羅倫才 童妍 張興國(guó) 陳礴 鐘振東

摘 要 目的：研究愈瘍膠囊對(duì)細(xì)菌感染皮炎模型大鼠的抗炎作用及對(duì)Toll樣受體/核因子κB（TLR/NF-κB）通路的影響。方法：采用肉湯稀釋法測(cè)定愈瘍膠囊對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）。將50只大鼠隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（阿莫西林克拉維酸鉀，以阿莫西林計(jì)120 mg/kg）和愈瘍膠囊高、中、低劑量組（根據(jù)MIC設(shè)定），每組10只。以金黃色葡萄球菌感染大鼠燒傷皮膚構(gòu)建細(xì)菌感染皮炎模型。造模成功24 h后，各藥物組大鼠灌胃相應(yīng)藥物，模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)7 d。計(jì)算給藥第1、3、5、7天各組大鼠皮膚愈合率并記錄創(chuàng)面結(jié)痂、脫痂、愈合情況;使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)皮膚組織中白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、羥脯氨酸（HYP）、膠原蛋白Ⅰ（Col Ⅰ）、Col Ⅲ的含量;使用蘇木精-伊紅染色法觀察皮膚組織形態(tài)學(xué)變化，并使用透射電子顯微鏡觀察超微結(jié)構(gòu);采用Western blotting法檢測(cè)皮膚組織中Toll樣受體2（TLR2）、TLR4與磷酸化-NF-κB-p65（p-NF-κB p65）蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：愈瘍膠囊的MIC與MBC分別為25 mg/mL和50 mg/mL，愈瘍膠囊高、中、低劑量組分別設(shè)為600、300、150 mg/kg。與模型組比較，愈瘍膠囊高、中劑量組大鼠給藥3 d后傷處皮膚出現(xiàn)結(jié)痂，給藥5～7 d后部分大鼠傷處出現(xiàn)脫痂;陽(yáng)性對(duì)照組和愈瘍膠囊高、中劑量組大鼠各時(shí)間點(diǎn)的皮膚愈合率均顯著升高，IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α含量和病理評(píng)分以及TLR2、TLR4、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），皮膚組織炎細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變好轉(zhuǎn);陽(yáng)性對(duì)照組和愈瘍膠囊高劑量組大鼠的HYP、Col Ⅰ、Col Ⅲ含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。而陽(yáng)性對(duì)照組和愈瘍膠囊高、中劑量組上述指標(biāo)差異大多無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：愈瘍膠囊可促進(jìn)細(xì)菌感染皮炎模型大鼠皮膚愈合，具有一定的抗炎作用，其機(jī)制可能與抑制TLR/NF-κB信號(hào)通路、減少炎癥反應(yīng)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 愈瘍膠囊;細(xì)菌感染;感染性皮炎;Toll樣受體/核因子κB信號(hào)通路;抑菌抗炎;大鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the anti-inflammatory effects of Yuyang capsule on bacterial dermatitis model rats and its effect on TLR/NF-κB pathway. METHODS： Minimum inhibition concentration （MIC） and minimal bactericidal concentration （MBC） of Yuyang capsule against Staphylococcus aureus were determined by microdilution test. Totally 50 SD rats were randomly divided into model group， positive control group （amoxicillin and clavulanate potassium， 120 mg/kg as amoxicillin）， Yuyang capsules high-dose， medium-dose and low-dose groups （according to MIC）， with 10 rats in each group. The model of bacterial dermatitis was established by using the burned skin of rats infected with S. aureus. 24 h after modeling， administration groups were intragastrically given the corresponding drug， and model group was intragastrically given the same amount of normal saline， once a day， for consecutive 7 days. The skin healing rate was calculated on the 1st， 3rd， 5th and 7th day of administration， and the scab formation， decrustation and healing were recorded. The contents of IL-1β， IL-6， IL-10， TNF-α， hydroxyproline （HYP）， collagen Ⅰ （Col Ⅰ） and Col Ⅲ in skin tissue were detected by ELISA. Morphology changes of skin tissues were observed by HE staining. The ultrastructure was observed by transmission electron microscope. Protein expression of TLR2， TLR4 and p-NF-κB p65 were detected by Western blotting assay. RESULTS： MIC and MBC of Yuyang capsule were 25 mg/mL and 50 mg/mL， respectively. Dose of Yuyang capsules high-dose， medium-dose and low-dose groups were set at 600， 300， 150 mg/kg. Compared with model group， scab appeared on the injured skin 3 days after administration in Yuyang capsule high-dose and medium-dose groups， and decrustation appeared on the injured skin of part mice 5-7 days after administration; the skin healing rate of the positive control group， Yuyang capsule high-dose and medium-dose groups were all significantly increased at each time point. The contents of IL-1β， IL-6， IL-10 and TNF-α， pathological score， protein expression of TLR2， TLR4 and p-NF-κB p65 were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）; the pathological changes such as inflammatory cell infiltration in skin tissue were improved. The contents of HYP， Col Ⅰ and Col Ⅲ were increased significantly in positive control group and Yuyang capsule high-dose group （P<0.05 or P<0.01）. There was no statistical significance in most above indexes in positive control group， Yuyang capsule high-dose and medium-dose groups （P>0.05）. CONCLUSIONS： Yuyang capsule can promote skin healing of bacterial dermatitis model rats and shows certain anti-inflammatory effects; the mechanism may be related to inhibiting TLR/NF-κB signaling pathway and reducing inflammatory response.

KEYWORDS? ?Yuyang capsules; Bacterial infection; Infectious dermatitis; TLR/NF-κB signaling pathway; Antibacterial and anti-inflammatory; Rat

金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus是一種革蘭氏陽(yáng)性菌，常在人前鼻孔和皮膚中定植，是絕大多數(shù)皮膚和軟組織感染的主要病原體[1]。金黃色葡萄球菌可導(dǎo)致多種感染，是造成慢性創(chuàng)面皮膚傷口感染的主要原因之一，也是引起術(shù)后感染性并發(fā)癥的關(guān)鍵[2]。目前臨床治療金黃色葡萄球菌感染主要以抗生素為主，但存在細(xì)菌耐藥的風(fēng)險(xiǎn)[3]。因此，尋找新的有效的抗菌制劑就變得十分重要。

愈瘍膠囊是涼山彝族自治州第二人民醫(yī)院獨(dú)具特色的院內(nèi)制劑之一，其主要成分為山藥與蜂蠟，主要功效為生肌、斂瘡、散結(jié)、止痛，臨床多用于治療潰瘍性口腔炎、乳腺增生、卵巢囊腫等癥。臨床實(shí)踐顯示，在60例卵巢囊腫患者中，愈瘍膠囊治療的總有效率達(dá)到90%[4];藥效學(xué)與毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，該藥能通過(guò)調(diào)節(jié)大鼠體內(nèi)激素分泌水平來(lái)改善乳腺增生，且長(zhǎng)期用藥未見(jiàn)明顯毒性反應(yīng)[5]。根據(jù)我院臨床治療經(jīng)驗(yàn)與筆者前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，愈瘍膠囊具有抗菌消炎等作用，但該制劑發(fā)揮上述作用的具體機(jī)制尚不明確。

Toll樣受體/核因子κB（TLR/NF-κB）通路是經(jīng)典的炎癥通路，細(xì)菌等病原微生物感染可導(dǎo)致該通路的激活，誘導(dǎo)炎癥因子的釋放，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，這也是創(chuàng)面皮膚傷口愈合緩慢的原因之一[6-7]?；诖?，本文研究了愈瘍膠囊對(duì)細(xì)菌感染皮炎模型大鼠的抗炎作用及對(duì)TLR/NF-κB通路的影響，旨在為擴(kuò)大愈瘍膠囊的臨床應(yīng)用、促進(jìn)相關(guān)藥物研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：SpectraMAX Plus384型酶標(biāo)儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]、PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀（常州市中威電子儀器有限公司）、DHP-9012型電熱細(xì)菌培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、BA400 Digital型數(shù)碼三目攝像顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）、JEM-1400 PLUS型透射電子顯微鏡（日本JEOL公司）、優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)（成都超純科技有限公司）、DZKW-4型電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）、JY200C型電泳儀和JY-SCZ4+型垂直電泳槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）、5200型化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）、THZ-98A恒溫振蕩器（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

愈瘍膠囊[批號(hào)190901，川藥制字Z200800943，規(guī)格0.45 g/粒（1 g藥粉相當(dāng)于原生藥1.5 g）]由涼山彝族自治州第二人民醫(yī)院制備，阿莫西林克拉維酸鉀（14 ∶ 1）干混懸劑[批號(hào)190315，規(guī)格600 mg（阿莫西林） ∶ 42.9 mg（克拉維酸）]購(gòu)自上海海虹實(shí)業(yè)（集團(tuán)）巢湖今辰藥業(yè)有限公司，大鼠白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、羥脯氨酸（HYP）、膠原蛋白Ⅰ（Col Ⅰ）、Col Ⅲ酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（批號(hào)ZC- 36391、ZC-36404、ZC-36379、ZC-37624、ZC-37113、ZC- 36122、ZC-36009）均購(gòu)自上海茁彩生物科技有限公司，兔TLR2單克隆抗體、兔TLR4多克隆抗體、兔磷酸化-NF-κB p65（p-NF-κB p65）多克隆抗體、生物素化山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗均購(gòu)自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，兔β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司，ECL發(fā)光試劑盒（批號(hào)KF001）購(gòu)自安諾倫（北京）生物科技有限公司，5×十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液（批號(hào)AR1112-10）購(gòu)自博士德生物工程有限公司;20×TBST緩沖液（批號(hào)28360）購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司;MH肉湯購(gòu)自廣州環(huán)凱微生物科技有限公司，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司，蘇木精染液和伊紅染液均購(gòu)自武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為超純水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（230±20） g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（川）2020-030。

1.4 菌株

金黃色葡萄球菌購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

2 方法

2.1 菌懸液的制備

在凈化工作臺(tái)中，將金黃色葡萄球菌接種到牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18 h進(jìn)行復(fù)蘇。取出復(fù)蘇后的細(xì)菌，挑選單個(gè)菌落至MH肉湯中，于37 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)12 h。取上述細(xì)菌適量，使用無(wú)菌生理鹽水制成1.5×108 CFU/mL的菌懸液，再用MH肉湯稀釋至1×106 CFU/mL，并于30 min內(nèi)完成后續(xù)接種。

2.2 受試藥液的制備

取愈瘍膠囊微粉10 g，溶于無(wú)菌生理鹽水100 mL中，制成質(zhì)量濃度為100 mg/mL的藥液，作為最大濃度;再用無(wú)菌生理鹽水倍比稀釋成50.00、25.00、12.50、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39 mg/mL的藥液，備用。

2.3 最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[8]采用肉湯稀釋法進(jìn)行測(cè)定。取“2.2”項(xiàng)下各質(zhì)量濃度的受試藥液，按180 μL/孔加入至經(jīng)消毒處理過(guò)的96孔板中（每質(zhì)量濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔），隨后按20 μL/孔加入“2.1”項(xiàng)下菌懸液。同時(shí)，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照孔（只加入菌懸液20 μL）、陰性對(duì)照孔（只加入MH肉湯20 μL）、空白對(duì)照孔（只加入無(wú)菌生理鹽水20 μL），各設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將96孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后取出，以肉眼和顯微鏡觀察，并以顯微鏡下無(wú)明顯細(xì)菌生長(zhǎng)的孔所對(duì)應(yīng)的藥液質(zhì)量濃度為MIC。取肉眼觀察無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的菌液各0.1 mL移種至不含藥物的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，以培養(yǎng)基中菌落計(jì)數(shù)少于5個(gè)的孔對(duì)應(yīng)的藥液質(zhì)量濃度作為MBC。

2.4 分組與造模

將50只大鼠隨機(jī)分成5組，即模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（阿莫西林克拉維酸鉀，以阿莫西林計(jì)120 mg/kg，按每日成人臨床常用劑量換算）和愈瘍膠囊高、中、低劑量組（以1倍MIC換算劑量作為中劑量，以2倍中劑量和1/2中劑量分別作為高、低劑量），每組10只。造模前24 h，用8%硫化鈉溶液脫去大鼠背部被毛;造模時(shí)，各組大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液（20 mL/kg）進(jìn)行麻醉，將20 g砝碼燒紅，冷卻10 s后貼于大鼠背部，燙傷10 s，傷處涂抹金黃色葡萄球菌溶液（濃度為1×106 CFU/mL，溶劑為生理鹽水）1 mL，待其自然均勻分布，以患處出現(xiàn)大量黃、白色膿液，潰瘍，紅腫為細(xì)菌感染性皮炎模型復(fù)制成功標(biāo)志。

2.5 藥物干預(yù)

造模成功24 h后，模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，各干預(yù)組大鼠灌胃對(duì)應(yīng)藥物（20 mL/kg），每日1次，連續(xù)7 d。末次給藥后，同“2.4”項(xiàng)下方法麻醉后，處死大鼠，收集傷處皮膚組織，部分組織于-80 ℃下保存，剩余組織在4%多聚甲醛-2%戊二醛固定液中固定，分別用于相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)、表征和形態(tài)學(xué)觀察。

2.6 大鼠皮膚組織表征觀察

觀察各組大鼠給藥第1、3、5、7 天時(shí)的一般體征和積膿、紅腫、潰瘍等表現(xiàn)，肉眼觀察傷口結(jié)痂、脫痂和愈合等情況，同時(shí)利用描繪創(chuàng)面的透明硫酸紙面積計(jì)算創(chuàng)面愈合率：創(chuàng)面愈合率（%）=（原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積。

2.7 大鼠皮膚組織中炎癥因子和纖維蛋白含量測(cè)定

取凍存的皮膚組織適量，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，使用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度（OD）值并計(jì)算各組大鼠皮膚組織中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、HYP、Col Ⅰ、Col Ⅲ的含量。

2.8 大鼠皮膚組織形態(tài)學(xué)觀察

參考文獻(xiàn)[9]方法，取固定好的皮膚組織適量，經(jīng)包埋后切片，使用蘇木精-伊紅（HE）染料進(jìn)行染色，在數(shù)碼三目攝像顯微鏡下觀察，評(píng)價(jià)各組大鼠皮膚組織形態(tài)學(xué)變化。病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：正常組織，無(wú)明顯損傷，記0分。表皮層鱗狀上皮層次僅局部超過(guò)2～3層，略有增厚;真皮層淺層有少量的炎細(xì)胞浸潤(rùn);可見(jiàn)少量壞死區(qū)域及肉芽組織，符合上述任一項(xiàng)者，記1分。表皮層鱗狀上皮層次明顯增厚;真皮層下均有中等量炎細(xì)胞浸潤(rùn);真皮層可見(jiàn)局灶壞死區(qū)域及肉芽組織，符合上述任一項(xiàng)者，記2分。表皮層鱗狀廣泛增厚并使黏膜凹凸不平;真皮層大量廣泛的炎細(xì)胞浸潤(rùn);真皮層可見(jiàn)大量壞死區(qū)域及肉芽組織，符合上述任一項(xiàng)者，記3分[9]。

2.9 大鼠皮膚組織超微結(jié)構(gòu)觀察

取固定好的皮膚組織適量，使用透射電子顯微鏡觀察各組大鼠成纖維細(xì)胞分布排列情況，膠原纖維分布排列情況、緊密程度，上皮細(xì)胞排列分布情況、結(jié)構(gòu)是否完好。

2.10 大鼠皮膚組織中TLR2、TLR4、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平測(cè)定

采用Western blotting法進(jìn)行測(cè)定。取凍存的皮膚組織適量，進(jìn)行裂解、蛋白提取和定量。取蛋白樣本，與上樣緩沖液混合，煮沸10 min進(jìn)行蛋白變性;取變性蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜、封閉，經(jīng)1×TBST漂洗1遍后，分別加入TLR2、TLR4、p-NF-κB p65一抗（稀釋比例均為1 ∶ 800）以及β-actin抗體（稀釋比例為1 ∶ 1 000），于4 ℃孵育過(guò)夜;加入生物素化山羊抗兔IgG二抗（稀釋比例為1 ∶ 5 000），在室溫下孵育2 h;經(jīng)1×TBST漂洗3遍后，以ECL顯色，運(yùn)用化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀成像，采用Image-Pro Plus 6.0圖像軟件進(jìn)行分析，以β-actin作為內(nèi)參，將目標(biāo)蛋白與內(nèi)參的灰度值比值作為目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量，并以模型組為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行歸一化處理。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 愈瘍膠囊對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC與MBC

愈瘍膠囊對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為25 mg/mL，MBC為50 mg/mL;后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，愈瘍膠囊高、中、低劑量組給藥劑量分別設(shè)為600、300、150 mg/kg。

3.2 愈瘍膠囊對(duì)細(xì)菌感染皮炎模型大鼠皮膚組織表征的影響

與模型組比較，給藥第1、3、5、7 天時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照組和愈瘍膠囊高、中劑量組大鼠傷處皮膚組織紅腫、化膿情況較輕，傷口結(jié)痂程度高，愈合速度快，愈合率均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。其中，給藥3 d愈瘍膠囊高、中劑量組大鼠傷處皮膚部分出現(xiàn)結(jié)痂情況，紅腫消失;給藥5～7 d愈瘍膠囊高、中劑量組部分大鼠傷處出現(xiàn)脫痂。愈瘍膠囊低劑量組大鼠僅給藥第7天時(shí)愈合率顯著升高（P<0.05）。與愈瘍膠囊低劑量組比較，除愈瘍膠囊中劑量組大鼠給藥第1天的愈合率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）外，其余各時(shí)間點(diǎn)陽(yáng)性對(duì)照組和愈瘍膠囊高、中劑量組大鼠的皮膚愈合率均顯著升高（P<0.01）。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，愈瘍膠囊高、中劑量組大鼠各時(shí)間點(diǎn)的皮膚愈合率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見(jiàn)表1。

3.3 愈瘍膠囊對(duì)細(xì)菌感染皮炎模型大鼠皮膚組織中炎癥因子含量的影響

與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和愈瘍膠囊高、中、低劑量組大鼠皮膚組織中IL-10、TNF-α含量，陽(yáng)性對(duì)照組與愈瘍膠囊高、中劑量組大鼠皮膚組織中IL-1β含量以及陽(yáng)性對(duì)照組與愈瘍膠囊高劑量組大鼠皮膚組織中IL-6含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與愈瘍膠囊低劑量組比較，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠皮膚組織中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α含量以及愈瘍膠囊高劑量組大鼠皮膚組織中IL-1β、TNF-α含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，愈瘍膠囊高、中劑量組大鼠皮膚組織中上述4個(gè)炎癥因子含量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見(jiàn)表2。

3.4 愈瘍膠囊對(duì)細(xì)菌感染皮炎模型大鼠皮膚組織中纖維蛋白含量的影響

與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和愈瘍膠囊高劑量組大鼠皮膚組織中HYP、Col Ⅰ、Col Ⅲ含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與愈瘍膠囊低劑量組比較，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠皮膚組織中HYP、Col Ⅰ、Col Ⅲ含量以及愈瘍膠囊高劑量組大鼠皮膚組織中HYP含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，愈瘍膠囊高、中劑量組大鼠皮膚組織中上述3個(gè)纖維蛋白含量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見(jiàn)表3。

3.5 愈瘍膠囊對(duì)細(xì)菌感染皮炎模型大鼠皮膚組織形態(tài)學(xué)變化的影響

與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和愈瘍膠囊高劑量組大鼠皮膚組織中可見(jiàn)較多纖維組織增生及少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，主要以核呈卵圓形或長(zhǎng)橢圓形的成纖維細(xì)胞增生為主，少量核呈長(zhǎng)梭形，胞質(zhì)較少，間質(zhì)可見(jiàn)少量中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)其他明顯病變;愈瘍膠囊中、低劑量組大鼠皮膚組織均出現(xiàn)部分區(qū)域損傷，真皮內(nèi)層可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，主要以中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主，個(gè)別損傷處表皮明顯增厚，少量成纖維細(xì)胞增生，其中低劑量組大鼠炎細(xì)胞浸潤(rùn)更嚴(yán)重，詳見(jiàn)圖1（圖中， 為成纖維細(xì)胞， 為細(xì)胞碎片，為炎細(xì)胞）。

與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和愈瘍膠囊高、中劑量組大鼠的病理評(píng)分均顯著降低（P<0.01）。與愈瘍膠囊低劑量組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和愈瘍膠囊高、中劑量組大鼠病理評(píng)分均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，愈瘍膠囊高、中劑量組大鼠皮膚組織病理評(píng)分差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見(jiàn)表4。

3.6 愈瘍膠囊對(duì)細(xì)菌感染皮炎模型大鼠皮膚組織超微結(jié)構(gòu)的影響

模型組大鼠皮膚組織中成纖維細(xì)胞生成少，排列紊亂，大部分細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量少，細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，胞核變形甚至溶解消失;陽(yáng)性對(duì)照組大鼠皮膚組織中成纖維細(xì)胞生成較多，排列整齊，且核多呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞內(nèi)微絲較多;愈瘍膠囊高、中劑量組大鼠皮膚組織中成纖維細(xì)胞生成較多，結(jié)構(gòu)較完整，細(xì)胞邊緣可見(jiàn)微絲;愈瘍膠囊低劑量組大鼠皮膚組織中可見(jiàn)纖維細(xì)胞增生，數(shù)量較少，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不明顯，排列紊亂，詳見(jiàn)圖2。

3.7 愈瘍膠囊對(duì)細(xì)菌感染皮炎模型大鼠皮膚組織中TLR2、TLR4、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平的影響

與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和愈瘍膠囊高、中、低劑量組大鼠皮膚組織中TLR2、TLR4、p-NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與愈瘍膠囊低劑量組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和愈瘍膠囊高、中劑量組大鼠皮膚組織中TLR2、TLR4（除愈瘍膠囊中劑量組外）、p-NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，愈瘍膠囊高劑量組大鼠皮膚組織中上述3個(gè)蛋白的表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），愈瘍膠囊中劑量組大鼠皮膚組織中上述3個(gè)蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），詳見(jiàn)圖3、表5。

4 討論

皮膚損傷愈合的過(guò)程可分為4個(gè)階段，即止血階段、炎癥階段、增殖階段和重塑階段[10]。損傷皮膚組織在血管收縮和止血后立即在傷口處產(chǎn)生炎細(xì)胞以消除病原體和細(xì)胞碎片，隨后通過(guò)角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞向傷口的遷移以及血管生成來(lái)實(shí)現(xiàn)肉芽組織的增殖[11]。近年來(lái)，抗生素是細(xì)菌性感染疾病的治療首選，但抗生素的毒副作用相當(dāng)大，嚴(yán)重者可造成患者耳聾等[12];同時(shí)，若長(zhǎng)期使用抗生素，易造成患者體內(nèi)菌群失調(diào)，誘導(dǎo)多重耐藥的條件致病菌、真菌的二重感染，增加治療難度[13]。具有抑菌作用的中藥復(fù)方或單方制劑因其不良反應(yīng)相對(duì)較輕且不易產(chǎn)生耐藥等優(yōu)點(diǎn)逐漸受到學(xué)者的關(guān)注。已有研究表明，中藥及其提取物（人參、桂皮、丹參等）可通過(guò)刺激血管生成和膠原合成而作為創(chuàng)傷修復(fù)的治療劑[14]。因此，開(kāi)發(fā)有效抑菌的中藥已成為相關(guān)研究的熱點(diǎn)之一。

金黃色葡萄球菌是人類(lèi)皮膚感染中最常見(jiàn)的病原體，也是院內(nèi)傷口感染的主要原因[15]。金黃色葡萄球菌可分泌毒力因子和毒素，以幫助病原體逃避宿主的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致重復(fù)慢性感染、長(zhǎng)期炎癥和感染傷口延遲愈合[16]。為了確定愈瘍膠囊的抑菌能力，本研究選用金黃色葡萄球菌為研究對(duì)象，首先測(cè)定了該藥的體外抑菌能力，用于確定其體內(nèi)實(shí)驗(yàn)劑量。結(jié)果，愈瘍膠囊對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為25 mg/mL，MBC為50 mg/mL;由MIC最終確定體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的高、中、低劑量分別為600、300、150 mg/kg。

評(píng)價(jià)皮膚感染與損傷程度的一個(gè)重要指標(biāo)就是觀察傷處皮膚表征，根據(jù)其是否出現(xiàn)紅腫、化膿、潰瘍等癥狀評(píng)價(jià)模型是否復(fù)制成功，并以此評(píng)價(jià)藥物的作用效果。在本研究中筆者發(fā)現(xiàn)，給藥第1、3、5、7天時(shí)，愈瘍膠囊高、中劑量組大鼠皮膚愈合率均顯著高于模型組，愈瘍膠囊低劑量組大鼠僅在給藥第7天時(shí)的皮膚愈合率顯著高于模型組，愈瘍膠囊高劑量組大鼠給藥第1、3、7天時(shí)的皮膚愈合率有高于陽(yáng)性對(duì)照組的趨勢(shì)。

皮膚組織中細(xì)胞的生成情況與細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化可以直觀地反應(yīng)皮膚愈合的程度，使用透射電鏡可以清楚地觀察細(xì)胞類(lèi)型與細(xì)胞結(jié)構(gòu)。HE染色結(jié)果顯示，模型組大鼠真皮及皮下組織均有不同程度壞死、出血，纖維組織增生，炎細(xì)胞浸潤(rùn)等系列病理改變，而陽(yáng)性對(duì)照組和愈瘍膠囊高劑量組大鼠病變程度明顯好轉(zhuǎn)，中、低劑量組大鼠病變好轉(zhuǎn)程度不及陽(yáng)性對(duì)照組和高劑量組。經(jīng)過(guò)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠大部分上皮細(xì)胞與纖維細(xì)胞的結(jié)構(gòu)被破壞，而新生的纖維細(xì)胞非常少，且排列紊亂，這跟細(xì)菌感染有密切關(guān)聯(lián)[17]。在使用愈瘍膠囊7 d后，損傷的纖維細(xì)胞明顯得到修復(fù)，壞死的細(xì)胞得到補(bǔ)充，上皮細(xì)胞開(kāi)始形成并分化，構(gòu)成基本的皮膚組織。這說(shuō)明愈瘍膠囊能誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞的形成，加快皮膚組織修復(fù)的速度。

損傷的皮膚容易被金黃色葡萄球菌入侵，造成化膿性感染，通過(guò)病原相關(guān)的分子模式和毒素激活多重促炎信號(hào)級(jí)聯(lián)，在局部和全身都引發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)[18]。據(jù)報(bào)道，角質(zhì)形成細(xì)胞可產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，包括IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等[19]。IL-1β是一個(gè)強(qiáng)有力的炎性細(xì)胞因子，當(dāng)細(xì)胞損傷時(shí)，被炎性小體激活，從宿主細(xì)胞中被釋放出來(lái)，幫助調(diào)節(jié)各種免疫反應(yīng)[20-21]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組與愈瘍膠囊高、中劑量組大鼠皮膚組織中IL-1β含量顯著降低，提示感染程度減輕，皮膚愈合加快[22]。與此同時(shí)，皮膚屏障被破壞后，細(xì)胞中IL-6、IL-10、TNF-α均可促進(jìn)傷口的炎癥反應(yīng)[23]。本研究中發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠皮膚組織中IL-6、IL-10、TNF-α含量和愈瘍膠囊高劑量組大鼠皮膚組織中TNF-α含量均顯著降低，提示愈瘍膠囊能減輕因感染引起的炎癥反應(yīng)。

在皮膚愈合的過(guò)程中，細(xì)胞外基質(zhì)的重建十分重要，而在這個(gè)階段，成纖維蛋白與膠原纖維含量的多少會(huì)對(duì)皮膚的修復(fù)起到關(guān)鍵作用[24]。HYP主要存在于皮膚、結(jié)締組織等地方，可反映膠原蛋白的含量[25]。ColⅠ和ColⅢ均是構(gòu)成皮膚組織的主要膠原成分，可協(xié)助創(chuàng)面修復(fù)，促進(jìn)皮膚愈合[26]。本研究中發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和愈瘍膠囊高劑量組大鼠HYP、ColⅠ和ColⅢ含量均顯著升高，提示愈瘍膠囊能加快大鼠皮膚修復(fù)。

感染性皮炎所涉及的炎癥通路非常復(fù)雜，其中TLR/NF-κB就是一條經(jīng)典通路[6-7]。TLR2是金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁成分的信號(hào)受體，同時(shí)還可作為其他常見(jiàn)細(xì)菌結(jié)構(gòu)模式的信號(hào)受體[23]。TLR4主要存在于淋巴組織中，由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞以及T、B淋巴細(xì)胞表達(dá)[27]。TLR家族可激活NF-κB過(guò)度釋放促炎細(xì)胞因子，引發(fā)炎癥。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和愈瘍膠囊高、中、低劑量組大鼠皮膚組織中TLR2、TLR4、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平均顯著降低，提示愈瘍膠囊能抑制TLR/NF-κB炎癥通路，使皮膚感染過(guò)程中炎癥因子的釋放減少，促進(jìn)皮膚愈合。

阿莫西林克拉維酸鉀是一種常用的口服廣譜抗菌藥，但是也存在明顯的缺點(diǎn)，長(zhǎng)期使用廣譜抗菌藥會(huì)是細(xì)菌耐藥概率增加[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，600 mg/kg的愈瘍膠囊和120 mg/kg的阿莫西林能在大鼠體內(nèi)產(chǎn)生相當(dāng)?shù)目寡仔Ч瑢?duì)膠原蛋白的生成與細(xì)胞修復(fù)效果均無(wú)明顯差異，而300 mg/kg愈瘍膠囊雖然也有抗炎效果，但效果不及阿莫西林。此外，在劑量高于阿莫西林克拉維酸鉀5倍的情況下，600 mg/kg的愈瘍膠囊也未導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)，進(jìn)一步說(shuō)明愈瘍膠囊的毒性較低，但其具體作用機(jī)制還需后期進(jìn)一步研究。

綜上所述，愈瘍膠囊可促進(jìn)細(xì)菌感染皮炎模型大鼠皮膚愈合，具有一定的抗炎作用，其機(jī)制可能與抑制TLR/NF-κB信號(hào)通路、減少炎癥反應(yīng)有關(guān)。

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（收稿日期：2020-11-05 修回日期：2021-01-08）

（編輯：鄒麗娟）