喬思源，江文剛，汪思應(yīng)

miR-100是定位于人類(lèi)染色體11q24.1上大小約為22個(gè)核苷酸的微小RNA。微小RNA是一類(lèi)非編碼的單鏈小分子RNA，廣泛存在于真核生物中，其通過(guò)與靶基因的3′UTR結(jié)合而轉(zhuǎn)錄后抑制基因表達(dá)，以誘導(dǎo)基因或者蛋白質(zhì)降解。目前對(duì)miRNA的研究表明，miRNA幾乎在每個(gè)細(xì)胞過(guò)程的調(diào)控中都起著至關(guān)重要的作用，包括增殖、凋亡、分化和血管生成等。miR-100在多種惡性腫瘤中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，成為了近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。miR-100基因敲除模型的建立可以更好地研究miR-100在各種腫瘤等疾病中發(fā)揮作用的機(jī)制，從整體水平研究其功能。

miR-100小鼠是在C57BL/6小鼠的miR-100基因兩端分別插入一個(gè)loxP的位點(diǎn)，所以外觀上和C57 BL/6小鼠基本沒(méi)有差異。而EIIa-Cre小鼠是表達(dá)Cre重組酶的工具鼠，可以特異性識(shí)別loxP位點(diǎn)從而將loxP位點(diǎn)間的基因敲除。該研究根據(jù)以上原理，通過(guò)將EIIa-Cre小鼠與miR-100小鼠進(jìn)行配繁，得到miR-100敲除雜合子小鼠后再進(jìn)行配繁，從而得到miR-100敲除純合子小鼠。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)miR-100小鼠雌雄各3只和SPF級(jí)EIIa-Cre小鼠雌雄各3只，體質(zhì)量均在20 g左右，購(gòu)自南京大學(xué)模型動(dòng)物研究中心， 所有小鼠飼養(yǎng)在安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的SPF環(huán)境中。經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心審批，并嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的原則。

1.2 主要試劑與儀器

瓊脂糖粉末(廣州賽國(guó)生物科技有限公司)；TAE(50X)電泳緩沖液(上海碧云天科技有限公司)；PCR試劑盒(廣州賽國(guó)生物科技有限公司)；DNA引物(中國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)；qPCR試劑盒(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；PCR擴(kuò)增儀(普通)(德國(guó)耶拿分析儀器股份公司)；化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀(北京匯佳科技有限公司)；熒光定量PCR儀(上海伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)。

1.3 小鼠的飼養(yǎng)與繁殖

小鼠在安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)和繁殖。溫度控制在25 ℃左右，濕度保持70%左右，明暗循環(huán)12 h/d，自由飲食和飲水。小鼠籠盒、墊料、飼料、飲用水均經(jīng)過(guò)高溫高壓消毒滅菌處理。飼養(yǎng)過(guò)程中,每2 d進(jìn)入動(dòng)物房觀察和記錄小鼠的生長(zhǎng)情況。每周更換1次小鼠墊料,每天補(bǔ)充飼料和飲用水。

1.4 小鼠尾部組織基因組DNA的提取

待子鼠1周齡時(shí),將小鼠尾部組織剪取長(zhǎng)約0.5 cm的小段于1.5 ml EP管中,在EP管中加入100 μl Buffer MP，4 μl Foregene Protease Plus，輕微渦旋混勻。65 ℃孵育25 min，然后95 ℃處理5 min，12 000 r/min離心5 min。轉(zhuǎn)移上清液至新的EP管中，4 ℃或-20 ℃放置備用或直接用于PCR擴(kuò)增。

1.5 PCR擴(kuò)增反應(yīng)及瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行基因型鑒定

小鼠基因型鑒定引物序列：EIIa-Cre Cre-up:5′-GCCTGCATTACCGGTCGATGC-3′；EIIa-Cre Cre-low:5′-CAGGGTGTTATAAGCAATCCC-3′；miR-100 loxpF1:5′-TCTGGGCTCTCAGCAAGTAAATGTC-3′；miR-100 loxpR1:5′-ACTGAAGGGGATAAGGTTGCC-TCTC-3′；miR-100 loxpF2:5′-GGATGCCTTTTAGAG-TGGTAGACAC-3′；miR-100 loxpR2:5′-CTGTCAGCCAAGTCTTCACTTTCTG-3′；miR-100 loxpF1:5′-TCTGGGCTCTCAGCAAGTAAATGTC-3′；miR-100 loxpR2:5′-CTGTCAGCCAAGTCTTCACTTTCTG-3′。PCR反應(yīng)體系：2x PCR mix 10 μl，前引物0.5 μl，后引物0.5 μl，超純水5 μl，DNA模板4 μl，總體積20 μl。PCR 反應(yīng)程序：EIIa-Cre程序?yàn)棰?95 ℃、5 min；② 95 ℃、30 s；③ 63 ℃、35 s；④ 72 ℃、45 s；⑤ 72 ℃、3 min；⑥ 16 ℃ hold。②到④為循環(huán)反應(yīng)，循環(huán)數(shù)為35。miR-100程序：① 95 ℃、5 min；② 95 ℃、30 s；③ 62 ℃、30 s；④ 72 ℃、30 s；⑤ 72 ℃、5 min；⑥ 4 ℃ hold。②到④為循環(huán)反應(yīng)，循環(huán)數(shù)為35。miR-100程序：① 95 ℃、5 min；② 95 ℃、30 s；③ 62 ℃、60 s；④ 72 ℃、30 s；⑤ 72 ℃、5 min；⑥ 4 ℃ hold。②到④為循環(huán)反應(yīng)，循環(huán)數(shù)為35。瓊脂糖凝膠電泳：瓊脂糖1.5 g，5X TAE 2 ml，雙蒸水98 ml，溴化乙啶(EB)5 μl，DNA樣本10 μl，電泳電壓90 V，時(shí)間40 min，凝膠成像儀成像。

1.6 基因型結(jié)果判定

EIIa-Cre的引物擴(kuò)增條帶在481 bp左右，為EIIa-Cre小鼠。miR-100-loxpF1和miR-100-loxpR1的引物擴(kuò)增條帶flox在423 bp，wildtype在358 bp。miR-100-loxpF2和miR-100-loxpR2的引物擴(kuò)增條帶flox在379 bp，wildtype在312 bp。miR-100-loxpF1和miR-100-loxpR2的引物擴(kuò)增條帶flox在1 585 bp，wildtype在1 453 bp，而null在467 bp。

1.7 qPCR檢測(cè)miR-100的表達(dá)

剪取F2代小鼠的鼠耳提取RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA再進(jìn)行定量PCR。用吉瑪公司的microRNA&U6 snRNA Hairpin-itNormalization Quantitation RT-PCR試劑盒檢測(cè)miR-100的表達(dá)。

1.7.1

逆轉(zhuǎn)錄體系 5×MMLV RT Buffer 4 μl，dNTP 0.75 μl，miRNA&U6 snRNA RT primer mix 1.2 μl，RNasin 0.25 μl，MMLV Reverse Transcriptase 0.2 μl，RNA樣本根據(jù)各樣本濃度及質(zhì)量2 μg計(jì)算其所需體積，最后加入DEPC水補(bǔ)足體積到20 μl。采用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：25 ℃、30 min；42 ℃、30 min；85 ℃、5 min；4 ℃保存。

1.7.2

qPCR體系 2×Real-time PCR Master Mix(SYBR) 10 μl，miRNA/U6 snRNA specific Primerset 0.4 μmol/L，ROX reference dye 2 μl，Taq DNA polymerase 0.2 μl，cDNA樣本加入2 μl，最后DEPC水補(bǔ)足20 μl。定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95 ℃、3 min；95 ℃、12 s；62 ℃、40 s，40個(gè)循環(huán)；4 ℃保存。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的配繁

母代的miR-100小鼠與EIIa-Cre小鼠相互配繁成功得到F1代雜合子幼鼠，將獲得的F1代小鼠雌雄相互交配得到F2代小鼠，其中就有miR-100全身敲除的純合子，成功配繁出miR-100基因型小鼠。每只母鼠妊娠期為 19～21 d，每胎產(chǎn)3～8只幼鼠。

2.2 小鼠基因型鑒定結(jié)果

① 當(dāng)5′端條帶在423 bp和3′端條帶在379 bp,null條帶在1 585 bp時(shí)，為miR-100純合子小鼠。② 只有當(dāng)5′端和3′端不表達(dá)條帶，同時(shí)null條帶在467 bp時(shí)為miR-100純合子小鼠。③ 當(dāng)不滿足以上兩種條帶時(shí)都為敲除雜合子小鼠。F1代部分小鼠基因型鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1，其中1號(hào)和2號(hào)條帶滿足①，所以為miR-100純合子。而3、4、5、6、7號(hào)小鼠的條帶①、②都不滿足，所以為miR-100雜合子小鼠。將F1代miR-100雜合子小鼠雌雄合籠配繁，產(chǎn)生F2代小鼠進(jìn)行基因型鑒定，結(jié)果如圖2，其中只有1、2、3、8號(hào)小鼠的條帶符合②，所以為miR-100純合子小鼠。

圖1 F1代小鼠的基因型鑒定結(jié)果1、2：均為小鼠miR-100純合子小鼠；3、4、5、6、7：均為小鼠miR-100敲除雜合子小鼠

圖2 F2代小鼠的基因型鑒定結(jié)果1、2、3、8：均為所需的miR-100敲除純合子小鼠；4、5、6、7：均為miR-100雜合子小鼠

2.3 敲除小鼠其miR-100表達(dá)情況

為了進(jìn)一步確認(rèn)PCR結(jié)果的可靠性，選取經(jīng)PCR鑒定獲得的miR-100純合子、miR-100雜合子、miR-100純合子小鼠，用定量PCR的方法檢測(cè)其miR-100的表達(dá)情況，結(jié)果如圖3所示，相較于miR-100純合子表達(dá)(0.987 138±0.012 340)，miR-100雜合子的miR-100表達(dá)(0.746 125±0.011 959)降低，而miR-100純合子小鼠其miR-100的表達(dá)(0.000 157±0.000 009)幾乎為零，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=10 560.296，

P

<0.001)。結(jié)果與PCR方法鑒定所得的結(jié)果一致，驗(yàn)證了miR-100的敲除效果，證實(shí)了miR-100全身敲除小鼠模型。

圖3 F2代小鼠的miR-100表達(dá)情況1、2：miR-100敲除純合子小鼠；4：miR-100敲除雜合子小鼠；6：miR-100flox/flox純合子小鼠；與1組比較：***P<0.001

3 討論

作為研究最多的非編碼RNA,miRNA是短的(約22個(gè)核苷酸)內(nèi)源性非編碼RNA，通過(guò)與靶標(biāo)的3′-UTR結(jié)合促進(jìn)mRNA降解并抑制轉(zhuǎn)譯在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。研究表明，超過(guò)50%的miRNA位于染色體上的所謂的脆性區(qū)域中，這些染色體經(jīng)常被刪除，擴(kuò)增或重排與癌癥相關(guān)。有研究表明，miRNA表達(dá)的異常表達(dá)模式和功能異常已被確定與包括癌癥在內(nèi)的多種人類(lèi)疾病相關(guān)。研究表明，miR-100是miR-99家族的一員，其起源可以追溯到兩側(cè)對(duì)稱(chēng)動(dòng)物的祖先。miR-100在腫瘤進(jìn)展中的表達(dá)模式和作用尚未完全闡明，近期的研究顯示了有爭(zhēng)議的結(jié)果。在人類(lèi)癌癥中，miR-100被報(bào)道既可以作為致癌miRNA，也可以作為抑癌miRNA，這取決于腫瘤類(lèi)型和微環(huán)境。已經(jīng)有報(bào)道稱(chēng)miR-100的失調(diào)參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和耐藥。miR-100的下調(diào)在多種人類(lèi)腫瘤中被報(bào)道,如非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、胃癌(GC)、肝細(xì)胞癌(HCC)。該課題組前期建立的miR-100肝特異性敲除小鼠模型，在成年小鼠中，miR-100基因敲除對(duì)肝功能和形態(tài)沒(méi)有影響。 在老年小鼠中，HE染色顯示miR-100敲除可引起炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和肝細(xì)胞核擴(kuò)展，而且miR-100基因敲除的老年小鼠血清AST和ALT水平升高，表明其肝功能受損。

Cre/loxP系統(tǒng)是一種廣泛應(yīng)用于小鼠位點(diǎn)特異性基因操作的技術(shù)。該系統(tǒng)允許刪除特定細(xì)胞、組織和整個(gè)生物體中感興趣的基因，從而產(chǎn)生多種條件敲除小鼠品系。Cre/loxP系統(tǒng)是一種位點(diǎn)特異性的遺傳調(diào)節(jié)技術(shù)，廣泛應(yīng)用于小鼠特定DNA位點(diǎn)的基因缺失、插入、逆轉(zhuǎn)錄和易位。該系統(tǒng)包含兩個(gè)主要成分: Cre重組酶和loxP位點(diǎn)。 Cre重組酶可以特異性識(shí)別具有方向性的34堿基對(duì)不對(duì)稱(chēng)DNA序列的loxP位點(diǎn)。根據(jù)兩個(gè)loxP位點(diǎn)的定位，Cre重組酶可以切除或逆轉(zhuǎn)插入兩個(gè)loxP位點(diǎn)之間的轉(zhuǎn)基因序列?；诖耍菊n題組選擇了miR-100小鼠，此類(lèi)小鼠的miR-100基因兩端分別被插入了一個(gè)loxP位點(diǎn)，然后將其和表達(dá)Cre重組酶的EIIa-Cre小鼠交配，從而能夠獲得miR-100被敲除的雜合子且表達(dá)Cre的小鼠，再將其進(jìn)行交配就可獲得miR-100被敲除的純合子小鼠，成功建立miR-100 基因敲除小鼠模型，并按照SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)繁育。采用較為簡(jiǎn)便易行、重復(fù)性、適用性較好的瓊脂糖凝膠電泳的方法進(jìn)行基因型鑒定。雖然在飼養(yǎng)過(guò)程中，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)miR-100的敲除和未敲除的小鼠有明顯差別，但是為后續(xù)對(duì)miR-100基因的相關(guān)機(jī)制深入探究提供了較好的模型。