佟志強(qiáng) 吳東媛 張娟 程夢(mèng)飛 張碩 董梅

摘 要 目的：建立同時(shí)測(cè)定人血漿中5-氟尿嘧啶（5-FU）及其代謝產(chǎn)物5-氟-5，6-二氫尿嘧啶（5-FUH2）濃度的方法，并應(yīng)用于臨床。方法：血漿樣品經(jīng)乙酸乙酯二次萃取處理后，以5-溴尿嘧啶（5-Bru）為內(nèi)標(biāo)，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（UPLC-MS/MS）測(cè)定。色譜柱為Acquity UPLC HSS T3，流動(dòng)相為甲醇-水（30 ∶ 70，V/V），流速為0.3 mL/min，柱溫為20 ℃，進(jìn)樣量為5 μL。采用電噴霧離子源，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)進(jìn)行負(fù)離子掃描，毛細(xì)管電壓為1.5 kV，錐孔電壓為20 V，脫溶劑溫度為450 ℃，脫溶劑氣流為850 L/h，錐孔氣流速為50 L/h;用于定量分析的離子對(duì)分別為m/z 129.00→41.90（5-FU）、m/z 130.87→82.92（5-FUH2）、m/z 189.00→42.10（5-Bru）。選擇2020年8-10月哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院接受5-FU持續(xù)靜脈滴注46 h為基礎(chǔ)化療方案治療的晚期結(jié)直腸癌患者10例，測(cè)定其持續(xù)靜脈滴注18～30 h時(shí)的5-FU穩(wěn)態(tài)血藥濃度及5-FUH2血藥濃度，計(jì)算5-FU藥-時(shí)曲線下面積（AUC）和5-FUH2/5-FU濃度比值。結(jié)果：5-FU、5-FUH2檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍均為20～1 000 ng/mL（R 2均大于0.990），定量下限均為20 ng/mL;精密度試驗(yàn)的RSD均小于20%，相對(duì)誤差在±10%范圍內(nèi);提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)均不影響待測(cè)物的測(cè)定。10例晚期結(jié)直腸癌患者中，5-FU穩(wěn)態(tài)血藥濃度為180.04～622.83 ng/mL，AUC為8.28～28.65 mg·h/L;5-FUH2血藥濃度為336.48～948.43 ng/mL;5-FUH2/5-FU濃度比值為0.93～4.21;10例患者的5-FU AUC存在約3～4倍的個(gè)體差異。結(jié)論：所建方法精密度、準(zhǔn)確性均較好，靈敏度較高且操作簡(jiǎn)便，可用于晚期結(jié)直腸癌患者體內(nèi)5-FU血藥濃度的監(jiān)測(cè)。

關(guān)鍵詞 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;5-氟尿嘧啶;5-氟-5，6-二氫尿嘧啶;血藥濃度

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the method for simultaneous determination of 5-fluorouracil （5-FU） and its metabolites 5-fluoro-5，6-dihydrouracil （5-FUH2） in human plasma， and apply it in the clinic. METHODS： After plasma samples were processed twice by ethyl acetate， UPLC-MS/MS method was adopted using 5-bromouracil （5-Bru） as internal standard. The determination was performed on Acquity UPLC HSS T3 column with mobile phase consisted of methanol-water （30 ∶ 70， V/V） at the flow rate of 0.3 mL/min. The column temperature was 20 ℃， and sample size was 5 μL. An electrospray ion source was used to carry out negative ion scanning with multiple reaction monitoring. The capillary voltage was 1.5 kV; the taper hole voltage was 20 V; the desolvent temperature was 450 ℃; the desolvent air flow was 850 L/h; the cone hole gas velocity was 50 L/h. The ion transitions for quantitative analysis were m/z 129.00→41.90（5-FU），m/z 130.87→82.92（5-FUH2）， m/z 189.00→42.10（5-Bru）， respectively.? From Aug. to Oct. 2020， 10 patients with advanced colorectal cancer were treated with continuous intravenous drip of 5-FU for 46 hours were collected from Harbin Medicinal University Cancer Hospital. Steady-state plasma concentration of 5-FU and plasma concentration of 5-FUH2 were determined at 18-30 h of continuous intravenous drip. The area under the curve （AUC） for 5-FU and concentration ratio of 5-FUH2/5-FU were calculated. RESULTS： The linear range of 5-FU and 5-FUH2 were 20 to 1 000? μg/mL （R 2>0.990）. The quantification limits were 20 ng/mL. RSDs of precision test were all lower than 20%， and relative error ranged ±10%. The extraction recovery and matrix effects didnt affect the determination of substance to be measured. Among 10 patients with advanced colorectal cancer， the steady-state concentration of 5-FU were 180.04-622.83 ng/mL， and AUC of 5-FU ranged from 8.28 to 28.65 mg·h/L. The concentration of 5-FUH2 ranged 336.48-948.43 ng/mL， and concentration ratio of 5-FUH2/5-FU ranged 0.93-4.21. AUC of 5-FU in 10 patients had about 3-4 fold individual differences. CONCLUSIONS： The established method has good precision and accuracy， high sensitivity， and simple operation. It can be used for plasma monitoring of 5-FU in patients with advanced colorectal cancer.

KEYWORDS? ?UPLC-MS/MS; 5-FU; 5-FUH2; Plasma concentration

氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）可同時(shí)抑制腫瘤細(xì)胞DNA和RNA的合成，是晚期結(jié)直腸癌患者化療的基石[1-3]。其作為抗代謝類細(xì)胞毒性藥物，治療窗相對(duì)較窄，能在濃度暴露水平重疊的情況下發(fā)揮療效并產(chǎn)生毒性[4]。在臨床應(yīng)用中，5-FU和卡培他濱、奧沙利鉑等化療藥物相似，其給藥劑量均根據(jù)患者的體表面積（BSA）確定。但有研究發(fā)現(xiàn)，基于BSA給藥時(shí)，5-FU體內(nèi)清除率存在較大的個(gè)體差異，差異高達(dá)10～100倍[5]。目前，5-FU的治療藥物監(jiān)測(cè)（TDM）研究發(fā)現(xiàn)，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)藥-時(shí)曲線下面積（AUC）與療效和安全性具有相關(guān)性，在5-FU持續(xù)靜脈滴注的方案中，5-FU AUC可以用5-FU穩(wěn)態(tài)血藥濃度（css）和持續(xù)靜脈滴注時(shí)間（TCI）的乘積來(lái)計(jì)算[4]。由此，筆者認(rèn)為基于5-FU 的AUC來(lái)調(diào)整其臨床劑量是可行的。

二氫嘧啶脫氫酶（DPD）可清除體內(nèi)80%～90%的5-FU，是該藥體內(nèi)分解代謝的關(guān)鍵限速酶[4]。有研究表明，一般人群中，DPD酶活性偏低和完全缺乏者分別占全部人群的3%～5%和0～0.1%，DPD酶活性偏低或缺乏會(huì)造成患者體內(nèi)5-FU血藥濃度升高而致蓄積中毒，從而引發(fā)嚴(yán)重的骨髓抑制和胃腸道反應(yīng)等，因此DPD酶活性是預(yù)測(cè)5-FU相關(guān)不良反應(yīng)的生物標(biāo)志物之一[4-6]。DPD酶由DPYD基因編碼，目前除檢測(cè)患者DPYD基因多態(tài)性外，還可將二氫尿嘧啶（UH2）/尿嘧啶（U）濃度比值或5-氟-5，6-二氫尿嘧啶（5-FUH2）/5-FU濃度比值作為DPD酶活性的表型指標(biāo)[4]。5-FUH2是5-FU在體內(nèi)經(jīng)DPD酶分解產(chǎn)生的主要代謝產(chǎn)物，已有研究證實(shí)，5-FUH2的血藥濃度與5-FU引起的不良反應(yīng)具有相關(guān)性[7-8]。因此，測(cè)定5-FU和5-FUH2血藥濃度既可用于計(jì)算5-FU的AUC，又可用于評(píng)估DPD酶活性。

目前，5-FU TDM的常用方法包括高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）和免疫分析法，其中HPLC法和LC-MS/MS法是測(cè)定5-FU血藥濃度的經(jīng)典方法，準(zhǔn)確度、靈敏度較高，但分析速度較慢[9-10]。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（UPLC-MS/MS）具有較高的準(zhǔn)確度和靈敏度，且分析時(shí)間較短，更適合于臨床樣本的批量檢測(cè)[4]?；诖耍狙芯拷⒘送瑫r(shí)測(cè)定人血漿中5-FU和5-FUH2濃度的UPLC-MS/MS法;同時(shí)，采用該方法對(duì)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院使用以5-FU為基礎(chǔ)化療方案的晚期結(jié)直腸癌患者的5-FU和5-FUH2血藥濃度進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算5-FU的AUC，旨在為調(diào)整下一周期5-FU的化療劑量調(diào)整以及患者的個(gè)體化用藥提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

實(shí)驗(yàn)所用主要儀器有：Waters ACQUITY H-Class型UPLC儀（配有UPLC系統(tǒng)和質(zhì)譜檢測(cè)器）、Waters Xevo TQ-MS檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司），TI-H20型多頻超聲波清洗儀（德國(guó)ELMA公司），BS14-TM-1F型數(shù)顯渦旋震蕩器（德國(guó)WIGGENS公司），D-35720型低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），EX324型十萬(wàn)分之一電子天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司]，JT-DCY-12SL型水浴氮吹儀（杭州聚同電子有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

實(shí)驗(yàn)所用主要藥品與試劑有：5-FU對(duì)照品（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)F100149，純度99%）、5-FUH2對(duì)照品（美國(guó)Cayman公司，批號(hào)0496883-6，純度99%）、5-溴尿嘧啶對(duì)照品（5-Bru，內(nèi)標(biāo)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司，批號(hào)852473，純度98%）等;人空白血漿由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院提供;甲醇、乙腈、甲酸均為質(zhì)譜級(jí)，乙酸乙酯為色譜純，水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 以Acquity UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）為色譜柱，以甲醇-水（30 ∶ 70，V/V）為流動(dòng)相，流速為0.3 mL/min，柱溫為20 ℃，進(jìn)樣量為5 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子源（ESI），掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM） 模式，掃描方式為負(fù)離子模式，毛細(xì)管電壓為1.5 kV，錐孔電壓為20 V，脫溶劑溫度為450 ℃，脫溶劑氣流為850 L/h，錐孔氣流速為50 L/h;用于定量分析的離子對(duì)分別為m/z 129.00→41.90（5-FU）、m/z 130.87→82.92（5-FUH2）、m/z 189.00→42.10（5-Bru）。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取5-FU、5-FUH2對(duì)照品各10.00 mg，分別置于100 mL棕色量瓶中，加50%甲醇定容，混勻，制成5-FU、5-FUH2質(zhì)量濃度均為100 mg/L的單一對(duì)照品貯備液。精密吸取上述各單一對(duì)照品貯備液適量，分別加50%甲醇稀釋，制成5-FU、5-FUH2質(zhì)量濃度均為10 mg/L的單一對(duì)照品溶液，置于4 ℃冰箱中保存，備用。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取5-Bru對(duì)照品10.00 mg，置于100 mL棕色量瓶中，加50%甲醇定容，混勻，制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的5-Bru貯備液。精密吸取上述貯備液適量，加50%甲醇稀釋，制成質(zhì)量濃度為2 000 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，置于4 ℃冰箱中保存，備用。

2.2.3 質(zhì)控樣品溶液 取“2.2.1”項(xiàng)下5-FU、5-FUH2單一對(duì)照品溶液適量，分別加空白血漿稀釋，制成質(zhì)量濃度分別為20、50、400、800 ng/mL的5-FU、5-FUH2質(zhì)控樣品溶液。

2.3 血漿樣品的處理

取空白血漿適量，置于37 ℃水浴中融解，精密吸取200 μL，置于1.5 mL離心管中，加“2.2.2”項(xiàng)下內(nèi)標(biāo)溶液25 μL，渦旋30 s，混勻，加乙酸乙酯1 mL，渦旋1 min;于4 ℃下以14 600 r/min離心10 min，吸取上清液500 μL，置于另一1.5 mL 離心管中;在原離心管中再加乙酸乙酯500 μL，渦旋30 s，于4 ℃下以14 600 r/min離心10 min，吸取全部上清液;合并兩次上清液，置于40 ℃水浴中以氮?dú)饬鞔蹈?，殘?jiān)恿鲃?dòng)相100 μL復(fù)溶，渦旋2 min，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，置于自動(dòng)進(jìn)樣瓶中備測(cè)。

2.4 專屬性考察

分別取空白血漿、空白血漿+5-FU+5-FUH2+內(nèi)標(biāo)、晚期結(jié)直腸癌患者血漿樣品+內(nèi)標(biāo)，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果，5-FU、5-FUH2、5-Bru的保留時(shí)間分別為1.22、1.18、1.55 min;空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)（如自身體內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)、激素等）對(duì)5-FU、5-FUH2的測(cè)定無(wú)干擾，色譜峰峰形對(duì)稱、特異性好，分離度均大于>1.5，詳見(jiàn)圖1（空白血漿圖略）。

2.5 線性關(guān)系考察

分別取“2.2.1”項(xiàng)下5-FU、5-FUH2對(duì)照品溶液適量，加50%甲醇稀釋，制成質(zhì)量濃度分別為100、250、500、1 000、2 000、2 500、3 750、5 000 ng/mL的5-FU、5-FUH2系列溶液。分別精密吸取上述系列溶液各40 μL，加“2.2.2”項(xiàng)下內(nèi)標(biāo)溶液20 μL，于40 ℃下以氮?dú)饬鞔蹈珊?，殘?jiān)涌瞻籽獫{200 μL，制成質(zhì)量濃度分別為20、50、100、200、400、500、750、1 000 ng/mL的5-FU、5-FUH2系列單一線性工作溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以待測(cè)成分的質(zhì)量濃度（X，ng/mL）為橫坐標(biāo)、待測(cè)成分與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得5-FU的回歸方程為Y=0.014 4X-0.065 4（R 2=0.998 7）、5-FUH2的回歸方程為Y=0.002 1X-0.010 3（R 2=0.996 1），表明5-FU、5-FUH2檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍均為20～1 000 ng/mL，定量下限均為20 ng/mL。

2.6 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)

分別取“2.2.3”項(xiàng)下20、50、400、800 ng/mL的5-FU、5-FUH2質(zhì)控樣品溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度各取5份，分別于1 d內(nèi)按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件連續(xù)進(jìn)樣分析，考察日內(nèi)精密度;連續(xù)3 d按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，考察日間精密度。以實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度進(jìn)行比較，用相對(duì)誤差（RE）來(lái)考察準(zhǔn)確度。結(jié)果，5-FU和5-FUH2日內(nèi)、日間精密度均小于20%，RE在±10%范圍內(nèi)，符合體內(nèi)生物樣品定量分析的要求[11]，詳見(jiàn)表1。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別取“2.2.3”項(xiàng)下50、400、800 ng/mL的5-FU、5-FUH2質(zhì)控樣品溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度各取5份，分別于室溫下放置 24 h、低溫（4 ℃）下放置24 h、-80 ℃冷凍保存30 d、3次凍融循環(huán)（-20 ℃～室溫）、在自動(dòng)進(jìn)樣器中放置 24 h后，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，再按“2.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度進(jìn)行比較，用RE來(lái)考察穩(wěn)定性。結(jié)果，RE在±7%范圍內(nèi)，提示樣品在上述條件下穩(wěn)定性良好詳見(jiàn)表2。

2.8 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)考察

取“2.2.3”項(xiàng)下50、400、800 ng/mL的5-FU質(zhì)控樣品溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度各取5份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)得5-FU質(zhì)控樣品/5-Bru峰面積的比值（A）;另取空白血漿適量，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，取上清液適量，加5-FU對(duì)照品溶液適量，制成質(zhì)量濃度分別為50、400、800 ng/mL的對(duì)照品樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度各取5份，按“2.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)得5-FU對(duì)照品樣品/5-Bru峰面積比值（B）;按“2.2.3”項(xiàng)下方法，將空白血漿改為50%甲醇制成質(zhì)量濃度為分別為50、400、800 ng/mL的5-FU甲醇樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)得5-FU甲醇樣品/5-Bru峰面積比值（C）。提取回收率=A/B×100%，基質(zhì)效應(yīng)=B/C×100%。5-FUH2按上述同法操作。結(jié)果，5-FU的平均提取回收率為52.93%～58.89%（RSD≤5.89%），平均基質(zhì)效應(yīng)為99.40%～102.31%（RSD≤7.65%）;5-FUH2的平均提取回收率為54.60%～62.01%（RSD≤8.08%），平均基質(zhì)效應(yīng)為97.21%～101.87%（RSD≤7.57%），均符合體內(nèi)生物樣品定量分析的要求[11]，詳見(jiàn)表3。

2.9 臨床應(yīng)用

2.9.1 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)組織病理學(xué)和/或細(xì)胞生物學(xué)檢查確診為晚期結(jié)直腸癌;（2）至少有1個(gè)可測(cè)量的病灶;（3）美國(guó)東部腫瘤協(xié)作組（EGCO）全身狀態(tài)評(píng)分為0～1分;（4）接受以5-FU為基礎(chǔ)藥物持續(xù)靜脈滴注的全身化療方案;（5）血常規(guī)、肝腎功能等檢查均符合化療標(biāo)準(zhǔn);（6）預(yù)期生存時(shí)間≥12周;（7）年齡18～80歲;（8）體質(zhì)量≥40 kg。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）妊娠期或哺乳期或有妊娠可能的女性患者，首次用藥前妊娠檢測(cè)呈陽(yáng)性者;（2）具有臨床意義的電解質(zhì)異常者;（3）既往或現(xiàn)在存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移或腦轉(zhuǎn)移者;（4）存在臨床可檢查出的第二原發(fā)惡性腫瘤，或在過(guò)去5年內(nèi)出現(xiàn)過(guò)其他惡性腫瘤（已充分治療的皮膚基底細(xì)胞癌或?qū)m頸原位癌除外） 者;（5）有未控制的活動(dòng)性感染（如急性肺炎、乙肝或丙肝活動(dòng)期）者;（6）有消化道疾病或研究者判定的可能引起消化道出血或者穿孔的其他狀況，或既往有腸穿孔、腸瘺史者;（7）入組前6個(gè)月內(nèi)有動(dòng)脈血栓或深靜脈血栓史，或入組前2個(gè)月內(nèi)有出血傾向證據(jù)或病史且無(wú)論嚴(yán)重程度如何者;（8）部分凝血酶原時(shí)間或凝血酶原時(shí)間超出正常值1.5倍者;（9）入組前6個(gè)月內(nèi)有急性心肌梗死、嚴(yán)重/不穩(wěn)定心絞痛或者冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)史、或美國(guó)紐約心臟病協(xié)會(huì)（NYHA）心功能分級(jí)2級(jí)及以上者;（10）嚴(yán)重心理疾病或精神異常者;（11）既往4周內(nèi)參加過(guò)其他藥物臨床試驗(yàn)者;（12）正在其他臨床試驗(yàn)中接受其它藥物治療者。

2.9.2 一般資料 收集2020年8-10月于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院接受以5-FU持續(xù)靜脈滴注46 h為基礎(chǔ)化療方案治療的晚期結(jié)直腸癌患者10例，其中男性7例、女性3例，平均年齡（57.5±5.6）歲。本研究方案經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批號(hào)KY2017-18），所有患者均簽署了知情同意書(shū)。

2.9.3 檢測(cè)結(jié)果 所有患者于5-FU持續(xù)靜脈滴注18～30 h時(shí)采集外周靜脈血，置于乙二胺甲乙酸二鉀抗凝管中，采樣后立即置于冰浴中，并于4 ℃以3 000 r/min離心10 min，將上層血漿置于-80 ℃保存。按本研究所建方法檢測(cè)患者5-FU的css和5-FUH2的血藥濃度，并按公式計(jì)算患者5-FU的AUC：AUC=css×TCI[4]。結(jié)果，5-FU的css為180.04～622.83 ng/mL，5-FU的AUC為8.28～28.65 mg·h/L，其AUC可達(dá)3～4倍個(gè)體差異;5-FUH2的血藥濃度為336.48～948.43 ng/mL;5-FUH2/5-FU濃度比值為0.93～4.21。這提示不同患者個(gè)體間5-FU的AUC暴露量差異較大。晚期結(jié)直腸癌患者5-FU AUC暴露散點(diǎn)圖和5-FUH2/5-FU濃度比值分布圖分別見(jiàn)圖2、圖3。

3 討論

5-FU的分子式為C4H3FN2O2，分子量為130.08;5-FUH2的分子式為C4H5FN2O2，分子量為132.08，均為小分子物質(zhì)，加之兩者親水性強(qiáng)，因此在選擇色譜柱時(shí)應(yīng)注意選擇適用于水溶性物質(zhì)分離的色譜柱[12]。本研究前期試驗(yàn)曾嘗試Waters UPLC BEH C18色譜柱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5-FU和5-FUH2在C18色譜柱上保留時(shí)間極短（<0.5 min），分離效果不理想。經(jīng)查閱資料后發(fā)現(xiàn)，T3柱是一種可以耐受100%水相且可長(zhǎng)時(shí)間沖洗的特殊色譜柱，其鍵合相由多孔硅膠基質(zhì)組成，可延長(zhǎng)極性組分的保留時(shí)間[13]，故本研究選用Acquity UPLC HSS T3小顆粒填料色譜柱。

因5-Bru與5-FU、5-FUH2具有相同的母核，只有鹵素取代不同，本研究前期試驗(yàn)結(jié)果顯示，5-Bru在離子化和色譜保留方面均對(duì)5-FU、5-FUH2的測(cè)定無(wú)干擾，方法學(xué)驗(yàn)證也滿足生物樣本定量分析的要求[11]，故選擇5-Bru為內(nèi)標(biāo)。與現(xiàn)有文獻(xiàn)相比，本研究所建UPLC-MS/MS法分析時(shí)間短、血漿用量少、定量下限更低，且不需要使用同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)，因此在臨床5-FU的TDM應(yīng)用中更有優(yōu)勢(shì)[12-13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同患者個(gè)體間5-FU和5-FUH2血藥濃度暴露量差異較大，5-FU AUC差異可達(dá)3～4倍，推測(cè)其原因可能與個(gè)體間DPD酶的活性不同有關(guān)。有研究認(rèn)為，5-FU AUC在 20～30 mg·h/L范圍內(nèi)療效最好且不良反應(yīng)發(fā)生率最低[4]，但僅有約25%患者能達(dá)到上述有效治療范圍，約10%～20%患者會(huì)因血藥濃度較高而導(dǎo)致嚴(yán)重的不良反應(yīng)發(fā)生[5-6]。而本研究中，有5例患者的5-FU AUC在20～30 mg·h/L范圍內(nèi)，且未見(jiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)發(fā)生;有5例患者的5-FU AUC 小于20 mg·h/L，也未見(jiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)發(fā)生;另外，雖然有2例患者的5-FUH2/5-FU濃度比值小于1，但均未觀察到3/4級(jí)不良反應(yīng)發(fā)生，其關(guān)聯(lián)性尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

綜上所述，所建方法精密度、準(zhǔn)確性均較好，靈敏度較高且操作簡(jiǎn)便，可用于晚期結(jié)直腸癌患者體內(nèi)5-FU血藥濃度的監(jiān)測(cè)。

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（收稿日期：2020-10-23 修回日期：2021-01-05）

（編輯：陳 宏）