邢瀚文，陶 虹，趙玉瓊,牛世博，李 霞，羅 彥,4

消化系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)在中暑或運(yùn)動(dòng)引起的熱應(yīng)激情況下，腸道黏膜屏障發(fā)生損傷，通透性增加，引起腸道內(nèi)細(xì)菌入血，這可能與熱應(yīng)激時(shí)的菌血癥有關(guān)[1]，而食管作為連接口腔和胃的器官，在吞咽食物的過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，食管黏膜上皮細(xì)胞層是保護(hù)食管免受食物的機(jī)械損傷或胃內(nèi)反流物化學(xué)損傷的重要屏障。若將食管組織黏膜面直接暴露在模擬熱飲的48 ℃環(huán)境下，食管黏膜上皮的間隙變大，電阻變小，提示黏膜上皮功能屏障功能受損[2]。而在慢性束縛應(yīng)激的小鼠食管發(fā)現(xiàn)，與上皮細(xì)胞屏障功能有關(guān)的緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的表達(dá)發(fā)生改變，同時(shí)應(yīng)激時(shí)具有致炎和抗炎雙重作用的蛋白酶切激活受體-2(PAR-2)及其激活劑來(lái)源肥大細(xì)胞數(shù)目在食管或腸道中也發(fā)生了改變，它們可通過(guò)引起炎癥或氧化應(yīng)激來(lái)影響上皮細(xì)胞的功能[3]。那么在熱暴露引起的熱應(yīng)激情況下，食管黏膜上皮緊密連接蛋白及PAR-2又是如何變化的呢。本研究通過(guò)建立大鼠熱暴露的動(dòng)物模型，觀察熱暴露引起的熱應(yīng)激情況下大鼠食管組織緊密連接蛋白Occludin和ZO-1，PAR-2的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 建立大鼠熱暴露模型：8只成年雄性SD 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和熱暴露組(每組4只)，體重190～200 g，各組大鼠分別正常飼養(yǎng)3 d 后，熱暴露組開(kāi)始在人工氣候倉(cāng)內(nèi)進(jìn)行適應(yīng)性熱暴露2 h(32 ℃)/d，6 h(32 ℃)/d,14 h(32 ℃)/d,18 h(32 ℃)/d，共4 d，從第8天開(kāi)始持續(xù)進(jìn)行熱暴露24 h(32 ℃)共10 d，對(duì)照組始終正常飼養(yǎng)。每天記錄大鼠體重、飲食、飲水變化，觀察大鼠一般狀況。

1.2 大鼠食管組織石蠟切片：10%水合氯醛麻醉(0.3 mL/100 g)大鼠后，開(kāi)胸，用小鑷子原位游離分離頸胸段食管后，剪斷。在生理鹽水中反復(fù)沖洗使組織上無(wú)血液附著，小心去除附著的結(jié)締組織，濾紙吸干水分后投入4%多聚甲醛固定。經(jīng)過(guò)固定的組織樣本經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明以后，55 ℃左右石蠟包埋，常規(guī)4 μm切片，貼于處理過(guò)的載玻片上，溫箱中烤片過(guò)夜后，收集至載片盒中保存。進(jìn)行常規(guī)HE染色。

1.3 免疫組織化學(xué)染色：石蠟包埋食管組織進(jìn)行4 μm切片，60 ℃烤片1 h 后，進(jìn)行二甲苯脫蠟，水化，3%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性生物素，微波修復(fù)，Occludin和ZO-1用EDTA抗原修復(fù)液進(jìn)行微波修復(fù)，PAR-2用枸櫞酸鹽抗原修復(fù)液進(jìn)行修復(fù)。然后兔抗occludin(1∶200,Abcam,ab216327),兔抗ZO-1(1∶500,Bioss,bs-1329-R),兔抗PAR-2(1∶250,Bioss,bs1178R)，4 ℃過(guò)夜，β-actin 為內(nèi)參，免疫組化試劑盒進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 Western blot實(shí)驗(yàn)：研磨缽中倒入少許液氮預(yù)冷，稱取食管組織，在液氮中盡量將食管組織研磨碎，待液氮揮發(fā)后，將食管組織倒入1.5 mL離心管中，管中預(yù)先根據(jù)重量體積比加入了預(yù)冷的裂解液。后將離心管置于渦旋振蕩器上充分震蕩裂解，每次震蕩30 s，重復(fù)3次，在低溫高速離心機(jī)中以12 000 rpm 的速度離心5 min，離心完成后小心吸取上清液，根據(jù)BCA法進(jìn)行蛋白定量，之后按樣品∶loading-buffer= 4∶1 的比例加入 Loading-buffer，100 ℃熱水加熱變性。anti-Occludin(1∶1 000,Abcam,ab216327),anti-ZO-1(1∶500,Bioss,bs-1329-R),anti-PAR-2(1∶500,Bioss,bs1178R)，4 ℃過(guò)夜，二抗室溫1 h，ECL顯色。用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1 熱暴露后大鼠一般情況及體重變化：對(duì)照組與熱應(yīng)激組大鼠均正常存活，隨著飼養(yǎng)時(shí)間的增加，2組大鼠的體重均持續(xù)增長(zhǎng),而從持續(xù)24 h熱暴露(第9天)開(kāi)始，熱應(yīng)激組大鼠體重增長(zhǎng)比對(duì)照組多一點(diǎn)，但與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 熱暴露后大鼠食管組織學(xué)改變：食管組織進(jìn)行HE染色，可見(jiàn)在食管腔面有角化細(xì)胞層，接著是多層多角形的鱗狀細(xì)胞，基底層可見(jiàn)顆粒細(xì)胞，熱暴露后，食管上皮未見(jiàn)明顯缺失和結(jié)構(gòu)異常。

2.3 熱暴露后大鼠組織緊密連接蛋白Occludin、ZO-1和PAR-2的表達(dá)：從免疫組織化學(xué)染色結(jié)果看到緊密連接蛋白Occludin主要表達(dá)于食管黏膜復(fù)層扁平上皮細(xì)胞層，定位于細(xì)胞膜上，且熱暴露后陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少；ZO-1主要表達(dá)于復(fù)層扁平細(xì)胞的細(xì)胞核,熱暴露后表達(dá)不變或輕度增加；PAR-2主要表達(dá)于食管黏膜上皮細(xì)胞，定位于細(xì)胞漿，熱暴露后黏膜上皮細(xì)胞層PAR-2表達(dá)下降，見(jiàn)圖1(封三)。

取食管組織進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，熱暴露后食管組織PAR-2表達(dá)減少，緊密連接蛋白Occludin表達(dá)下降，ZO-1表達(dá)升高,對(duì)照組PAR-2的灰度值是0.349±0.0765，熱暴露后下降為0.264±0.0392，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),Occludin的蛋白灰度值為1.354±0.520，熱暴露后為0.753±0.436(P<0.05)，ZO-1的表達(dá)從0.245±0.103升高為0.666±0.233，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2。

3 討論

消化道黏膜上皮形成了一層分隔消化道內(nèi)容物和內(nèi)環(huán)境的屏障，該屏障選擇性地過(guò)濾腸內(nèi)容物，同時(shí)防止腸內(nèi)有害病原微生物或抗原進(jìn)入循環(huán)，其中位于細(xì)胞和細(xì)胞之間的緊密連接對(duì)于維持屏障功能的完整性尤為重要，可通過(guò)調(diào)節(jié)緊密連接蛋白來(lái)調(diào)節(jié)黏膜的屏障功能[4]。而緊密連接蛋白中的跨膜屏障蛋白 claudins，occludin 等能促進(jìn)細(xì)胞粘附及形成細(xì)胞旁屏障。胞漿內(nèi)“腳手架蛋白”(ZO)對(duì)于緊密連接的形成和細(xì)胞極性的調(diào)節(jié)而言非常重要。研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激可降低育肥豬空腸Occludin和ZO-1的表達(dá)[5]。本研究也發(fā)現(xiàn)，在熱暴露的大鼠食管組織上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白Occludin表達(dá)下降，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少，而Occludin是形成細(xì)胞緊密連接及維持細(xì)胞屏障功能的重要蛋白，它的表達(dá)下降，提示細(xì)胞緊密連接減少，細(xì)胞屏障功能減弱，這與其他研究結(jié)果一致。同時(shí)，我們觀察到另一個(gè)重要的細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1表達(dá)升高，這與其他類似研究不一致，可能與熱暴露時(shí)間及模式不同有關(guān)。而與對(duì)照組相比，大鼠食管組織學(xué)觀察沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的損害，這與之前的研究一致，當(dāng)兔食管組織暴露于40℃時(shí)，無(wú)論暴露時(shí)間長(zhǎng)短，均不會(huì)造成組織學(xué)改變[6]。同時(shí)，熱暴露組大鼠的體重增長(zhǎng)與對(duì)照組大鼠相比也沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此，本研究中熱暴露沒(méi)有明顯改變大鼠生長(zhǎng)情況，在沒(méi)有對(duì)食管黏膜組織造成明顯組織學(xué)改變的情況下，熱暴露引起的熱應(yīng)激也可改變食管上皮緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的表達(dá)，從而影響食管上皮細(xì)胞的屏障功能。

蛋白酶切激活受體-2(PAR-2)是蛋白酶切激活受體家族的一員，具備多種生物學(xué)功能，具有致炎和抗炎的雙重作用，它被肥大細(xì)胞來(lái)源的類胰蛋白酶激活。在大鼠避水應(yīng)激時(shí)，腸道黏膜PAR-2表達(dá)上調(diào)，肥大細(xì)胞數(shù)目增加，緊密連接蛋白表達(dá)下調(diào)[7]。當(dāng)慢性束縛應(yīng)激時(shí)，小鼠食管上皮屏障功能紊亂，表現(xiàn)為細(xì)胞間隙增大，某些緊密連接蛋白表達(dá)降低，并且肥大細(xì)胞數(shù)目與PAR-2表達(dá)也升高[3]。當(dāng)抗氧化物質(zhì)表達(dá)下降時(shí)，食管及血漿中炎性因子水平顯著升高[8]，提示肥大細(xì)胞來(lái)源的類胰蛋白酶激活PAR-2可能參與了應(yīng)激后食管上皮細(xì)胞屏障功能紊亂。本研究中發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激后食管上皮細(xì)胞PAR-2表達(dá)下降，這一不同可能與應(yīng)激的種類和程度不同以及器官功能特異性有關(guān)。食管的結(jié)構(gòu)與消化道其他地方不同，與胃和腸道相比，具備獨(dú)特的黏膜下腺體，黏膜下神經(jīng)叢，對(duì)于應(yīng)激和損傷的反應(yīng)因此也可能有所不同[9-10]。而對(duì)于慢性應(yīng)激的刺激，近端結(jié)腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸PAR-2及肥大細(xì)胞的變化確實(shí)存在區(qū)域差異[11]。

屏障功能紊亂一方面可能引起腸道內(nèi)微生物重定植，比如熱暴露引起的熱應(yīng)激會(huì)損傷腸黏膜屏障，引起菌血癥；另一方面，慢性應(yīng)激會(huì)增加小鼠食管炎性介質(zhì)，促進(jìn)氧化應(yīng)激，參與內(nèi)臟高敏感性的發(fā)生[1]，或者引起應(yīng)激性潰瘍[12]。因此研究應(yīng)激情況下引起屏障功能改變的機(jī)制非常重要，本研究沒(méi)有探討熱暴露引起的熱應(yīng)激大鼠食管上皮緊密連接蛋白和PAR-2表達(dá)改變的詳細(xì)機(jī)制，而在應(yīng)激情況下，糖皮質(zhì)激素會(huì)抑制皮膚表皮層細(xì)胞的增殖和分化，減弱屏障功能的穩(wěn)定性,減少角質(zhì)層的完整[13]。腎上腺素通過(guò)作用于β-1,2,3受體,減弱皮膚成纖維細(xì)胞的活動(dòng)[14]，臨床研究也發(fā)現(xiàn)感染性休克的病人去甲腎上腺素的使用與腸細(xì)胞的損害有關(guān)[15]。因此，應(yīng)激時(shí)各種體液因素可能參與了對(duì)食管上皮緊密連接蛋白及PAR-2表達(dá)的調(diào)控，但需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。