趙建平 吳麗敏 魯曉娜 王輝 王潘 張振強 徐江雁 謝治深

摘 要 目的：研究白術(shù)乙醇提取物（AM）對秀麗隱桿線蟲（簡稱“N2線蟲”）壽命的影響，并基于轉(zhuǎn)錄因子SKN-1/核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）信號通路探討其作用機制。方法：將N2線蟲分為空白對照組、陽性對照組（100 μmol/L姜黃素，下同）和AM低、中、高劑量組（100、200、300 μg/mL，下同），考察正常、氧化應(yīng)激（40 mmol/L H2O2）條件下AM對N2線蟲壽命的影響（以平均存活時間計）以及正常條件下AM對N2線蟲繁殖能力的影響（以子代數(shù)量計）。用700 μmol/L H2O2建立小鼠神經(jīng)瘤母細胞N2a氧化應(yīng)激模型，采用MTT法考察陽性對照和AM低、中、高劑量對模型細胞存活率的影響。人胚胎腎上皮細胞293T轉(zhuǎn)染Nrf2-抗氧化反應(yīng)元件（ARE）質(zhì)粒后，采用熒光素酶報告基因法考察陽性對照和AM低、中、高劑量作用24 h以及AM中劑量作用12、18、24 h對Nrf2-ARE熒光素酶活性的影響。采用實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法考察陽性對照和AM低、中、高劑量對N2a細胞中Nrf2下游抗氧化基因NQO-1、HO-1 mRNA表達以及對N2線蟲中SKN-1下游抗氧化基因GCS-1、GST-7、GST-10、HSP-60、HSP-16.2、SOD-3 mRNA表達的影響。結(jié)果：與空白對照組比較，陽性對照組和AM各劑量組N2線蟲在正常、氧化應(yīng)激下的平均存活時間均顯著延長，第1天子代數(shù)量（除AM高劑量組外）、第2天子代數(shù)量（除AM低劑量組外）和總子代數(shù)量（除AM低劑量組外）均顯著增加（P<0.05或P<0.01）。陽性對照組和AM中、高劑量組N2a細胞存活率顯著高于模型組（P<0.05或P<0.01）。與空白對照組比較，陽性對照組和AM各劑量組293T細胞中Nrf2-ARE熒光素酶相對活性以及AM中劑量組293T細胞培養(yǎng)不同時間的Nrf2-ARE熒光素酶相對活性均顯著增強（P<0.01），并有劑量依賴性和時間依賴性趨勢。與空白對照組比較，陽性對照組和AM各劑量組N2a細胞/線蟲中HO-1、NQO-1（除陽性對照組外）、GCS-1（除AM低劑量組外）、GST-7（除陽性對照組和AM低劑量組外）、GST-10、HSP-60（除AM低劑量組外）、HSP-16.2（除陽性對照組和AM低劑量組外）、SOD-3（除陽性對照組和AM低劑量組外）mRNA的相對表達量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：AM可延長N2線蟲在正常和氧化應(yīng)激狀態(tài)下的壽命，并可提高線蟲的繁殖能力，其作用機制可能與激活SKN-1/Nrf2信號通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞 白術(shù);乙醇提取物;秀麗隱桿線蟲;壽命;氧化應(yīng)激;核因子E2相關(guān)因子2;SKN-1

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the effects of Atractylodes macrocephala ethanol extract （AM） on life span of Caenorhabditis elegans （called N2 nematode for short）， and to investigate its mechanism based on transcription factor SKN-1/nuclear factor E2 related factor 2 （Nrf2）. METHODS： N2 nematode were divided into blank control group， positive control group （100 μmol/L curcumin， similarly hereinafter）， AM low-dose， medium-dose and high-dose groups （100， 200， 300 μg/mL， similarly hereinafter）. The effects of AM on the life span （by average survival time） of N2 nematode under normal condition and oxidant stress condition （40 mmol/L H2O2） as well as its effects on reproductive capability? （by the number of filial generation） of N2 nematode under normal condition were investigated. 700 μmol/L H2O2 was used to establish neuroblastoma cells N2a oxidant stress model. Effects of positive control， low-dose， medium-dose and high-dose of AM on the survival rate of model cells were detected by MTT method. After human embryonic renal epithelial cells 293T were transfected with Nrf2-ARE plasmid， the effects of positive control and AM on luciferase activity of Nrf2-ARE were detected by luciferase reporter gene method at low， medium and high dose for 24 h and at medium dose for 12， 18 and 24 h. RT-PCR was used to detect the effects of positive control， low-dose， medium-dose and high-dose of AM on the mRNA expression of downstream genes NQO-1 and HO-1 of Nrf2 in N2a cells as well as mRNA expression of downstream genes GCS-1， GST-7， GST-10， HSP-60， HSP- 16.2 and SOD-3 of SKN-1 in N2 nematode. RESULTS： Compared with blank control group， average survival time of N2 nematode under normal and oxidant stress condition was significantly prolonged in positive control group and AM groups; the number of filial generation on the first day （except for AM high-dose group）， the number of filial generation on the second day （except for AM low-dose group） and the total number of filial generation （except for AM low-dose group） were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. The survival rate of N2a cells in positive control group， AM medium-dose and high-dose groups were significantly higher than that of model group （P<0.05 or P<0.01）. Compared with blank control group， Nrf2-ARE luciferase relative activity of 293T cells in positive control group and AM groups as well as Nrf2-ARE luciferase relative activity of 293T cells in AM medium-dose group after different time of treatment were increased significantly （P<0.01）， in dose-dependent and time-dependent trend. Compared with blank control group， mRNA relative expression of HO-1 and NQO-1 （except for positive control group）， GCS-1（except for AM low-dose group）， GST-7 （except for positive control group and AM low-dose group）， GST-10 and HSP-60 （except for AM low-dose group）， HSP-16.2 （except for positive control group and AM low-dose group） and SOD-3 （except for positive control group and AM low-dose group） were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： AM can prolong the life span of N2 nematode under normal and oxidant stress condition and improve the its reproductive capacity， the mechanism of which may be associated with the activation of SKN-1/Nrf2 signaling pathway.

KEYWORDS? ?Atractylodes macrocephala; Ethanol extract; Caenorhabditis elegans; Life span; Oxidant stress; Nrf2; SKN-1

中藥白術(shù)為菊科植物白術(shù)Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。該藥味苦、甘，性溫，歸脾、胃經(jīng)，具有補氣健脾、利水燥濕、安胎的功效，被譽為“脾臟補氣健脾第一要藥”[1-2]。唐《新修本草》載“白術(shù)作煎餌，久服輕身延年，不饑”，可見自古以來就有關(guān)于白術(shù)延長壽命的記載[3]，但其作用機制尚不明確。

常用的模型動物如小鼠、大鼠等因壽命長、研究成本高、個體差異大等因素的限制，不適用于中藥延壽作用的研究。秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans具有壽命短、繁殖周期快、子代數(shù)目多、飲食單一可控、基因組序列完整且與哺乳動物同源基因多的特點，是研究衰老和壽命的良好模型，可用于延壽藥物的高通量篩選[4-7]。H2O2是常見的氧化劑，常用來誘導(dǎo)氧化自由基的產(chǎn)生，其作用于小鼠神經(jīng)瘤母細胞N2a造成的氧化損傷是一種常用的體外氧化應(yīng)激模型[8]。人胚腎細胞293T是一種工具細胞，常用于檢測外源基因的表達水平。SKN-1是一種非常重要的轉(zhuǎn)錄因子，既影響氧壓力抗性又調(diào)控衰老[9];核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）-抗氧化反應(yīng)元件（ARE）通路是機體抵御氧化應(yīng)激的內(nèi)在機制[10]?；诖?，本文參考文獻[11]方法用95%乙醇對白術(shù)進行提取，研究了白術(shù)乙醇提取物（AM）在正常和氧化應(yīng)激條件下對秀麗隱桿線蟲壽命的影響，并選用N2a細胞和293T細胞在分子水平上基于SKN-1/Nrf2通路探討AM延長壽命的作用機制，旨在為深入研究白術(shù)提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：Series Ⅱ Water Jackxet 型CO2細胞培養(yǎng)箱和Multiskan GO型全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）、FLUO star OPTIMA型多功能酶標(biāo)儀（德國BMG Labtech公司）、SW-CJ-ZF型超凈工作臺（蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司）、Eclipset S100型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）、SMZ-168型體式顯微鏡（中國麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）、Microfuge 20R型冷凍離心機（美國Beckman Coulter公司）、7500 Fast型實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（美國ABI公司）。

1.2 主要藥品與試劑

白術(shù)飲片購自河南省焦作市，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)付鈺副教授鑒定為菊科植物白術(shù)A. macrocephala Koidz.的干燥根莖，憑證樣本（編號BZ1810）已保存于河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)科學(xué)院。

姜黃素對照品（批號C10372682，純度≥99.7%）和MgSO4（批號C10238019）均購自上海麥克林生化科技有限公司，瓊脂粉、酵母粉、膽固醇、胰蛋白胨、青-鏈霉素混合液、MTT試劑、胰酶、NaCl（批號分別為310C023、106L054、LK40Q28、325D051、20191126、725C056、20191128、726F0315）均購自北京索萊寶科技有限公司，CaCl2（批號SLBK1794V）購自美國Sigma-Aldrich公司，Na2HPO4·12H2O、KH2PO4（批號分別為20160219、20160226）均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，DMEM高糖培養(yǎng)基（批號10013031）購自美國Corning公司，胎牛血清（批號42Q0682K）購自美國Gibco公司，H2O2（批號I1422134）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，PolyJet體外轉(zhuǎn)染試劑（批號61758）購自深圳恩科生物科技有限公司，熒光素酶報告基因試劑盒（批號0000312919）購自美國Promega公司，BeyoRTTM Ⅲ First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號103118190503）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Power UpTM SYBRTM Green Master Mix試劑盒（批號00837276）和Trizol Reagent（批號229009）均購自美國Thermo Fisher Scientific公司;二甲基亞砜（DMSO）、氯仿、異丙醇、乙醇等其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 線蟲與菌株

普通野生型秀麗隱桿線蟲（株系N2，以下簡稱“N2線蟲”）和尿嘧啶缺陷型大腸埃希菌OP50（Escherichia Coli OP50）均購自美國秀麗隱桿線蟲遺傳中心（Caenorhabditis Genetics Center）。

1.4 細胞與質(zhì)粒

小鼠神經(jīng)瘤母細胞N2a和人胚腎細胞293T均購自美國ATCC細胞庫，Nrf2-ARE質(zhì)粒購自美國Promega公司。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 M9溶液 準(zhǔn)確稱取Na2HPO4·12H2O 15.0 g、KH2PO4 3.0 g、NaCl 5.0 g、MgSO4 0.12 g，用水800 mL溶解后再定容至1 000 mL，混勻，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，即得。

2.1.2 AM溶液 采取冷浸法制備AM[11]。稱取白術(shù)飲片2 kg，用2倍量（L/kg）的95%乙醇浸漬，浸漬3次，每次1周;浸提液濾過后合并，減壓濃縮得到AM浸膏359 g（得率為18%）。將上述浸膏置于4 ℃冷藏，備用。使用前，將白術(shù)浸膏溶于DMSO 1 mL中，制成質(zhì)量濃度為300 mg/mL（以提取物量計）的AM貯備液，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過除菌，于-20 ℃保存;后續(xù)試驗時以M9溶液（用于線蟲實驗，下同）或含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素混合液的DMEM高糖培養(yǎng)基（后文簡稱為“完全培養(yǎng)基”，用于細胞試驗，下同）將其稀釋至所需濃度即可（體系中DMSO終濃度<1‰）。

2.1.3 陽性對照溶液 精密稱取姜黃素對照品36.84 mg，溶于DMSO 1 mL中，制成濃度為100 mmol/L的貯備液，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過除菌，于-20 ℃保存;后續(xù)試驗時以M9溶液或完全培養(yǎng)基將其稀釋至所需濃度即可（體系中DMSO終濃度<1‰）。

2.1.4 NGM固體培養(yǎng)基 稱取NaCl 0.6 g、瓊脂粉3.4 g、胰蛋白胨0.5 g，加水195 mL，搖勻，121 ℃高壓滅菌30 min;冷卻至約55 ℃時，再依次加入1 mol/L的MgSO4 溶液0.2 mL、5 mg/mL的膽固醇溶液0.2 mL、1 mol/L的CaCl2 溶液0.2 mL、用0.22 μm濾膜濾過除菌的1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）5 mL，混勻后倒入無菌的培養(yǎng)皿中，每板10 mL，晾干，密封置于4 ℃冰箱中，備用。

2.2 N2線蟲培養(yǎng)與同期化處理

將N2線蟲接種于已涂布E.coli OP50的NGM固體培養(yǎng)基中，20 ℃恒溫培養(yǎng)，及時觀察其生長狀態(tài)并傳代。轉(zhuǎn)移生殖期的N2線蟲到新的NGM固體培養(yǎng)基上產(chǎn)卵2 h進行同期化處理，并將同期化后的L4期N2線蟲用于實驗。

2.3 細胞培養(yǎng)

將N2a細胞和293T細胞均接種于完全培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液，待細胞處于對數(shù)生長期時接種于不同培養(yǎng)板中，用于試驗。

2.4 AM對N2線蟲壽命的影響

實驗設(shè)置空白對照組、陽性對照組（100 μmol/L 姜黃素，劑量參考文獻[12]和預(yù)實驗結(jié)果設(shè)置）和AM低、中、高劑量組（100、200、300 μg/mL，以提取物計，劑量設(shè)置參考預(yù)實驗結(jié)果設(shè)置，下同）。用M9溶液將姜黃素和AM貯備液稀釋至實驗所需終濃度，于每個NGM固體培養(yǎng)基中加入相應(yīng)藥液500 μL，待藥液完全滲透后，再加入E.coli OP50菌液（以LB液體培養(yǎng)基為溶劑）100 μL，空白對照組加入等體積M9溶液和E.coli OP50菌液，37 ℃培養(yǎng)過夜，即實驗NGM平板制備完成。將同期化的L4期N2線蟲轉(zhuǎn)移至各組實驗NGM平板上，每組100條，于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從N2線蟲進入產(chǎn)卵期起，每24 h轉(zhuǎn)至1個新的實驗NGM平板上（簡稱為“轉(zhuǎn)板”），至不再產(chǎn)卵時改為隔日轉(zhuǎn)板1次。每日定時用體式顯微鏡觀察，統(tǒng)計每組N2線蟲的個體死亡數(shù)量，直至N2線蟲全部死亡（以線蟲個體對機械性刺激無反應(yīng)視為死亡），計算各組線蟲的平均存活時間。剔除標(biāo)準(zhǔn)：（1）爬至平板壁或蓋上而干死;（2）線蟲死亡后蟲卵在體內(nèi)孵化;（3）鉆入瓊脂中。實驗重復(fù)3次。

2.5 AM對氧化應(yīng)激下N2線蟲壽命的影響

參考文獻[13]方法并稍作修改進行實驗。按“2.4”項下方法分組、制備實驗NGM平板并加入N2線蟲，于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，轉(zhuǎn)移各組N2線蟲至含40 mmol/L H2O2的24孔板中模擬氧化應(yīng)激狀態(tài)，每孔15條，每組60條，使用體式顯微鏡觀察，計數(shù)每小時N2線蟲的個體死亡數(shù)量，直至N2線蟲全部死亡，計算各組線蟲的平均存活時間。死亡標(biāo)準(zhǔn)和剔除標(biāo)準(zhǔn)同“2.4”項。實驗重復(fù)3次。

2.6 AM對N2線蟲繁殖能力的影響

參考文獻[14]方法進行實驗。按“2.4”項下方法分組、制備實驗NGM平板并加入N2線蟲，于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，此時記為生殖實驗第1天;每日轉(zhuǎn)板1次，直至N2線蟲喪失生殖能力（以N2線蟲轉(zhuǎn)移至新的實驗NGM平板中，24 h內(nèi)未見新卵視為其喪失生殖能力）。20 ℃下孵育產(chǎn)卵板，孵化后，使用體式顯微鏡觀察并記錄子代數(shù)量，以子代數(shù)量反映繁殖能力。實驗重復(fù)3次。

2.7 AM對氧化應(yīng)激下N2a細胞存活率的影響

采用MTT法進行檢測。將N2a細胞以2×104個/孔的密度接種于96孔板中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將其隨機分為空白對照組、模型組、陽性對照組（100 ?mol/L 姜黃素）和AM低、中、高劑量組（100、200、300 μg/mL），每組設(shè)6個復(fù)孔。用完全培養(yǎng)基將姜黃素和AM貯備液稀釋至所需終濃度，各給藥組加入含相應(yīng)藥物的完全培養(yǎng)基100 μL，空白對照組加入等體積完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)2 h后，除空白對照組外的其余各組均加入H2O2（終濃度為700 ?mol/L）復(fù)制氧化應(yīng)激模型，繼續(xù)培養(yǎng)22 h;加入5 mg/mL MTT溶液20 ?L，培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基;每孔加DMSO 150 μL，搖床振搖10 min，使用全波長酶標(biāo)儀于490 nm波長處測定光密度（OD）值并計算細胞存活率：細胞存活率（%）=檢測組OD值/空白對照組OD值×100%。試驗重復(fù)3次。

2.8 AM對293T細胞中Nrf2-ARE熒光素酶活性的影響

將293T細胞以4×104個/孔的密度接種于96孔板中，按“2.7”項下方法分組（不設(shè)模型組），每組設(shè)6個復(fù)孔。待細胞融合至80%時，每孔均瞬時轉(zhuǎn)染Nrf2-ARE質(zhì)粒100 ng，并于轉(zhuǎn)染6 h后更換完全培養(yǎng)基;繼續(xù)培養(yǎng)18 h，棄去培養(yǎng)基，加入與“2.7”項下相同的含藥完全培養(yǎng)基100 μL，培養(yǎng)24 h;另外AM中劑量組分別培養(yǎng)12、18、24 h，采用熒光素酶報告基因法測定Nrf2-ARE熒光素酶活性。具體操作如下：棄培養(yǎng)基，加入報告基因裂解液100 μL，室溫振搖30 min，每孔轉(zhuǎn)移裂解物30 μL到96孔全白微孔板中，隨后加入熒光素酶檢測試劑50 μL，立即使用多功能酶標(biāo)儀檢測各孔的化學(xué)發(fā)光值并計算Nrf2-ARE熒光素酶相對活性：相對活性=檢測組化學(xué)發(fā)光值/空白對照組化學(xué)發(fā)光值。試驗重復(fù)3次。

2.9 AM對N2a細胞中Nrf2下游抗氧化基因表達的影響

將N2a細胞以4×105個/孔的密度接種于6孔板中，按“2.8”項下方法進行細胞分組、給藥，每組設(shè)6個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，采用Trizol法提取細胞總RNA，按照BeyoRTTM Ⅲ First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，使用Power UpTM SYBRTM Green Master Mix試劑盒以實時熒光定量PCR儀進行擴增。反應(yīng)體系（共10 μL）：cDNA模板4 μL，SYBRTM Green Mix試劑5 μL，上、下游引物各0.5 μL。反應(yīng)條件：50 ℃加熱2 min，95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析目標(biāo)基因HO-1、NQO-1 mRNA的表達水平，以空白對照組為標(biāo)準(zhǔn)計算相對表達量。試驗重復(fù)3次。N2a細胞中Nrf2下游抗氧化基因的引物序列及產(chǎn)物片段長度見表1。

2.10 AM對N2線蟲中SKN-1下游抗氧化基因表達的影響

按“2.4”項下方法分組、制備實驗NGM平板，挑取L4期N2線蟲到實驗NGM平板上，每組800條，于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，分別收集各組線蟲，加入Trizol試劑勻漿后提取線蟲總RNA，逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR操作同“2.9”項。以PMP-3作為內(nèi)參，按“2.9”項下方法分析目標(biāo)基因GCS-1、GST-7、GST-10、HSP-60、HSP-16.2、SOD-3 mRNA的相對表達量。試驗重復(fù)3次。N2線蟲中SKN-1下游靶基因的引物序列及產(chǎn)物片段長度見表2。

2.11 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 6.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以x±SEM表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 AM對N2線蟲壽命的影響

空白對照組、陽性對照組和AM低、中、高劑量組N2線蟲的平均存活時間分別為（10.781±2.077）、（11.883±3.211）、（11.819±3.033）、（12.634±3.341）、（14.453±3.163） d（n=3）。與空白對照組比較，陽性對照組和AM各劑量組N2線蟲的平均存活時間均顯著延長（P<0.05或P<0.01）。

3.2 AM對氧化應(yīng)激下N2線蟲壽命的影響

空白對照組、陽性對照組和AM低、中、高劑量組N2線蟲在氧化應(yīng)激下的平均存活時間分別為（6.238±2.161）、（7.061±2.359）、（7.429±2.284）、（7.764±2.659）、（7.709±2.572） h（n=3）。與空白對照組比較，除陽性對照組外，AM各劑量組N2線蟲在氧化應(yīng)激下的平均存活時間均顯著延長（P<0.05或P<0.01）。

3.3 AM對N2線蟲繁殖能力的影響

與空白對照組比較，陽性對照組和AM低、中劑量組N2線蟲第1天的子代數(shù)量，陽性對照組和AM中、高劑量組N2線蟲第2天的子代數(shù)量以及總子代數(shù)量均顯著增加（P<0.05或P<0.01）。AM對N2線蟲繁殖能力的影響見圖1。

3.4 AM對氧化應(yīng)激下N2a細胞存活率的影響

與空白對照組比較，模型組N2a細胞的存活率顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，陽性對照組和AM中、高劑量組N2a細胞的存活率均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。AM對氧化應(yīng)激下N2a細胞存活率的影響見圖2。

3.5 AM對293T細胞中Nrf2-ARE熒光素酶活性的影響

與空白對照組比較，陽性對照組和AM各劑量組293T細胞中Nrf2-ARE熒光素酶相對活性以及AM中劑量組293T細胞培養(yǎng)不同時間的Nrf2-ARE熒光素酶相對活性均顯著增強（P<0.01），且有劑量依賴性和時間依賴性趨勢。AM對293T細胞中Nrf2-ARE熒光素酶活性的影響見圖3。

3.6 AM對N2a細胞中Nrf2下游抗氧化基因表達的影響

與空白對照組比較，AM各劑量組N2a細胞中HO-1、NQO-1 mRNA的相對表達量以及陽性對照組N2a細胞中HO-1 mRNA的相對表達量均顯著升高（P<0.01）。AM對N2a細胞中Nrf2下游抗氧化基因表達的影響見圖4。

3.7 AM對N2線蟲中SKN-1下游抗氧化基因表達的影響

與空白對照組比較，陽性對照組和AM各劑量組線蟲中GST-10 mRNA的相對表達量，陽性對照組和AM中、高劑量組線蟲中GCS-1、HSP-60 mRNA的相對表達量以及AM中、高劑量組線蟲中GST-7、HSP-16.2、SOD-3 mRNA的相對表達量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。AM對N2線蟲中SKN-1下游抗氧化基因表達的影響見圖5。

4 討論

本研究以N2線蟲為研究對象，對白術(shù)延壽作用進行了評估。在壽命相關(guān)研究中，部分學(xué)者認為繁殖能力與壽命之間可能存在“權(quán)衡利弊”的關(guān)系，即通過抑制繁殖能力來發(fā)揮延長壽命作用[15-16]。本研究結(jié)果表明，AM在正常和氧化應(yīng)激條件下均可顯著延長N2線蟲的壽命，還可在培養(yǎng)早期（第1、2天）提高N2線蟲的繁殖能力，提示白術(shù)具有延壽作用，且不以抑制繁殖能力為代價，這與白術(shù)的安胎作用相符。

已有研究表明，白術(shù)可通過清除自由基發(fā)揮抗衰老作用[17]。自由基是壽命的主要決定因子[18-20]，其不僅在需氧生物體正常新陳代謝過程中產(chǎn)生，而且亦可在受各種刺激因子（如環(huán)境溫度、藥物等）短時間作用下大量產(chǎn)生，從而導(dǎo)致機體發(fā)生氧化應(yīng)激[21]。姜黃素是一種常用的抗氧化劑，可通過調(diào)控Nrf2-ARE信號通路來減少細胞氧化應(yīng)激損傷，從而起到預(yù)防和治療相關(guān)疾病的作用[22]。已有研究表明，姜黃素可以延長N2線蟲的壽命[12]，故本研究將其作為陽性對照藥物。

Nrf2是一種轉(zhuǎn)錄因子，可誘導(dǎo)大量抗氧化和解毒基因的表達：正常條件下，Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Keap1）在細胞質(zhì)中整合Nrf2，而氧化應(yīng)激使Nrf2從Keap1解離并導(dǎo)致Nrf2易位到細胞核中，與ARE結(jié)合，激活編碼抗氧化相關(guān)酶的基因HO-1和NQO-1，從而發(fā)揮抗氧化損傷作用[23-25]。激活Nrf2可減少氧化應(yīng)激，從而產(chǎn)生抗衰老和保護機體的作用[26-28]。本研究結(jié)果表明，AM可以提高氧化應(yīng)激下N2a細胞的存活率，提高Nrf2下游抗氧化基因HO-1、NQO-1 mRNA的相對表達量，提示白術(shù)可能通過激活Nrf2來發(fā)揮抗衰老和保護作用。

在秀麗隱桿線蟲中，SKN-1是哺乳動物Nrf2的同源基因[29-30]。在一定條件刺激下，腸道內(nèi)的SKN-1蛋白在細胞核內(nèi)積累，并激活其下游抗氧化基因GCS-1、GST-7、GST-10、HSP-60、HSP-16.2、SOD-3的表達，從而提高秀麗隱桿線蟲抗氧化應(yīng)激及抗衰老的能力[31-33]。同時，SKN-1在延長秀麗隱桿線蟲壽命方面也具有重要作用，提示Nrf2蛋白可能在整個衰老過程中起重要作用[34]。本研究結(jié)果表明，AM可上調(diào)GCS-1、GST-7、GST-10、HSP-60、HSP-16.2、SOD-3 mRNA的表達，提示白術(shù)可激活SKN-1通路。

綜上所述，白術(shù)可以延長N2線蟲在正常和氧化應(yīng)激狀態(tài)下的壽命，并且可以提高其繁殖能力;作用機制可能是通過激活SKN-1/Nrf2信號通路、促進其下游靶基因的表達從而發(fā)揮抗氧化和保護機體的作用。本研究為白術(shù)的延壽作用提供了新的思路和方法，但還需要進行更深入的機制研究。

參考文獻

[ 1 ] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S]. 2020年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2020：107.

[ 2 ] 張曉娟，左冬冬.白術(shù)化學(xué)成分及藥理作用研究新進展[J].中醫(yī)藥信息，2018，35（6）：101-106.

[ 3 ] 葛珊珊，宋貴發(fā)，王震，等.白術(shù)藥用淺談[J].現(xiàn)代中醫(yī)藥，2015，35（2）：57-59.

[ 4 ] DENZEL MS，LAPIERRE LR，MACK HID. Emerging topics in C. elegans aging research：transcriptional regulation，stress response and epigenetics[J]. Mech Ageing Dev，2019，177：4-21.

[ 5 ] MAGLIONI S，ARSALAN N，VENTURA N. C. elegans screening strategies to identify pro-longevity interventions[J]. Mech Ageing Dev，2016，157：60-69.

[ 6 ] PARK HEH，JUNG Y，LEE SJV. Survival assays using Caenorhabditis elegans[J]. Mol Cells，2017，40（2）：90-99.

[ 7 ] MARKAKI M，TAVERNARAKIS N. Caenorhabditis elegans as a model system for human diseases[J]. Curr Opin Biotechnol，2020，63：118-125.

[ 8 ] SUN Y，CHENG M，LIANG X，et al. JAK2/STAT3 involves oxidative stress-induced cell injury in N2a cells and a rat MCAO model[J]. Int J Neurosci，2020，130（11）：1142-1150.

[ 9 ] DUANGJAN C，RANGSINTH P，GU X，et al. Glochidion zeylanicum leaf extracts exhibit lifespan extending and oxidative stress resistance properties in Caenorhabditis elegans via DAF-16/FoxO and SKN-1/Nrf-2 signaling pathways[J]. Phytomedicine，2019，64：153061.

[10] JIANG T，SUN Q，CHEN S. Oxidative stress：a major pathogenesis and potential therapeutic target of antioxidative agents in parkinsons disease and alzheimers disease[J]. Prog Neurobiol，2016，147：1-19.

[11] 方學(xué)敏，曹崗，蔡銀燕.白術(shù)化學(xué)成分的制備研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013，31（5）：993-995.

[12] BIELAK-ZMIJEWSKA A，GRABOWSKA W，CIOLKO A，et al. The role of curcumin in the modulation of ageing[J]. Int J Mol Sci，2019，20（5）：1239.

[13] 金司儀.三七粉延緩秀麗隱桿線蟲衰老的作用機制及其穩(wěn)定性研究[D].武漢：湖北中醫(yī)藥大學(xué)，2019.

[14] 周玲，王平，蔡銘，等.補腎化痰復(fù)方對秀麗線蟲神經(jīng)保護的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2018，29（10）：2348-2351.

[15] 唐進法，張帆，李宇輝，等.何首烏乙酸乙酯提取物對秀麗線蟲的抗衰老作用研究[J].中國藥房，2017，28（4）：493-496.

[16] MACEDO F，ROMANATTO T，ASSIS CGD，et al. Life- span-extending interventions enhance lipid-supported mitochondrial respiration in Caenorhabditis elegans[J]. FASEB J，2020，34（8）：9972-9981.

[17] 李佳瑛，景永帥，張丹參.白術(shù)在老年癡呆與認知障礙相關(guān)疾病的藥理作用[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2019，33（6）：468-469.

[18] CHANDRASEKARAN A，IDELCHIK MDPS，MELENDEZ JA. Redox control of senescence and age-related disease[J]. Redox Biol，2017，11：91-102.

[19] 周玲，黃敏，王長江，等.基于秀麗線蟲SKN-1/Nrf2調(diào)控的中藥抗氧化和緩解Aβ毒性作用的研究進展[J].時珍國醫(yī)國藥，2018，29（1）：176-178.

[20] WEI Y，KENYON C. Roles for ROS and hydrogen sulfide in the longevity response to germline loss in Caenorhabditis elegans[J]. P Natl Acad Sci U S A，2016，113（20）：E2832-E2841.

[21] BHAT AH，DAR KB，ANEES S，et al. Oxidative stress，mitochondrial dysfunction and neurodegenerative disea- ses;a mechanistic insight[J]. Biomed Pharmacother，2015，74：101-110.

[22] 李軍，熊琨，龔元，等.基于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的姜黃素抗氧化機制研究進展[J].中草藥，2016，47（13）：2373-2380.

[23] 胡流芳，王迎，任汝靜，等. Keap1-Nrf2/ARE信號通路的抗氧化應(yīng)激作用及其調(diào)控機制[J].國際藥學(xué)研究雜志，2016，43（1）：146-152、166.

[24] 龐敏，單宇，王菲菲，等.諸葛菜種子水提物對硫代乙酰胺誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的保護作用研究[J].中國中藥雜志，2020，45（6）：1399-1405.

[25] 郭豐，黃山，李斌.基于Nrf2/HO-1信號通路的夜關(guān)門提取物對谷氨酸誘導(dǎo)小鼠海馬細胞HT22損傷的保護作用及機制研究[J].中國藥房，2020，31（11）：1303-1308.

[26] 汪剛，劉瑩，侯雪峰，等.川芎提取物通過激活Nrf2通路對抗心肌缺血大鼠氧化應(yīng)激損傷[J].中國中藥雜志，2017，42（24）：4834-4840.

[27] 高琛，支應(yīng)鵬.淫羊藿次苷Ⅱ調(diào)節(jié)miR-141-3p/Notch/Nrf2軸對局灶性腦缺血模型大鼠神經(jīng)功能的改善作用研究[J].中國藥房，2020，31（19）：2386-2391.

[28] BUENDIA I，MICHALSKA P，NAVARRO E，et al. Nrf2- ARE pathway：an emerging target against oxidative stress and neuroinflammation in neurodegenerative diseases[J].Pharmacol Ther，2016，157：84-104.

[29] COLONNELLO A，AGUILERA-PORTILLO G，RUBIO- L?PEZ LC，et al. Comparing the neuroprotective effects of caffeic acid in rat cortical slices and Caenorhabditis elegans：involvement of Nrf2 and SKN-1 signaling pathways[J]. Neurotox Res，2020，37（2）：326-337.

[30] XU Z，HU Y，DENG Y，et al. WDR-23 and SKN-1/Nrf2 coordinate with the BLI-3 dual oxidase in response to iodide-triggered oxidative stress[J]. G3（Bethesda），2018，8（11）：3515-3527.

[31] GANNER A，GERBER J，ZIEGLER AK，et al. CBP-1/p300 acetyltransferase regulates SKN-1/Nrf cellular le- vels，nuclear localization，and activity in C.elegans[J]. Exp Gerontol，2019，126：110690.

[32] BLACKWELL TK，STEINBAUGH MJ，HOURIHAN JM，et al. SKN-1/Nrf，stress responses，and aging in Caenorhabditis elegans[J]. Free Radical Bio Med，2015，88：290-301.

[33] GOVINDAN S，AMIRTHALINGAM M，DURAISAMY K，et al. Phytochemicals-induced hormesis protects Caenorhabditis elegans against α-synuclein protein aggregation and stress through modulating HSF-1 and SKN-1/Nrf2 signaling pathways[J]. Biomed Pharmacother，2018，102：812-822.

[34] TULLET JMA，GREEN JW，AU C，et al. The SKN-1/Nrf2 transcription factor can protect against oxidative stress and increase lifespan in C.elegans by distinct mechanisms[J]. Aging Cell，2017，16（5）：1191-1194.

（收稿日期：2020-10-05 修回日期：2021-01-24）

（編輯：鄒麗娟）