高18.52%、10.73%。

圖3 1次噴施處理后7月14日銀杏葉黃酮含量Fig.3 The flavonoid content of Ginkgo biloba leaves on July 14th after foliar sprayed once

由圖4可見(jiàn)，第1次葉施處理后，8月1日，與CK相比，1-T1處理銀杏葉槲皮素、山柰酚、異鼠李素和總黃酮含量都有所提高；1-T2處理銀杏葉異鼠李素含量顯著提高，槲皮素、山柰酚和總黃酮含量也有所提高；1-T3處理銀杏葉山柰酚含量顯著提高，槲皮素、異鼠李素和總黃酮含量也有所提高；1-T4處理銀杏葉山柰酚含量顯著提高，異鼠李素和總黃酮含量也有所提高；1-T5處理銀杏葉山柰酚和異鼠李素含量顯著提高，槲皮素和總黃酮含量也有所提高；1-T6處理銀杏葉槲皮素、山柰酚、異鼠李素和總黃酮含量均顯著提高。1-T1—1-T6處理銀杏葉總黃酮含量依次為10.816、11.960、12.696、10.908、12.612、14.504 mg/g，分別比CK提高4.93%、16.03%、23.17%、5.82%、22.35%、40.71%。

圖4 1次噴施處理后8月1日銀杏葉黃酮含量Fig.4 The flavonoid content of Ginkgo biloba leaves on August 1st after foliar sprayed once

由圖5可見(jiàn)，第1次葉施處理后，8月15日，與CK相比，1-T1處理銀杏葉槲皮素、異鼠李素和總黃酮含量顯著提高；1-T2、1-T4處理銀杏葉山柰酚、槲皮素、異鼠李素、總黃酮含量差異不顯著；1-T3處理銀杏葉槲皮素、山柰酚、異鼠李素和總黃酮含量均顯著提高；1-T5、1-T6處理銀杏葉槲皮素、山柰酚、異鼠李素和總黃酮含量都有所提高，但差異不顯著。其中，1-T1、1-T3、1-T5、1-T6處理銀杏葉總黃酮含量依次為17.785、19.581、15.700、16.247 mg/g，分別比CK提高19.28%、31.33%、5.30%、8.97%。

圖5 1次噴施處理后8月15日銀杏葉黃酮含量Fig.5 The flavonoid content of Ginkgo biloba leaves on August 15th after foliar sprayed once

由圖6可見(jiàn)，第1次葉施處理后，8月31日，與CK相比，1-T1處理銀杏葉槲皮素、山柰酚、異鼠李素和總黃酮含量均顯著提高；1-T2、1-T3、1-T4、1-T5處理銀杏葉山柰酚含量顯著提高，總黃酮含量也有所提高但差異不顯著；1-T6處理銀杏葉槲皮素和異鼠李素含量顯著降低，山柰酚和總黃酮含量有所降低但差異不顯著。其中，1-T1、1-T2、1-T3、1-T4、1-T5處理銀杏葉總黃酮含量依次為18.287、15.035、15.419、15.925、15.683 mg/g，分別比CK提高21.91%、0.23%、2.79%、6.17%、4.55%。

圖6 1次噴施處理后8月31日銀杏葉黃酮含量Fig.6 The flavonoid content of Ginkgo biloba leaves on August 31st after foliar sprayed once

由圖7可見(jiàn)，第1次葉施處理后，9月15日，與CK相比，1-T1處理銀杏葉槲皮素和總黃酮含量顯著提高，山柰酚和異鼠李素含量也有所提高但差異不顯著；1-T2處理銀杏葉槲皮素、山柰酚和總黃酮含量有所提高；1-T3處理銀杏葉山柰酚和總黃酮含量有所提高；1-T4處理銀杏葉山柰酚含量有所提高；1-T5處理異鼠李素含量有所提高；1-T6處理銀杏葉異鼠李素含量顯著提高，槲皮素、山柰酚和總黃酮含量也有所提高。其中，1-T1、1-T2、1-T3、1-T6處理銀杏葉總黃酮含量依次為15.230、13.476、13.642、13.193 mg/g，分別比CK提高17.68%、4.13%、5.41%、1.94%。

圖7 1次噴施處理后9月15日銀杏葉黃酮含量Fig.7 The flavonoid content of Ginkgo biloba leaves on September 15th after foliar sprayed once

2.1.2 葉施2次 由圖8可見(jiàn)，第2次葉施處理后，8月1日，與CK相比，2-T1、2-T4、2-T5處理銀杏葉槲皮素、山柰酚、異鼠李素和總黃酮含量均顯著提高；2-T2處理銀杏葉槲皮素、山柰酚和總黃酮含量顯著提高；2-T3處理銀杏葉槲皮素、異鼠李素和總黃酮含量顯著提高；2-T6處理銀杏葉山柰酚含量顯著提高。2-T1—2-T6各處理銀杏葉總黃酮含量依次為14.846、12.637、12.337、13.162、14.350、11.193 mg/g，分別較CK提高44.02%、22.59%、19.68%、27.69%、39.21%、8.59%。

圖8 2次噴施處理后8月1日銀杏葉黃酮含量Fig.8 The flavonoid content of Ginkgo biloba leaves on August 1st after foliar sprayed twice

由圖9可見(jiàn)，第2次葉施處理后，8月15日，與CK相比，2-T1、2-T2、2-T3處理銀杏葉槲皮素、山柰酚、異鼠李素和總黃酮含量均顯著提高；2-T4處理銀杏葉山柰酚含量有所提高；2-T4、2-T5處理銀杏葉槲皮素、山柰酚、異鼠李素和總黃酮含量與CK差異不顯著；2-T6處理銀杏葉槲皮素、山柰酚和總黃酮含量顯著提高。其中，2-T1、2-T2、2-T3、2-T6處理銀杏葉總黃酮含量依次為20.851、18.457、17.687、17.423 mg/g，分別比CK提高39.86%、23.80%、18.63%、16.86%。

圖9 2次噴施處理后8月15日銀杏葉黃酮含量Fig.9 The flavonoid content of Ginkgo biloba leaves on August 15th after foliar sprayed twice

由圖10可見(jiàn)，第2次葉施處理后，8月31日，與CK相比，2-T1、2-T4、2-T6處理銀杏葉山柰酚含量顯著提高，異鼠李素含量顯著下降，槲皮素和總黃酮含量變化不顯著；2-T2、2-T3、2-T5處理銀杏葉山柰酚和總黃酮含量均顯著提高，異鼠李素含量顯著下降，槲皮素含量變化不顯著。2-T1—2-T6處理總黃酮含量依次為15.943、17.677、17.338、16.034、17.896、16.250 mg/g，分別比CK提高6.29%、17.85%、15.59%、6.89%、19.31%、8.33%。

圖10 2次噴施處理后8月31日銀杏葉黃酮含量Fig.10 The flavonoid content of Ginkgo biloba leaves on August 31st after foliar sprayed twice

由圖11可見(jiàn)，第2次葉施處理后，9月15日，與CK相比，2-T1、2-T6處理銀杏葉槲皮素、山柰酚、異鼠李素和總黃酮含量均顯著提高；2-T2、2-T3、2-T5處理銀杏葉槲皮素、山柰酚、異鼠李素和總黃酮含量差異不顯著；2-T4處理銀杏葉山柰酚、異鼠李素和總黃酮含量均顯著提高，槲皮素含量也有所提高。2-T1—2-T6處理銀杏葉總黃酮含量依次為16.482、13.647、13.515、16.097、14.635、16.599 mg/g，分別比CK提高了27.35%、5.45%、4.43%、24.38%、13.08%、28.26%。

圖11 2次噴施處理后9月15日銀杏葉黃酮含量Fig.11 The flavonoid content of Ginkgo biloba leaves on September 15th after foliar sprayed twice

2.2 葉施有機(jī)硒、矮壯素和磷酸二氫鉀不同處理銀杏葉總黃酮含量變化趨勢(shì)

由圖12可見(jiàn)，CK銀杏葉總黃酮含量呈現(xiàn)降低-升高-降低的變化趨勢(shì)；第1次葉施處理后采集的7批銀杏葉中，1-T1處理銀杏葉總黃酮含量呈升高-降低-升高-降低的變化趨勢(shì)，1-T2、1-T3處理銀杏葉總黃酮含量呈降低-升高-降低-升高-降低的變化趨勢(shì)，1-T4、1-T5、1-T6處理銀杏葉總黃酮含量呈升高-降低-升高-降低的變化趨勢(shì)；第2次葉施處理后采集的4批銀杏葉中，2-T1、2-T6處理銀杏葉總黃酮含量呈升高-降低-升高的變化趨勢(shì)，2-T2、2-T3、2-T5處理銀杏葉總黃酮含量呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，T4處理銀杏葉總黃酮含量呈逐漸升高的變化趨勢(shì)。

圖12 葉施有機(jī)硒、矮壯素和磷酸二氫鉀不同次數(shù)各處理銀杏葉總黃酮含量的動(dòng)態(tài)變化Fig.12 The dynamic changes of total flavonoids content of Ginkgo biloba leaves sprayed with organic selenium, chlorocholine chloride and potassium dihydrogen phosphate for different times

2次葉施處理與1次葉施處理相比，2-T1處理8月1日、8月15日和9月15日的銀杏葉總黃酮含量較1-T1處理分別提高了37.26%、17.24%和8.22%，8月31日的銀杏葉總黃酮含量較1-T1處理降低14.70%；2-T2處理8月1日、8月15日、8月31日和9月15日的銀杏葉總黃酮含量分別比1-T2處理提高5.66%、26.06%、17.57%和1.27%；2-T3處理8月31日的銀杏葉總黃酮含量分別比1-T3處理提高12.45%，8月1日、8月15日和9月15日的銀杏葉總黃酮含量比1-T3處理分別降低2.91%、10.71%和0.94%；2-T4處理8月1日、8月15日、8月31日和9月15日的銀杏葉總黃酮含量分別比1-T4處理提高20.66%、0.72%、0.68%和28.11%；2-T5處理8月1日、8月31日和9月15日的銀杏葉總黃酮含量分別比1-T5處理提高13.78%、14.11%和21.11%，8月15日的銀杏葉總黃酮含量比1-T5處理降低8.34%；2-T6處理8月15日、8月31日和9月15日的銀杏葉總黃酮含量分別比1-T6處理提高7.24%、20.79%和25.82%，8月1日的銀杏葉總黃酮含量比1-T6處理降低29.58%。由此可知，2-T1、2-T2、2-T4、2-T5、2-T6處理銀杏葉的總黃酮含量總體上分別高于1-T1、1-T2、1-T4、1-T5、1-T6，表明2次葉施處理對(duì)于提升銀杏葉總黃酮含量具有重要作用。

由銀杏葉總黃酮含量及其變化趨勢(shì)可知，1次葉施處理下，1-T1處理銀杏葉總黃酮含量在6月30日和8月31日出現(xiàn)峰值，分別是CK的1.367倍和1.219倍；1-T2處理銀杏葉總黃酮含量在6月15日、7月14日和8月31日出現(xiàn)峰值，分別是CK的1.096倍、1.185倍和1.002倍；1-T3處理銀杏葉總黃酮含量在6月15日、7月14日和8月15日出現(xiàn)峰值，分別是CK的1.119倍、1.107倍和1.313倍；1-T4處理銀杏葉總黃酮含量在6月30日和8月31日出現(xiàn)峰值，分別是CK的1.008倍和1.062倍；1-T5處理銀杏葉總黃酮含量在6月30日和8月15日出現(xiàn)峰值，分別是CK的1.224倍和1.053倍；1-T6處理銀杏葉總黃酮含量在6月30日和8月15日出現(xiàn)峰值，分別是CK的0.992倍和1.090倍。2次葉施處理下，2-T1處理銀杏葉總黃酮含量在8月15日和9月15日出現(xiàn)峰值，分別是CK的1.399倍和1.274倍；2-T2處理銀杏葉總黃酮含量在8月15日出現(xiàn)峰值，是CK的1.238倍；2-T3處理銀杏葉總黃酮含量在8月15日出現(xiàn)峰值，是CK的1.186倍；2-T4處理銀杏葉總黃酮含量在9月15日出現(xiàn)峰值，是CK的1.244倍；2-T5處理銀杏葉總黃酮含量在8月31日出現(xiàn)峰值，是CK的1.193倍；2-T6處理銀杏葉總黃酮含量在8月15日和9月15日出現(xiàn)峰值，分別是CK的1.169倍和1.283倍。結(jié)合銀杏幼苗的生長(zhǎng)周期和銀杏葉總黃酮含量來(lái)看，銀杏基地的銀杏葉每年可進(jìn)行多次采樣。1次葉施處理下，1-T1處理最佳采樣期在6月末和8月末；1-T2處理最佳采樣期在6月中旬、7月中旬和8月末；1-T3處理最佳采樣期在6月中旬、7月中旬和8月中旬；1-T4處理最佳采樣期在6月中旬和8月末；1-T5處理最佳采樣期在6月末和8月中旬；1-T6處理最佳采樣期在6月末和8月中旬。2次葉施處理下，2-T1處理最佳采樣期在8月中旬；2-T2處理最佳采樣期在8月中旬；2-T3處理最佳采樣期在8月中旬；2-T4處理最佳采樣期在8月初和8月末；2-T5處理最佳采樣期在8月初和8月末；2-T6處理最佳采樣期在8月中旬。

所有處理中，有機(jī)硒處理(T1)對(duì)大田銀杏葉總黃酮含量的提升效果在整體上達(dá)到最優(yōu)水平。其中，有機(jī)硒1次葉施處理下6月30日、8月1日、8月15日、8月31日和9月15日的銀杏葉總黃酮含量比CK分別提高了36.71%、4.93%、19.28%、21.91%和17.68%；有機(jī)硒2次葉施處理下8月1日、8月15日、8月31日和9月15日的銀杏葉總黃酮含量比CK分別提高了44.02%、39.86%、6.29%和27.35%。因此，為了獲得高總黃酮含量的銀杏葉，推薦在銀杏幼苗種植基地推廣使用有機(jī)硒對(duì)銀杏進(jìn)行葉面噴施。

2.3 葉施有機(jī)硒、矮壯素和磷酸二氫鉀不同處理對(duì)銀杏黃酮合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

為檢測(cè)有機(jī)硒處理對(duì)銀杏黃酮合成相關(guān)基因的影響，分別選取CK及總黃酮含量提升較為明顯的1-T1、1-T5、2-T1和2-T5處理銀杏葉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并分析相關(guān)基因的表達(dá)水平變化趨勢(shì)(圖13)。

1-T1處理銀杏葉PAL基因在6月15日—7月14日和9月15日的表達(dá)水平高于CK；C4H基因在6月15日—7月14日的表達(dá)水平高于CK，6月30日達(dá)到最高峰；4CL基因在7月14日和8月15日的表達(dá)水平明顯高于CK，并在7月14日達(dá)到最高；CHS基因在6月15日達(dá)到最高表達(dá)水平，之后逐漸下降。相對(duì)于CK，CHI基因表達(dá)水平在6月15—30日、8月15—31日較高，并在8月15日和8月31日達(dá)到2個(gè)高峰；OMT基因表達(dá)水平在7月14日和8月15日較高，并在7月14日達(dá)到最高；FLS基因在7月14日—8月15日的表達(dá)水平明顯高于CK，在8月15日達(dá)到最高；IFS基因的表達(dá)高峰在7月14日，相較于CK延遲了30 d左右。1-T1處理其他基因表達(dá)水平相對(duì)于CK無(wú)明顯變化。

圖13 銀杏葉中黃酮合成相關(guān)基因表達(dá)水平變化趨勢(shì)Fig.13 Trends of genes expression level related to the synthesis of total flavonoids of Ginkgo biloba leaves

2-T1處理銀杏葉PAL基因表達(dá)水平在6月15日即達(dá)到最高峰；而C4H基因和F3′5′H基因表達(dá)水平則在7月14日達(dá)到最高，前者比CK提前30 d左右，后者比CK延遲15 d左右；4CL基因表達(dá)水平在7月14日和8月15日達(dá)到2個(gè)高峰，并且高于CK；CHS基因表達(dá)水平在8月1日達(dá)到最高；FS基因表達(dá)量則在7月14日達(dá)到最高；OMT、FLS、FL3H和IFS基因表達(dá)水平在8月15日達(dá)到最高，后期逐漸下降；F3H基因表達(dá)水平則在8月31日和9月15日達(dá)到最高，且明顯高于CK。

1-T5處理銀杏葉C4H基因表達(dá)水平在7月14日達(dá)到最高，比CK提前30 d左右；CHI基因表達(dá)水平則在8月15日達(dá)到最高；IFS基因在6月15日出現(xiàn)表達(dá)高峰，與CK一致。其他基因表達(dá)水平與CK無(wú)明顯差異。

2-T5處理銀杏葉PAL基因表達(dá)水平在8月1日達(dá)到最高峰；4CL和CHS基因表達(dá)水平則在6月30日達(dá)到最高；CHI基因和F3′5′H基因表達(dá)水平在8月15日達(dá)到最高峰，明顯高于CK，之后逐漸下降；OMT基因表達(dá)水平在7月14日達(dá)到最高峰，比CK提前15 d左右。在6月30日和7月14日，F(xiàn)LS基因表達(dá)水平高于CK，并在7月14日達(dá)到最高峰。其他基因表達(dá)水平與CK相比無(wú)明顯差異。

3 結(jié)論與討論

本研究顯示，有機(jī)硒、矮壯素和磷酸二氫鉀葉施1次與2次處理對(duì)大田環(huán)境下銀杏葉總黃酮含量的提升效果不盡相同。由于銀杏葉中總黃酮含量是判斷葉片質(zhì)量的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)，故提高總黃酮含量是提升銀杏葉品質(zhì)的關(guān)鍵所在。本研究中，有機(jī)硒噴施處理效果最為突出，尤其是2次葉施處理下，銀杏葉黃酮含量較CK最高可提高44.02%，極大地提升了銀杏葉的藥用價(jià)值。

植物可將無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化成有機(jī)硒，其中一部分有機(jī)硒為次生代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化提供物質(zhì)基礎(chǔ)，另一部分有機(jī)硒可促進(jìn)植物次生代謝過(guò)程中關(guān)鍵酶的合成，進(jìn)而增加相關(guān)次生代謝產(chǎn)物的累積，還有一部分有機(jī)硒則與植物的次生代謝產(chǎn)物結(jié)合[25]。陳軍[15]研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度亞硒酸鈉以不同方式處理盆栽銀杏后，均可有效提高葉片黃酮含量，其中以15 mg/盆亞硒酸鈉溶液處理效果最佳，葉施、根澆、混合施加處理下銀杏葉總黃酮含量分別提高了89.3%、20.8%、56.9%，這與本研究中有機(jī)硒肥處理可顯著提高大田銀杏葉總黃酮含量的結(jié)果一致。相比之下，無(wú)機(jī)硒對(duì)人體和植物的毒害作用較大，對(duì)環(huán)境造成的污染嚴(yán)重，而有機(jī)硒則顯得安全可靠，更利于植物健康生長(zhǎng)。因此，建議大田栽種的銀杏幼苗可采用噴施有機(jī)硒代替無(wú)機(jī)硒，此法既可以達(dá)到提高銀杏葉總黃酮含量的目的，又可以保證銀杏產(chǎn)量。

矮壯素可由葉片吸收進(jìn)入植物體內(nèi)，矮化植物，增強(qiáng)植物的抗逆性，提高產(chǎn)量[20,26]。CHENG等[18]研究認(rèn)為，葉面噴施矮壯素、脫落酸和乙烯利后，銀杏葉總黃酮含量均可提高，以矮壯素的提升作用最佳，總黃酮含量提高20.06%，究其原因，一方面是矮壯素可促進(jìn)銀杏光合作用，合成更多初生代謝產(chǎn)物，為次生代謝產(chǎn)物的合成提供物質(zhì)基礎(chǔ)；另一方面，矮壯素能顯著降低銀杏葉中赤霉素含量以及吲哚乙酸與脫落酸比例、吲哚乙酸與乙烯利比例、赤霉素與脫落酸比例、赤霉素與乙烯利比例。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度矮壯素、高濃度矮壯素、低濃度矮壯素與有機(jī)硒組合、高濃度矮壯素與有機(jī)硒組合葉施處理均可顯著提高大田銀杏葉總黃酮含量，與CHENG等[18]結(jié)果一致，與CK相比，4種處理下最高可將銀杏葉總黃酮含量分別提高23.80%、31.33%、27.69%、39.21%。

提高銀杏葉黃酮含量的施肥措施包括葉面施肥和根部施肥處理，肥料則包含有機(jī)肥和無(wú)機(jī)肥。根施一定量氮、磷、鉀肥可以明顯提高銀杏葉黃酮含量，但不同種植條件和不同施肥方案會(huì)對(duì)黃酮含量產(chǎn)生不同的影響[27-30]；另有研究表明，施用有機(jī)肥可以顯著提高銀杏葉總黃酮含量，而且效果優(yōu)于無(wú)機(jī)肥[31-32]。葉面噴施金屬離子肥料可提高盆栽銀杏苗葉片的總黃酮含量，同時(shí)銀杏的最佳采葉時(shí)期延長(zhǎng)，0.1% FeSO4、0.2% ZnSO4、0.3% MnSO4和0.4% CuSO4處理下效果最佳[33]；噴施鎂肥降低了總黃酮含量，噴施高質(zhì)量濃度(5 g/mL)鋅肥對(duì)總黃酮含量的提升作用最佳，噴施低質(zhì)量濃度(0.5 g/mL)鉬肥對(duì)總黃酮含量的提升作用最佳[34]。相較而言，大田條件下采用葉施有機(jī)肥具有易于操作、毒性低、對(duì)環(huán)境更加友好等優(yōu)勢(shì)。

硒是植物生長(zhǎng)的有益元素，同時(shí)也對(duì)植物初級(jí)和次生代謝產(chǎn)物含量有一定影響。雷紅靈等[35]采用25～200 mg/L硒對(duì)藤茶葉面進(jìn)行噴硒，8～32 d后其黃酮、可溶性糖、可溶性蛋白、游離氨基酸含量均表現(xiàn)為先上升后下降，最大值均出現(xiàn)在硒質(zhì)量濃度150 mg/L處理后20 d的藤茶樣品中。陳軍[15]對(duì)銀杏幼苗不同部位施硒發(fā)現(xiàn)，施硒可以顯著提高銀杏葉黃酮和內(nèi)酯含量，但硒對(duì)銀杏葉黃酮和內(nèi)酯含量的影響機(jī)制目前尚不明確，可能是施用硒調(diào)節(jié)了黃酮和內(nèi)酯合成過(guò)程中主要相關(guān)酶的活性，從而影響了黃酮和內(nèi)酯的合成。本研究中，采用有機(jī)硒對(duì)大田銀杏幼苗進(jìn)行1次和2次葉施處理，2次處理的間隔期為45 d，都能顯著提高銀杏葉總黃酮含量。同時(shí)，有機(jī)硒處理后PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、FS、F3′5′H、OMT、F3H、FL3H和FLS等基因表達(dá)量明顯提升，其中，PAL、C4H、UFGT和CHI等基因的表達(dá)高峰提前達(dá)到；4CL、CHS和FLS等基因則一直保持較高表達(dá)水平。前期研究表明，銀杏葉總黃酮含量與GbPAL(銀杏苯丙氨酸解氨酶)、GbCHS (銀杏查爾酮合成酶)活性及其基因表達(dá)量之間存在顯著正相關(guān)，GbPAL、GbCHS和GbCHI基因的表達(dá)水平可能決定了銀杏葉總黃酮的積累[36-39]。FLS(黃酮醇合成酶)催化二氫黃酮醇發(fā)生去飽和反應(yīng)，生成黃酮醇、琥珀酸鹽、二氧化碳和水。銀杏中，GbFLS (銀杏黃酮醇合成酶)還可以直接以柚皮素作為底物，催化系列反應(yīng)生成黃酮醇，GbFLS基因表達(dá)水平與總黃酮含量密切相關(guān)[40]。因此，推測(cè)有機(jī)硒通過(guò)提高PAL、4CL、CHS、CHI和FLS等總黃酮合成相關(guān)基因的表達(dá)水平來(lái)提高葉片總黃酮含量。

綜合來(lái)看，根部施肥和葉面施肥均能提高銀杏葉總黃酮含量，鑒于大田環(huán)境下銀杏幼苗的種植面積、生存環(huán)境和管理方式等因素，葉面施肥比根部施肥更便于操作，節(jié)約成本，更利于保護(hù)環(huán)境。而且，本研究中采用的葉面施肥處理顯著提高了銀杏葉總黃酮含量，故建議大田栽種的銀杏幼苗可采用葉面施肥代替根部施肥。有機(jī)硒一次葉施處理下6月30日、8月1日、8月15日、8月31日、9月15日采樣的銀杏葉總黃酮含量較CK分別提高36.71%、4.93%、19.28%、21.91%、17.68%；有機(jī)硒2次葉施處理下8月1日、8月15日、8月31日、9月15日采樣的銀杏葉總黃酮含量較CK分別提高44.02%、39.86%、6.29%、27.35%。因此，推薦在銀杏幼苗種植基地推廣使用有機(jī)硒對(duì)銀杏葉進(jìn)行葉面噴施并進(jìn)行分級(jí)分次采收，以獲得更好的銀杏葉片質(zhì)量。