裴 婷，張海利，陳 英，史 聰，樊慧娟

微小RNA(miRNA)是一類約20～24 nt所構(gòu)成的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，主要通過與互補(bǔ)靶系列結(jié)合干擾翻譯發(fā)揮作用，改變蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞的生物功能。miR-30a-5p是其中的一員，據(jù)報(bào)道,調(diào)節(jié)miR-30a-5p可以影響多種惡性腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展，但是在喉鱗狀細(xì)胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC)中未見報(bào)道。轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(metastasis associated gene 1，MTA1)主要通過脫去相應(yīng)抑癌基因組蛋白的乙酰基而重塑染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使其結(jié)構(gòu)緊密不易轉(zhuǎn)錄，減弱表達(dá)，增強(qiáng)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道MTA1的過表達(dá)與人類惡性腫瘤的惡性程度及進(jìn)展密切相關(guān)。前期研究表明過表達(dá)的MTA1可以促進(jìn)LSCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，但是其發(fā)生機(jī)制尚未闡明。該研究通過生物信息技術(shù)以及相應(yīng)的細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞增殖、遷移、周期和凋亡的情況，表明 miR-30a-5p/ MTA1軸可能對(duì)LSCC的發(fā)生機(jī)制產(chǎn)生一定的作用，為今后的診斷、治療和愈后提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

該實(shí)驗(yàn)所采用的LSCC細(xì)胞是Hep2細(xì)胞由耳鼻咽喉頭頸外科山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清(FBS)、TRIzol試劑、opti-MEM購自美國賽默飛世爾科技公司;胰酶-EDTA溶液、PBS、細(xì)胞周期試劑盒和細(xì)胞凋亡試劑盒購自上海西格瑪奧德利齊貿(mào)易有限責(zé)任公司;青鏈霉素購自上海英濰捷基貿(mào)易有限公司;谷氨酰胺購自北京沃卡威生物技術(shù)有限公司;CCK-8購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;4%多聚甲醛購自武漢博士德生物工程有限公司;結(jié)晶紫購自北京索萊寶科技有限公司;Dual-Luciferase報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)試劑購自美國普洛麥格公司;Lipofectamine3000 Invitrogen購自美國BD公司上海有限公司;SYBR Green PCR Master Mix購自上海東洋紡生物科技有限公司, miR-30a-5p模擬物和NC對(duì)照均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;PCR引物購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1

細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 Hep2細(xì)胞培養(yǎng)在由DMEM培養(yǎng)基、10% FBS、雙抗和谷氨酰胺配制的完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、 5% CO、95%濕度的孵箱中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)傳代，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。取8×10個(gè)細(xì)胞鋪于24孔板中，過夜后待細(xì)胞匯合度至70%～80%時(shí)，根據(jù)Lipofectamine3000說明書將miR-30a-5p mimics和miR-NC轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，24 h后收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1

.

2.2

實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn) 在無酶的條件下實(shí)驗(yàn)，根據(jù)說明書提取RNA，并且利用光譜儀檢測(cè)所提RNA的濃度，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒擴(kuò)增cDNA，以U6作為內(nèi)參，15 μl的體系，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR說明書進(jìn)行定量檢測(cè)。所采用的引物見表1。該實(shí)驗(yàn)采用StepOne Plus(出自ABI)檢測(cè)表達(dá)量。

1.2.3

雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 首先，設(shè)計(jì)MTA1 3′UTR的野生型和突變型引物。見表1。其次，進(jìn)行載體構(gòu)建，包括多聚酶鏈反應(yīng)、瓊脂糖凝膠電泳、膠回收、酶切、連接、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取多個(gè)步驟，構(gòu)建出miR-30a-5p 模擬物+ pGL4.10+pGL 4.73雙熒光素酶報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染至對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。轉(zhuǎn)染48 h后根據(jù)Promega 提供的說明書進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。

表1 引物序列

1.2.4

CCK-8實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染后的Hep2細(xì)胞以3 000個(gè)/孔鋪至96孔板中，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，20 h后更換完全培養(yǎng)基，23 h后每孔加入10 μl CCK-8溶液并放入37 ℃、5% CO、95%濕度的孵箱中培養(yǎng)1 h后，用酶標(biāo)儀分別測(cè)其24、48、72 h后450 nm的吸光度值(避光操作)。

1.2.5

Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 根據(jù)說明書將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用200 μl無血清培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)板小室的上室，在下室加入500 μl的DMEM完全培養(yǎng)基，孵箱中孵育24 h后，用干凈棉簽?zāi)ㄈド鲜业募?xì)胞，用300 μl、4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌1次，300 μl、1%結(jié)晶紫染色10 min，PBS洗滌1次，在顯微鏡下觀察并拍照統(tǒng)計(jì)。

1.2.6

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡實(shí)驗(yàn) 將用miR-30a-5p模擬物實(shí)驗(yàn)組和NC對(duì)照組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞收集1×10個(gè)細(xì)胞，根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡實(shí)驗(yàn)的說明書進(jìn)行相關(guān)操作步驟，并記錄分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

采用軟件miR Base和Target Scan Human 7.2檢測(cè)出MTA1是miR-30a-5p的一個(gè)靶基因，進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。雙熒光素酶報(bào)告顯示，miR-30a-5p mimics+ pGL4.10+pGL 4.73分別與其野生型和突變型比較表達(dá)水平為(0.41±0.06)和(0.91±0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=19.57，

P

<0.05)，miR-30a-5p可以抑制野生型(WT) MTA1 3′UTR報(bào)告基因載體的熒光素酶活性，而對(duì)突變型(MUT) MTA1 3′UTR影響甚小。實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-30a-5p mimics實(shí)驗(yàn)組和miR-NC對(duì)照組表達(dá)水平分別為(12.62±0.97)和(1.04±0.32)，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染后是高表達(dá)的，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=15.71，

P

<0.05)。見圖1。

圖1 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果A：miR-30a-5p與MTA1的結(jié)合位點(diǎn)及突變位點(diǎn)；B：熒光素酶的相對(duì)活性；C：轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中表達(dá)水平；與miR-NC組比較：***P<0.001

2.2 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-30a-5p mimics實(shí)驗(yàn)組與miR-NC對(duì)照組的24、48、72 h增值率分別為(33.88±1.81)%，(53.34±2.64)%，(93.50±11.27)%；(47.40±2.32)%，(93.76±5.50)%，(162.91±6.62)%，統(tǒng)計(jì)分析后得出

t

=13.20、

t

=24.45、

t

=11.74、

P

<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)所測(cè)得的吸光度值的平均數(shù)計(jì)算出相對(duì)倍數(shù)繪制折線圖，miR-30a-5p mimics實(shí)驗(yàn)組比miR-NC對(duì)照組24、48、72 h的吸光度值相對(duì)倍數(shù)低。見圖2。

圖2 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-30a-5p過表達(dá)后細(xì)胞增殖相對(duì)倍數(shù)

2.3 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-30a-5p mimics實(shí)驗(yàn)組和miR-NC對(duì)照組細(xì)胞數(shù)目分別為(207.67±7.23)個(gè)和(369.00±41.22)個(gè)(

t

=11.34，

P

<0.05)，過表達(dá)miR-30a-5p后的Hep2細(xì)胞遷移數(shù)目降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-30a-5p過表達(dá)后細(xì)胞遷移數(shù) ×100與miR-NC對(duì)照組比較：*P<0.05

2.4 喉鱗狀細(xì)胞癌過表達(dá)miR-30a-5p的Hep2細(xì)胞周期情況

該實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期和凋亡情況。經(jīng)3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果表明miR-30a-5p mimics實(shí)驗(yàn)組G1期、S期和G2期均較miR-NC對(duì)照組小，對(duì)照組G0/G1=63.08、G2/M=13.43，實(shí)驗(yàn)組G0/G1=59.86、G2/M=9.41，說明發(fā)生了細(xì)胞周期阻滯，即過表達(dá)miR-30a-5p的Hep2細(xì)胞增殖降低，進(jìn)一步說明過表達(dá)miR-30a-5p的Hep2細(xì)胞抑制喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Hep2的增殖。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過表達(dá)miR-30a-5p的Hep2細(xì)胞凋亡較miR-NC多，同時(shí)經(jīng)過計(jì)算分析得出miR-NC對(duì)照組凋亡率為(4.52±2.12)%，miR-30a-5p mimics實(shí)驗(yàn)組凋亡率為(22.61±5.70)%，可見過表達(dá)miR-30a-5p的Hep2細(xì)胞凋亡率更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=5.51，

P

<0.05)。見圖4。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡情況A：過表達(dá)的miR-30a-5p較miR-NC細(xì)胞周期受到阻滯；B：過表達(dá)的miR-30a-5p較miR-NC細(xì)胞凋亡增多

3 討論

該研究前期實(shí)驗(yàn)已表明過表達(dá)的MTA1可以促進(jìn)LSCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。為更加深入探討其促癌機(jī)制，該實(shí)驗(yàn)做了進(jìn)一步研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MTA1可能是miR-30a-5p的一個(gè)潛在的直接靶基因，過表達(dá)的miR-30a-5p可以抑制LSCC細(xì)胞Hep2細(xì)胞系增殖、遷移和細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞系凋亡，從而影響LSCC的進(jìn)展，進(jìn)一步表明miR-30a-5p/ MTA1軸可能對(duì)LSCC的發(fā)生機(jī)制發(fā)揮一定作用。

近年來，已有多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-30a-5p通過靶向作用參與多種惡性腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展，其中包括膽囊癌、肝細(xì)胞癌、乳腺癌等，但其與LSCC之間的關(guān)系尚未見報(bào)道。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA家族中有一些與LSCC的進(jìn)展相關(guān)。Xu et al報(bào)道在喉癌患者中miR-149呈低表達(dá)，影響生存率，與患者的預(yù)后密切相關(guān)，通過體外實(shí)驗(yàn)表明高表達(dá)的miR-149可以抑制癌細(xì)胞增長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Zhang et al報(bào)道高表達(dá)miR-23a能提高喉癌細(xì)胞淋巴轉(zhuǎn)移的程度，惡化臨床分期，降低5年生存率。Re et al報(bào)道在LSCC中miRNA家族中可能并不只是單一的成員起到主要作用，可能是相互之間的影響而起到更明顯的作用，研究表明miR-21-5p、miR-let-7a、miR-34c-5p可能與癌細(xì)胞的進(jìn)展有關(guān)，其中miR-21-5p/ miR-let-7a的值可能對(duì)區(qū)分正常組織和腫瘤組織有重要的臨床診斷意義，miR-let-7a可能有助于預(yù)測(cè)癌細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。由此可以看出，miRNA家族成員與喉癌的惡性進(jìn)展密切相關(guān)，且并不只是相對(duì)應(yīng)的一種miRNA起作用，可能會(huì)涉及到多種miRNA一起作用，或?yàn)閰f(xié)同，或?yàn)檗卓?，這為將來的機(jī)制研究提供更多新的思路。

在多種惡性腫瘤中，MTA1參與了腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展，如LSCC、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、肝細(xì)胞癌等。在該研究中，為了進(jìn)一步探討MTA1在LSCC中的促癌機(jī)制，通過生物信息軟件TargetScan和miRBase檢測(cè)出MTA1在213～219位處與miR-30a-5p的堿基序列相互配對(duì)，使得它們之間在理論上建立密切的相互關(guān)系，通過多數(shù)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MTA1可能是miR-30a-5p的一個(gè)潛在靶基因，過表達(dá)的miR-30a-5p能抑制LSCC細(xì)胞Hep2的增殖、遷移和細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這為今后LSCC的診斷、治療和愈后提供新的探索方向。雖然實(shí)驗(yàn)有相應(yīng)的結(jié)果，但該研究仍有一定的局限性，潛在的機(jī)制仍需要進(jìn)一步的探討。