吳琪 陳運中 吳高明

摘 要 目的：研究丹皮酚與順鉑聯(lián)用對人骨肉瘤細(xì)胞MG-63增殖、凋亡的影響及可能的作用機制。方法：取對數(shù)生長期MG-63細(xì)胞，分為空白對照組、順鉑組（4 ?mol/L）、丹皮酚組（50 mg/L）和低、中、高濃度聯(lián)用組（50、100、200 mg/L丹皮酚+4 ?mol/L順鉑）。采用CCK-8法檢測經(jīng)藥物作用24、48、72 h時的細(xì)胞增殖率，采用膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶雙染法檢測經(jīng)藥物作用24 h時的細(xì)胞凋亡率;采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測經(jīng)藥物作用24 h時細(xì)胞中PI3KCA、Akt、mTOR、P-gp、PTEN mRNA的相對表達(dá)量。結(jié)果：與空白對照組比較，各藥物組細(xì)胞各時間點的細(xì)胞增殖率和細(xì)胞中PI3KCA、Akt、mTOR mRNA的相對表達(dá)量均顯著降低，細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞中P-gp、PTEN mRNA的相對表達(dá)量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與順鉑組和丹皮酚組比較，高濃度聯(lián)用組細(xì)胞各時間點的細(xì)胞增殖率和細(xì)胞中PI3KCA、Akt、mTOR mRNA的相對表達(dá)量均顯著降低，細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞中P-gp、PTEN mRNA表達(dá)量均顯著升高（P<0.01），中、低濃度聯(lián)用組上述部分指標(biāo)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：丹皮酚與順鉑聯(lián)用可抑制MG-63細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡;這種作用可能與下調(diào)PI3KCA、Akt、mTOR mRNA表達(dá)，上調(diào)P-gp、PTEN mRNA表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 丹皮酚;順鉑;骨肉瘤;PI3K/Akt/mTOR信號通路;增殖;凋亡

ABSTRACT? ?OBJECTIVE：To study the effects of paeonol combined with cisplatin on the proliferation and apoptosis of human osteosarcoma cell MG-63 and its possible mechanism. METHODS： MG-63 cells in logarithmic growth phase were divided into blank control group， cisplatin group （4 ?mol/L），paeonol group （50 mg/L），and low，medium，high concentration combined groups （50，100，200 mg/L paeonol+4 ?mol/L cisplatin）. CCK-8 method was used to detect the cell proliferation rate at 24，48，and 72 hours of treatment. Annexin Ⅴ-FITC/PI double staining method was used to detect the cell apoptosis rate at 24 hours of treatment. The relative expression of PI3KCA，Akt，mTOR，P-gp and PTEN mRNA in cells were detected by qRT-PCR. RESULTS： Compared with blank control group，the cell proliferation rate at each time point， and the relative expression of PI3KCA，Akt and mTOR mRNA in cells were significantly reduced and the apoptosis rate and the relative expression of P-gp and PTEN mRNA in the cells were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with cisplatin group and paeonol group， cell proliferation rate at each time point and the relative expression of PI3KCA，Akt and mTOR mRNA in cells were decreased significantly in the high concentration combination group， while the relative expression of P-gp and PTEN mRNA in the cells were significantly increased （P<0.01）; there were statistical significance in some of the above indicators in the medium and low concentration combination groups （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS：The combination of paeonol and cisplatin could inhibit the proliferation of MG-63 cells and promote their apoptosis， which may be related to the down-regulation of PI3KCA，Akt and mTOR mRNA expression，and the up-regulation of P-gp and PTEN mRNA expression.

KEYWORDS? ?Paeonol; Cisplatin; Osteosarcoma; PI3K/Akt/mTOR signaling pathway; Proliferation; Apoptosis

骨肉瘤是起源于間葉組織，以能產(chǎn)生骨樣組織的梭形基質(zhì)細(xì)胞為特征的骨骼系統(tǒng)原發(fā)性惡性腫瘤[1]，好發(fā)于骨生長活躍的青少年[2]。骨肉瘤惡性程度高、破壞性強，早期便可發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移[3]。隨著保肢手術(shù)、放療和新輔助化療的發(fā)展，骨肉瘤患者的5年生存率已提高到70%左右[4]，但復(fù)發(fā)患者的生存率仍不足30%[5]。目前，臨床治療骨肉瘤的化療藥物以阿霉素、順鉑和大劑量甲氨蝶呤為主，然而高劑量化療藥物所致的毒副作用和腫瘤細(xì)胞原發(fā)或繼發(fā)的多藥耐藥嚴(yán)重影響了其臨床療效和患者的長期生存率[6]。順鉑作為骨肉瘤化療的常用藥物，不僅可以通過細(xì)胞毒作用直接殺傷腫瘤細(xì)胞，還可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮治療作用[7-8]，但是其腎毒性和致嚴(yán)重嘔吐的副作用限制了該藥的臨床使用[9]。因此，探索低毒、高效的抗骨肉瘤藥物成為目前研究的熱點。

丹皮酚是從蘿摩科植物徐長卿干燥根或全草和毛茛科植物牡丹、芍藥的根皮中提取的小分子酚類化合物，具有廣泛的藥理活性[10-11]。既往研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚對人乳腺癌細(xì)胞EMT6、人食管癌細(xì)胞Eca-109、人肝癌細(xì)胞Bel-7404、人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo、人卵巢癌細(xì)胞SKOV3等多種腫瘤細(xì)胞均具有明顯的抑制作用，其抗腫瘤的分子機制之一可能是抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]，可見該成分是一種潛在的多靶點抗癌劑[13]。最新研究認(rèn)為，丹皮酚與化療藥物或放療藥物聯(lián)用可起到協(xié)同抗腫瘤作用[14]。然而，目前關(guān)于丹皮酚與化療藥物聯(lián)用對骨肉瘤細(xì)胞的影響尚未見報道。PI3K/Akt/mTOR通路是近年來發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，該通路的表達(dá)失調(diào)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[15]?；诖?，本文研究了丹皮酚與順鉑聯(lián)用對人骨肉瘤細(xì)胞MG-63增殖、凋亡的影響，并基于PI3K/Akt/mTOR通路探討其可能機制，旨在為抗骨肉瘤新藥的開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括5702R型低速離心機（德國Eppendorf公司）、MCO-15AC型CO2恒溫培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司）、Flexstation? 3型全自動酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）、IX51型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）、CytoFLEX型流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter公司）、QuantStudio 6型實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（美國ABI公司）、Nano-100型微量分光光度計（杭州奧盛儀器有限公司）、JY300型水平電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

丹皮酚對照品和順鉑對照品（批號分別為H35803、P4394，純度均大于99%）均購自美國Sigma公司，SYBR Green Master Mix和HiScript逆轉(zhuǎn)錄酶（批號分別為Q111-02、R101-01/02）均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，脫氧核糖核苷三磷酸（批號P4325）購自北京天根生化科技有限公司，RNA酶抑制劑（批號J11202）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，MEM培養(yǎng)基（批號PM150410）購自武漢普諾賽生命科技有限公司，胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗溶液和0.25%胰蛋白酶（批號分別為10091-148、15070- 063、15050065）均購自美國Gibco公司，CCK-8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒（批號HY-K0301）購自美國MCE公司，膜聯(lián)蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（批號KGA108）購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，總RNA提取試劑盒（Trizol法，批號15596-026）購自美國Ambion公司，GAPDH、PI3KCA、Akt、mTOR、P-gp、PTEN等基因的PCR引物均由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司設(shè)計、合成（引物序列及產(chǎn)物長度見表1）;其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細(xì)胞

人骨肉瘤細(xì)胞MG-63購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

2 方法

2.1 分組與給藥

將對數(shù)生長期的MG-63細(xì)胞分為空白對照組、順鉑組（4 ?mol/L）、丹皮酚組（50 mg/L）和低、中、高濃度聯(lián)用組（50、100、200 mg/L丹皮酚+4 ?mol/L順鉑）?？瞻讓φ战M細(xì)胞僅加入完全培養(yǎng)基（即含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的MEM培養(yǎng)基，下同），其余組細(xì)胞加入含相應(yīng)藥物的完全培養(yǎng)基。本研究中順鉑和丹皮酚的給藥濃度均參考文獻(xiàn)[16-17]和前期預(yù)試驗結(jié)果設(shè)置。

2.2 細(xì)胞增殖率的檢測

采用CCK-8法進(jìn)行檢測。取對數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好的MG-63細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整為5×104個/mL，按100 ?L/孔接種至96孔板中，于37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)過夜。將上述細(xì)胞按“2.1”項下方法分組、給藥，每組設(shè)置5個復(fù)孔，分別于37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)24、48、72 h時每孔加入CCK-8試劑10 ?L，培養(yǎng)4 h。使用酶標(biāo)儀于450 nm波長處測定各孔的光密度（OD）值，計算細(xì)胞增殖率：細(xì)胞增殖率（%）=給藥組OD值/空白對照組OD值×100%。試驗重復(fù)3次。

2.3 細(xì)胞凋亡率的檢測

采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法進(jìn)行檢測。收集“2.2”項下空白對照組、順鉑組、丹皮酚組和低、中、高濃度聯(lián)用組培養(yǎng)24 h的細(xì)胞，用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的0.25%胰蛋白酶消化，以1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，沉淀加磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）重懸，并用PBS洗滌2次，再以1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，沉淀加入Binding buffer 500 ?L重懸，分別加入Annexin Ⅴ-FITC和PI染液各5 ?L，混勻后，于室溫、避光下反應(yīng)5～15 min，使用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況。試驗重復(fù)3次。

2.4 細(xì)胞中PI3KCA、Akt、mTOR、P-gp、PTEN mRNA表達(dá)水平的檢測

采用實時熒光定量PCR法進(jìn)行檢測。收集“2.2”項下空白對照組、順鉑組、丹皮酚組和低、中、高濃度聯(lián)用組培養(yǎng)24 h的細(xì)胞，裂解后，按照Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件：25 ℃反應(yīng)5 min讓引物充分退火結(jié)合到RNA模板上;50 ℃逆轉(zhuǎn)錄15 min;85 ℃滅活逆轉(zhuǎn)錄酶5 min;4 ℃保持10 min。將cDNA用無菌ddH2O做8倍稀釋后進(jìn)行PCR擴增，反應(yīng)體系（20 μL）：cDNA（8倍稀釋）4 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，SYBR Green Master Mix預(yù)混液10 μL，50×ROX Reference Dye2預(yù)混液0.4 μL，無菌ddH2O 4.8 μL。反應(yīng)條件：50 ℃預(yù)測保溫2 min，95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性30 s，60 ℃退火延伸30 s，共循環(huán)40 次。采用QuantStudioTM Real-Time PCR Software v1.1軟件繪制溶解曲線，以GAPDH為內(nèi)參，按2-ΔΔCt法計算PI3KCA、Akt、mTOR、P-Gp、PTEN mRNA的表達(dá)水平，并以空白對照組為標(biāo)準(zhǔn)計算相對表達(dá)量。試驗重復(fù)3次。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 丹皮酚與順鉑聯(lián)用對MG-63細(xì)胞增殖率的影響

與空白對照組比較，各藥物組細(xì)胞各時間點的增殖率均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與順鉑組和丹皮酚組比較，低、中、高濃度聯(lián)用組細(xì)胞各時間點的增殖率（除低濃度聯(lián)用組給藥24 h外）均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見表2。

3.2 丹皮酚與順鉑聯(lián)用對MG-63細(xì)胞凋亡率的影響

與空白對照組比較，各藥物組細(xì)胞的凋亡率均顯著升高（P<0.01）。與順鉑組和丹皮酚組比較，低、中、高濃度聯(lián)用組細(xì)胞的凋亡率均顯著升高（P<0.05或P<0.01），詳見圖1、圖2。

3.3 丹皮酚與順鉑聯(lián)用對MG-63細(xì)胞中PI3KCA、Akt、mTOR、P-gp、PTEN mRNA表達(dá)的影響

與空白對照組比較，各藥物組細(xì)胞中PI3KCA、Akt、mTOR mRNA的相對表達(dá)量均顯著降低，P-gp、PTEN mRNA的相對表達(dá)量均顯著升高（P<0.01）。與順鉑組和丹皮酚組比較，低、中、高濃度聯(lián)用組細(xì)胞中PI3KCA mRNA（除低濃度聯(lián)用組外）、Akt mRNA（除低、中濃度聯(lián)用組外）、mTOR mRNA的相對表達(dá)量均顯著降低，P-gp mRNA（除中濃度聯(lián)用組外）、PTEN mRNA（除低濃度聯(lián)用組外）的相對表達(dá)量均顯著升高（P<0.01），詳見表3。

4 討論

本研究通過CCK-8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，各藥物組骨肉瘤細(xì)胞各時間點（24、48、72 h）的增殖率均顯著降低;與順鉑組和丹皮酚組比較，低、中、高濃度聯(lián)用組細(xì)胞各時間點的增殖率（除低濃度聯(lián)用組作用24 h外）均顯著降低。這說明丹皮酚與順鉑聯(lián)用可協(xié)同抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，且有濃度依賴性和時間依賴性趨勢。

本研究通過AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，與空白對照組比較，各藥物組骨肉瘤細(xì)胞的凋亡率均顯著升高;與順鉑組和丹皮酚組比較，低、中、高濃度聯(lián)用組細(xì)胞的凋亡率均顯著升高。這說明丹皮酚與順鉑聯(lián)用可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡，且有濃度依賴性趨勢。

PI3K是一種可催化磷脂酰肌醇D3位磷酸化的脂類激酶，研究證實骨肉瘤中存在著PI3KCA基因突變，后者可激活PI3K通路，其表達(dá)水平與骨肉瘤惡性程度相關(guān)[18]。Akt是一個絲/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K關(guān)鍵的下游效應(yīng)分子[19]。mTOR是一種與PI3K/Akt通路相關(guān)的蛋白激酶[20]。PI3K活化產(chǎn)生的信使PIP3可激活其下游的Akt，Akt激活使腫瘤細(xì)胞對凋亡耐受性增加、細(xì)胞生長代謝異常加速;Akt通過磷酸化作用激活其下游的底物mTOR，引起腫瘤細(xì)胞癌蛋白分泌增加、細(xì)胞周期循環(huán)加快、G期時程縮短，導(dǎo)致腫瘤迅速發(fā)生、發(fā)展。

PTEN是具有磷酸酶活性的抑癌基因，在多種腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)，對PI3K/Akt信號通路起到負(fù)向調(diào)節(jié)作用[21]，上調(diào)PTEN基因的表達(dá)或使用PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制劑，均可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥，從而提高化療的效果。P-gp是相對分子質(zhì)量為170 kDa的跨膜轉(zhuǎn)運糖蛋白，由ABCB1基因編碼，具有12個跨膜區(qū)和2個細(xì)胞內(nèi)腺苷三磷酸（ATP）連接點。腫瘤細(xì)胞長期接觸親脂類化療藥物，ABCB1基因被誘導(dǎo)擴增，P-gp被大量表達(dá)，ATP跨膜轉(zhuǎn)運作用將藥物轉(zhuǎn)運到細(xì)胞外，使細(xì)胞內(nèi)藥物集聚減少，作用靶點部位的藥物濃度降低，導(dǎo)致化療效果下降或消失。P-gp在多種惡性腫瘤中均呈較高表達(dá)狀態(tài)[22]。本研究結(jié)果顯示，丹皮酚聯(lián)合順鉑可明顯下調(diào)骨肉瘤細(xì)胞PI3KCA、Akt、mTOR mRNA的表達(dá)，上調(diào)P-gp、PTEN mRNA表達(dá)，從而阻斷PI3K/Akt/mTOR信號通路靶基因表達(dá)，發(fā)揮抑瘤作用。其中P-gp mRNA在低、高濃度聯(lián)用組表達(dá)的升高可能與P-gp介導(dǎo)的多藥耐藥有關(guān)[23]，具體機制還需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，丹皮酚聯(lián)合順鉑可通過調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR信號通路中PI3KCA、Akt、mTOR、P-gp、TEN mRNA的表達(dá)而抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)其凋亡，下一步可深入探討丹皮酚聯(lián)合順鉑對骨肉瘤細(xì)胞多藥耐藥的影響。

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（收稿日期：2020-11-09 修回日期：2021-01-18）

（編輯：鄒麗娟）