趙冀安 馬艷榮 聶文佳 董梁 劉文聰 谷敬鋒

摘 要 目的：研究溴苯基姜黃素（GL63）對人膽管癌RBE細胞凋亡、遷移和侵襲的影響，并基于Janus激酶（JAK）/信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）信號通路探討其作用機制。方法：采用MTT法檢測不同濃度GL63[0（空白對照，下同）、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L]作用48 h對RBE細胞增殖的影響，并計算其半數(shù)抑制濃度（IC50）;采用結(jié)晶紫染色法檢測不同濃度GL63（0、5、10、20 μmol/L）作用48 h對細胞集落形成的影響;分別采用流式細胞術(shù)、Hoechst 33342染色法、細胞劃痕實驗、Transwell小室侵襲實驗檢測不同濃度GL63（0、5、10、20 μmol/L）作用24 h對細胞周期分布、凋亡情況以及細胞遷移和侵襲能力的影響;采用Western blotting法檢測不同濃度GL63（0、5、10、20 μmol/L）作用24 h對細胞中JAK2/STAT3信號通路腫瘤相關(guān)蛋白表達的影響。結(jié)果：不同濃度GL63組（1.25～40 μmol/L）RBE細胞的增殖抑制率均較空白對照組顯著升高（P<0.01），并呈劑量依賴趨勢;其IC50為（8.46±1.30） μmol/L。與空白對照組比較，不同濃度GL63組（5、10、20 μmol/L）RBE細胞的集落形成抑制率均顯著降低（P<0.01）;G0/G1期細胞占比均顯著升高，S期細胞占比均顯著降低（P<0.01）;細胞凋亡率均顯著升高（P<0.01），且細胞核呈濃染致密的固縮形態(tài)并可見凋亡小體;細胞遷移愈合率均顯著降低（P<0.01），穿過基底膜的侵襲細胞數(shù)均顯著減少（P<0.01）;細胞中磷酸化JAK2、磷酸化STAT3、B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9、前體胱天蛋白酶9（Pro-caspase-9）、Pro-caspase-3蛋白表達水平均顯著降低，Bcl-2相關(guān)x蛋白（Bax）、細胞色素C、裂解Caspase-9（Cleaved-caspase-9）、Cleaved-caspase-3蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01）。結(jié)論：GL63能通過抑制JAK2/STAT3信號通路來實現(xiàn)對人膽管癌RBE細胞增殖、遷移和侵襲的抑制并誘導其發(fā)生凋亡。

關(guān)鍵詞 溴苯基姜黃素;膽管癌;RBE細胞;Janus激酶2/信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子3信號通路;遷移;侵襲;凋亡

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the effects of bromophenylcurcumin（GL63） on the apoptosis， migration and invasion of human cholangiocarcinoma RBE cells， and to investigate its mechanism based on JAK/STAT signaling pathway. METHODS： MTT assay was used to detect the effects of different concentrations of GL63 [0（blank control， similarly hereinafter）， 1.25， 2.5， 5， 10， 20， 40 μmol/L] on the proliferation of RBE cells after 48 h treatment; the IC50 was calculated. The effects of different concentrations of GL63 （0， 5， 10， 20 μmol/L） on colony formation were detected by crystal violet staining after 48 h treatment. Flow cytometry， Hoechst 33342 staining， cell scratch test and Transwell chamber invasion test were used to detect the effects of different concentrations of GL63 （0， 5， 10， 20 μmol/L） on cell cycle distribution， apoptosis， migration and invasion ability after 24 h treatment. Western blotting assay was adopted to detect the effects of different concentration of GL63 （0， 5， 10， 20 μmol/L） on the expression of JAK2/STAT3 signal pathway associated proteins. RESULTS： The proliferation inhibition rates of RBE cells in different concentrations of GL63 groups （1.25-40 μmol/L） were significantly increased， compared with blank control group? （P<0.01）， and showed a dose-dependent trend， with IC50 of （8.46±1.30） μmol/L. Compared with blank control group， inhibition rates of RBE cell colony formation were significantly decreased in different concentrations （5， 10， 20? μmol/L） of GL63 groups （P<0.01）. The percentage of RBE cells at G0/G1 phase increased significantly， while that at S phase decreased significantly （P<0.01）. The apoptotic rate increased significantly （P<0.01）， and the nucleus showed dense pyknosis and apoptotic bodies. The rate of cell migration and healing was significantly decreased （P<0.01）， and the number of invasive cells through basement membrane was significantly decreased （P<0.01）. The protein expression of p-JAK2， p-STAT3， Bcl-2， MMP-2， MMP-9， Pro-caspase-9 and Pro-caspase-3 were down-regulated significantly while the expression of Bax， Cyt-c， Cleaved-caspase-9 and Cleaved-caspase-3 were up-regulated significantly （P<0.01）. CONCLUSIONS： GL63 may inhibit the proliferation，migration and invasion of RBE cells and promote its apoptosis by inhibiting JAK2/STAT3 signal pathway.

KEYWORDS? ?Bromophenylcurcumin; Cholangiocarcinoma; RBE cell; JAK2/STAT3 signal pathway; Migration; Invasion; Apoptosis

膽管癌是一種來源于膽管上皮細胞的高度侵襲性惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率均呈上升趨勢[1]。膽管癌的惡性程度高、發(fā)病隱匿、診治困難，雖然外科根治性切除術(shù)為目前臨床治療膽管癌的首選，但患者術(shù)后預后較差[2]，所以尋找抑制膽管癌細胞增殖、侵襲的有效藥物，是目前臨床亟待解決的主要問題。姜黃素是從姜科植物中提取的一種植物多酚類物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等多種生物學活性，但是臨床研究顯示由于其生理條件下的不穩(wěn)定性，使得該成分的生物活性和藥動學行為均不理想，從而造成其在抗癌治療方面的應用受限[3-4]。本研究選用了一種新的姜黃素衍生物——溴苯基姜黃素（GL63）為對象。與姜黃素相比，GL63的水溶性和穩(wěn)定性大為提高，并具有較高的細胞通透性，體現(xiàn)出較高的生物利用度和較強的藥理活性[5]。研究發(fā)現(xiàn)，Janus激酶（JAK）/信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）信號通路與膽管癌的發(fā)生密切相關(guān)[6]。因此，本課題組通過體外研究觀察GL63作用于人膽管癌細胞后對細胞凋亡、遷移和侵襲行為的影響，同時通過JAK2/STAT3信號通路腫瘤相關(guān)蛋白探索其可能機制，以期為膽管癌的治療提供新的思路與藥物選擇。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究涉及的主要儀器包括：NU-400-400E型超凈工作臺（美國ShelLab公司），F(xiàn)ORM 361型細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Electronic公司），TGL16型高速離心機（長沙英泰儀器有限公司），TC20型細胞計數(shù)儀、xMark型酶標儀（美國Bio-Rad公司），AE31型倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)（德國Motic公司），CKX31型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司），D2060R型流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司），HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州億通分析儀器制造有限公司），DYCZ-24DN型垂直電泳儀（北京市六一儀器廠），BOX XR型凝膠成像分析系統(tǒng)（英國Syngene公司），F(xiàn)A1004型電子天平（上海越平科學儀器有限公司）。

1.2 主要藥品和試劑

姜黃素原料藥（批號78246，純度99.5%）、RPMI? 1640培養(yǎng)基均購自美國Sigma公司;GL63原料藥（純度>99.5%）由河北科技大學化學與制藥工程學院劉守信教授合成并鑒定;膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin Ⅴ-FITC/PI）細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;兔抗人JAK2、磷酸化JAK2（p-JAK2）、STAT3、磷酸化STAT3（p-STAT3）、B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)x蛋白（Bax）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9、細胞色素C（Cyt-c）、前體胱天蛋白酶9（Pro-caspase-9）、裂解Caspase-9（Cleaved-caspase-9）、Pro-caspase-3、Cleaved-caspase-3、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體（批號分別為ab39636、ab195055、ab137803、ab131103、ab59348、ab53154、ab97779、ab38898、ab90529、ab69541、ab2324、ab90437、ab49822、ab37168）和MTT試劑均購自英國Abcam公司;辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗（批號sc-2025）購自美國Santa Cruz公司;胎牛血清購自美國Gibco公司;基質(zhì)膠購自美國BD公司;細胞總蛋白質(zhì)抽提試劑、蛋白定量試劑盒、結(jié)晶紫試液均購自北京索萊寶科技有限公司;ECL發(fā)光檢測試劑盒購自美國Millipore公司;Hoechst 33342藍色熒光染料購自美國BioVision公司;0.25%胰酶購自武漢尚恩生物技術(shù)有限公司;其余試劑為分析純，水為蒸餾水。

1.3 細胞

人膽管癌RBE細胞株來自中國科學院北京細胞生物研究所。

2 方法

2.1 GL63對RBE細胞增殖的影響考察

采用MTT法進行檢測。取RBE細胞，以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基（以下簡稱“完全培養(yǎng)基”）于5%CO2、37 ℃（以下培養(yǎng)條件相同）的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當培養(yǎng)瓶底部貼壁細胞達90%以上時，用0.25%胰酶消化后進行傳代。將對數(shù)生長期細胞用培養(yǎng)基調(diào)整為1×105個/mL，按100 μL/孔接種于96孔板中，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h待細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基。將細胞分組并分別加入含有不同濃度GL63[終濃度均為0（空白對照，下同）、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L;劑量根據(jù)文獻[3-5]及本課題組前期預試驗結(jié)果設置]的RPMI 1640培養(yǎng)基（含0.1%二甲基亞砜），每組設3個復孔。培養(yǎng)48 h后，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，避光繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)完畢后，用酶標儀于450 nm波長下檢測各孔的光密度（OD）值并計算細胞增殖抑制率：增殖抑制率=（空白對照組OD值-給藥組OD值）/空白對照組OD值×100%;采用SPSS 13.0軟件根據(jù)藥物濃度和細胞增殖抑制率計算GL63的半數(shù)抑制濃度（IC50）。試驗重復3次。

2.2 GL63對RBE細胞集落形成的影響考察

采用結(jié)晶紫法進行檢測。將對數(shù)生長期RBE細胞以0.25%胰酶消化后，以500個/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)待其貼壁后，棄去培養(yǎng)基。將細胞分組并分別加入含不同濃度GL63（0、5、10、20 μmol/L，劑量根據(jù)“2.1”項MTT法試驗和本課題組前期預試驗結(jié)果設置，下同）的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后取出，持續(xù)替換新鮮的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d使細胞形成集落。培養(yǎng)結(jié)束后，細胞用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.4）洗滌，并用4%多聚甲醛溶液固定20 min，再以1%結(jié)晶紫試液染色。在倒置相差顯微鏡下觀察細胞增殖形成的集落，對其進行計數(shù)并計算集落形成抑制率：集落形成抑制率（%）=給藥組集落均數(shù)/空白對照組集落均數(shù)×100%。試驗重復3次。

2.3 GL63對RBE細胞周期分布和凋亡的影響考察

采用流式細胞術(shù)對細胞周期分布和凋亡情況進行檢測。將對數(shù)生長期RBE細胞以0.25%胰酶消化后，以1×105個/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h待細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基。將細胞分組并分別加入含不同濃度GL63（0、5、10、20 μmol/L）的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后收集、洗滌細胞。在細胞中先后加入Annexin Ⅴ-FITC、PI試劑各5 μL，混勻，于室溫下避光反應15 min后，用流式細胞儀進行細胞周期和細胞凋亡檢測。試驗重復3次。

另采用Hoechst 33342染色法對細胞凋亡情況進行檢測。將對數(shù)生長期RBE細胞以0.25%胰酶消化后，按1×105個/孔接種于6孔板中，蓋上蓋玻片培養(yǎng)24 h使細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基。將細胞分組并分別加入含不同濃度GL63（0、5、10、20 μmol/L）的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。吸棄上清液，用PBS清洗2次后，每孔加入固定液固定10 min;以PBS漂洗3次后，滴加Hoechst 33342藍色熒光染料100 μL，室溫放置10 min;用PBS清洗3次再晾干后，以340 nm波長的紫外光激發(fā)，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 GL63對RBE細胞遷移的影響考察

采用劃痕實驗進行檢測。將對數(shù)生長期RBE細胞以0.25%胰酶消化后，按1×105個/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h待其融合至90%，采用尖端粗細相同的無菌槍頭垂直劃線;用PBS清洗除去懸浮的細胞后，將余下細胞分組并分別加入含不同濃度GL63（0、5、10、20 μmol/L）的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后，于倒置相差顯微鏡下觀察劃痕距離，每個樣品隨機選取5個視野，分別測量并計算初始劃痕時和加藥培養(yǎng)完畢后的劃痕距離的差值（即細胞遷移距離）并取平均值。計算細胞遷移愈合率：遷移愈合率=細胞遷移距離平均值/初始劃痕距離均值×100%。實驗重復3次。

2.5 GL63對RBE細胞侵襲的影響考察

采用Transwell小室侵襲實驗進行檢測。將對數(shù)生長期RBE細胞以0.25%胰酶消化后，按1.5×105個/mL接種于Transwell小室上室（鋪有基質(zhì)膠，加入菌液體積為0.5 mL），下室加入等體積完全培養(yǎng)基，然后上下室均分別加入含不同濃度GL63（0、5、10、20 μmol/L）的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，用棉簽擦去上室漂浮的細胞，再用4%多聚甲醛溶液固定細胞15 min，再浸入結(jié)晶紫試液中染色20 min，在倒置相差顯微鏡（100倍）下隨機選取5個視野進行拍照并對細胞進行計數(shù)，取平均值。實驗重復3次。

2.6 GL63對RBE細胞中JAK2/STAT3信號通路腫瘤相關(guān)蛋白表達的影響考察

采用Western blotting法進行檢測。將對數(shù)生長期RBE細胞按照“2.3”項下方法消化、接種、培養(yǎng)，分別加入含不同濃度GL63（0、5、10、20 μmol/L）的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h;棄去培養(yǎng)液，加入蛋白裂解液冰浴裂解25 min后，收集細胞裂解液，于4 ℃下以15 000 r/min離心30 min，收集上清液，采用BCA法測定蛋白濃度。上清液經(jīng)蛋白上樣緩沖液稀釋后，于100 ℃下變性5 min。取變性后的蛋白適量，進行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上;用5%脫脂牛奶封閉后，加入JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-9、Cyt-c、Pro-caspase-9、Cleaved-caspase-9、Pro-caspase-3、Cleaved-caspase-3和GAPDH一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），4 ℃下孵育過夜;以TBST緩沖液洗膜，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 500），室溫下孵育2 h;以TBST緩沖液洗膜經(jīng)ECL化學發(fā)光試劑處理后，使用凝膠成像分析系統(tǒng)采集圖像。采用Image J 5.0軟件分析相應目標蛋白條帶與內(nèi)參GAPDH條帶的灰度值之比，用來表示目標蛋白的表達水平。試驗重復3次。

2.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 GL63對RBE細胞增殖的影響

結(jié)果顯示，與空白對照組比較，經(jīng)不同濃度GL63（1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L）作用48 h后，細胞的增殖抑制率均顯著升高（P<0.01），分別為（6.58±1.21）%、（15.28±1.64）%、（33.66±1.92）%、（52.53±2.16）%、（76.25±2.63）%、（92.28±3.67）%，且這一抑制作用有隨著藥物濃度升高而逐漸升高的趨勢，詳見圖1。經(jīng)計算，GL63對RBE細胞的IC50為（8.46±1.30） μmol/L。

3.2 GL63對RBE細胞集落形成的影響

結(jié)果顯示，與空白對照組比較，不同濃度GL63組（5、10、20 μmol/L）細胞的集落密度均有所減少，其集落抑制率分別為（64.88±3.45）%、（34.70±2.57）%、（15.10±1.78）%，較空白對照組（100%）均顯著降低（P<0.01），且有隨著藥物濃度升高而逐漸降低的趨勢，詳見圖2。

3.3 GL63對RBE細胞周期的影響

結(jié)果顯示，與空白對照組比較，不同濃度GL63組（5、10、20 μmol/L）G0/G1期細胞占比均顯著升高，S期細胞占比均顯著降低（P<0.01），且均有隨著藥物濃度升高而升高/降低更明顯的趨勢，詳見圖3、表1。

3.4 GL63對RBE細胞凋亡的影響

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比較，不同濃度GL63組（5、10、20 μmol/L）細胞凋亡率均顯著升高（P<0.01），且有隨著藥物濃度升高而升高的趨勢，詳見圖4、表1。

Hoechst 33342染色法結(jié)果顯示，空白對照組細胞核呈現(xiàn)彌散均勻的低強度藍色熒光，細胞核完整且染色均勻。不同濃度GL63組（5、10、20 μmol/L）均可見致密濃染的凋亡細胞，表現(xiàn)為核染色質(zhì)的固縮濃集、破裂、藍色熒光強度增大且不均勻的典型凋亡現(xiàn)象，并可見凋亡小體;其凋亡率均較空白對照組顯著升高（P<0.01），且有隨著藥物濃度升高而升高的趨勢，詳見圖5、表1。

3.5 GL63對RBE細胞遷移和侵襲能力的影響

劃痕實驗結(jié)果顯示，與空白對照組比較，不同濃度GL63組（5、10、20 μmol/L）細胞的橫向遷移距離均有縮短，遷移愈合率顯著降低（P<0.01），且有隨著藥物濃度升高而降低的趨勢，詳見圖6、表2。Transwell小室侵襲實驗結(jié)果顯示，與空白對照組比較，不同濃度GL63組（5、10、20 μmol/L）穿過基底膜的侵襲細胞數(shù)均顯著減少（P<0.01），且有隨著藥物濃度升高而減少的趨勢，詳見圖7、表2。

3.6 GL63對RBE細胞中JAK2/STAT3信號通路腫瘤相關(guān)蛋白表達的影響

結(jié)果顯示，與空白對照組比較，不同濃度GL63組（5、10、20 μmol/L）細胞中p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Pro-caspase-9、Pro-caspase-3蛋白表達水平均顯著降低，Bax、Cyt-c、Cleaved-caspase-9、Cleaved- caspase-3蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01），且均有隨著藥物濃度升高而降低/升高的趨勢;JAK2、STAT3蛋白表達水平在各組之間差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），詳見圖8、圖9、表3、表4。

4 討論

據(jù)研究報道，姜黃素在體外可阻滯膽管細胞系的細胞周期，發(fā)揮細胞毒性作用，可抗細胞增殖并誘導其凋亡[7]。但由于其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定使應用受限，因此有研究者通過刪除其結(jié)構(gòu)中活性β-二酮部分，設計并合成了姜黃素的單羰基類似物GL63，即（1E，4E）-1，5-雙（2-溴苯基）戊-1，4-二烯-3-酮[8]。研究表明，GL63不僅在體外具有較強的穩(wěn)定性和抗腫瘤活性，而且在體內(nèi)也表現(xiàn)出比姜黃素更理想的藥動學行為[9]。還有研究表明，GL63對人肝癌HepG2細胞和人鼻咽癌CNE2細胞的毒性作用是基于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑而誘導的細胞周期停滯;而且GL63和姜黃素均未誘導正常肝細胞凋亡，這表明GL63沒有明顯的毒性，與姜黃素類似[10-11]。本研究表明，GL63抑制人膽管癌RBE細胞增殖和集落形成的能力有隨著藥物濃度升高而增強的趨勢;GL63抑制RBE細胞增殖的IC50為（8.46±1.30） μmol/L，與姜黃素IC50（21.5 μmol/L）[4]相比明顯降低。這些結(jié)果表明，姜黃素衍生化合物GL63有望被開發(fā)為有效、安全的新型抗腫瘤藥物。

細胞周期停滯和形態(tài)變化是腫瘤細胞增殖受到抑制的主要特征[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，隨著GL63作用濃度的升高，RBE細胞在G0/G1期的占比顯著升高、S期占比顯著降低;細胞核染色質(zhì)表現(xiàn)為固縮濃集、破裂、藍色熒光強度增強且不均勻的典型凋亡現(xiàn)象;細胞凋亡率也顯著升高。這也進一步證實了GL63可抑制RBE細胞的增殖。

JAK2/STAT3信號通路的激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程緊密相關(guān)，其能促進腫瘤細胞增殖、抑制其凋亡，可調(diào)節(jié)涉及各種生理功能的靶蛋白的表達，包括抗凋亡蛋白（Bcl?xl、Bcl?2）、促凋亡蛋白（Bax）和線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白（Cyt-c、Caspase-3、Caspase-9）[13]。重要的是，激活的JAK2/STAT3信號通路已被廣泛驗證為治療人類腫瘤的新型分子靶標[14]。本研究基于JAK2/STAT3信號通路腫瘤相關(guān)蛋白考察了GL63對人膽管癌RBE細胞的抑制作用，并證實GL63可有效抑制JAK2和STAT3蛋白的活化（即磷酸化），從而抑制細胞增殖并誘導細胞凋亡;同時認為，GL63對RBE細胞的增殖具有抑制作用，其機制可能是通過抑制JAK2/STAT3信號通路來介導的。

腫瘤患者預后較差的重要原因是腫瘤細胞發(fā)生侵襲和遠處轉(zhuǎn)移，所以降低膽管癌細胞的遷移、侵襲能力是預防其轉(zhuǎn)移的有效手段。MMP被公認為是能夠在腫瘤細胞侵襲過程中破壞組織屏障細胞外基質(zhì)的蛋白內(nèi)切酶[15]。MMP-2和MMP-9表達水平的升高提示腫瘤細胞侵襲能力增強[16]，因此抑制MMP蛋白的表達被認為是預防癌癥轉(zhuǎn)移的早期靶點[17-18]。本研究通過劃痕實驗和Transwell小室侵襲實驗發(fā)現(xiàn)，GL63可以有效地抑制RBE細胞遷移和侵襲。與空白對照組比較，經(jīng)不同濃度GL63處理后，RBE細胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表達水平均顯著降低，且有隨著藥物濃度升高而降低的趨勢。這提示GL63可能通過抑制MMP-2和MMP-9的表達從而抑制RBE細胞的遷移和侵襲。

已有研究表明，不同藥物對JAK2/STAT3信號通路的調(diào)節(jié)可通過內(nèi)源性線粒體途徑誘導細胞凋亡[19]。Bcl-2蛋白家族是細胞凋亡研究中最重要的癌基因之一，在線粒體介導的內(nèi)源性凋亡通路中起著重要的作用，其包括抑制凋亡蛋白Bcl-2和誘導凋亡蛋白Bax兩大類[20-21]。內(nèi)源性線粒體途徑是在Bcl-2蛋白家族的調(diào)節(jié)下在線粒體水平上啟動的[22]。當外源刺激激活線粒體中的Bcl-2和Bax時，線粒體的膜通透性將發(fā)生變化[23];隨后，線粒體中的Cyt-c大量釋放到細胞質(zhì)中，進而促使Caspase-9和Caspase-3激活而轉(zhuǎn)化為活性狀態(tài)（Cleaved-caspases），最終導致細胞凋亡[24]。線粒體通過激活細胞死亡起始因子Caspase-9介導凋亡信號轉(zhuǎn)導，激活的Caspase-9激活切割執(zhí)行者Caspase-3，然后活化的Caspase-3會裂解聚二磷酸腺苷核糖聚合酶，進而導致細胞凋亡[25]。本研究顯示，GL63處理可以降低RBE細胞中JAK2和STAT3蛋白磷酸化水平，誘導Bcl-2蛋白表達下調(diào)和Bax蛋白表達上調(diào);同時，GL63能升高Cyt-c表達水平，使Pro-caspase-9和Pro-caspase-3蛋白表達下調(diào)、Cleaved-caspase-9和Cleaved-caspase-3蛋白表達上調(diào)，提示Caspase-9和Caspase-3被激活。這也證明，GL63可同時通過線粒體介導的內(nèi)源性途徑來誘導RBE細胞發(fā)生凋亡。

綜上所述，GL63能通過抑制JAK2/STAT3信號通路來實現(xiàn)對人膽管癌RBE細胞增殖、遷移和侵襲的抑制并誘導其發(fā)生凋亡;其具備成為有效治療或預防膽管癌的藥物的潛能。

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（收稿日期：2020-07-30 修回日期：2021-01-10）

（編輯：段思怡）