周心怡 閆麗瓊 呂云彤 孫麗麗 朱靖聞 曹傳旺

東北林業(yè)大學(xué)森林生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)經(jīng)營教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 哈爾濱 150040)

植物和昆蟲在地球上共存已有數(shù)億年，在長期的進(jìn)化過程中，雙方形成了一系列相互防御的策略(陳澄宇等， 2015)。蟲害誘導(dǎo)的植物防御反應(yīng)及其復(fù)雜，不同植物、不同刺激方式和強(qiáng)度下的防御反應(yīng)機(jī)制不同(張斌等， 2016)。1980年，Bell等(1980)提出了“植物次生代謝”概念，植物次生代謝產(chǎn)物是指植物中一大類對于細(xì)胞生命活動或植物生長發(fā)育正常進(jìn)行并非必需的小分子有機(jī)化合物，其在植物體內(nèi)含量不等，且均有自己獨(dú)特的代謝途徑，通常由初生代謝派生而來(Dixon， 2001)。參與植物防御反應(yīng)的次生代謝產(chǎn)物主要有酚類、萜類和生物堿類，其對植食性昆蟲具有引誘、驅(qū)避、毒殺、拒食和不育等作用(王景順等， 2015)，苯丙氨酸是許多植物化合物的前體，對植物繁殖、生長、發(fā)育和防御不同類型的脅迫至關(guān)重要，苯丙氨酸代謝途徑是植物體內(nèi)最重要的次生代謝途徑之一(陳曉亞等， 1996)，能夠?qū)⑻荚创罅哭D(zhuǎn)移到苯丙氨酸衍生化合物的生物合成中，特別是木質(zhì)素(Pascualetal., 2016)。在高等植物中，肉桂酸-4-羥化酶(C4H)、苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)和4-香豆酸CoA連接酶(4CL)參與苯丙烷新陳代謝過程中的核心反應(yīng)(Mizutanietal., 1993)。C4H行使功能需氧且依賴NADPH，催化苯丙氨酸途徑的第二步反應(yīng)，同時也是該途徑的第一個氧化反應(yīng)，在肉桂酸的對位點(diǎn)上催化位置特異性的羥化反應(yīng)，將反式肉桂酸催化生成對-香豆酸(李莉等， 2007)。目前，在水稻(Oryzasativa)、杜仲(Eucommiaulmoides)和青稞(Hordeumvulgare)等植物中已經(jīng)克隆鑒定出C4H，并對其表達(dá)特性表達(dá)了分析(羅小嬌等， 2014； 李鐵柱等， 2014； 劉亞洲等， 2019)。4CL作用于苯丙氨酸代謝途徑中最后一步反應(yīng)，催化各種羥基肉桂酸生成相應(yīng)的硫酯，這些硫酯處于苯丙酸代謝途徑和各種末端產(chǎn)物特異合成途徑的分支點(diǎn)。4CL主要以香豆酸、咖啡酸和阿魏酸為催化底物，通常以基因家族形式存在(李莉等， 2007)，進(jìn)而調(diào)控木質(zhì)素、類黃酮等次生代謝物質(zhì)的形成(饒國棟等， 2012)。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥(Arabidopsisthaliana)的11個4CL重組蛋白中，4個在體外存在催化活性，具有較廣的底物特異性(Costaetal., 2005)；水稻中在功能上存在分化的5個4CL基因(Guietal., 2011)；毛果楊×美洲黑楊(Populustrichocarpa×P.deltoides)雜交楊僅有2個4CL基因，且同源性很高，但功能各異(Allinaetal., 1998)。然而，植物苯丙氨酸代謝途徑調(diào)控次生物質(zhì)響應(yīng)病蟲害脅迫的基因功能亟待進(jìn)一步研究。

舞毒蛾(Lymantriadispar)屬鱗翅目(Lepidoptera)毒蛾科(Liparidae)毒蛾屬(Lymantria)，是一種世界性森林食葉害蟲，其分布廣、食性雜，可取食500多種寄主植物，給農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)造成了巨大損失(Lazarevicetal., 1998)。在食葉害蟲與寄主植物的互作中，寄主植物的次生代謝產(chǎn)物起著關(guān)鍵的“化學(xué)防御”作用，次生代謝產(chǎn)物大多是非揮發(fā)性物質(zhì)，影響昆蟲對食物的選擇、利用和消化進(jìn)程，延緩發(fā)育。據(jù)報道，分月扇舟蛾(Closteraanastomosis)取食蟲害處理的美洲黑楊后，幼蟲各發(fā)育歷期延長，對食物的利用率下降，死亡率升高(周艷瓊等， 2010)；多種信號途徑參與昆蟲取食誘導(dǎo)的植物防御反應(yīng)，其相互作用為協(xié)同或拮抗(秦秋菊等， 2005)。小黑楊(Populussimonii×P.nigra)是從小葉楊(P.simonii)與歐洲黑楊(P.nigra)雜交組合中選出的優(yōu)良單株，具有生長速度快、抗寒、抗旱、抗病蟲害等優(yōu)良特性(沈清越等， 1979)。本研究基于小黑楊轉(zhuǎn)錄組文庫中獲得的C4H和4CL基因序列，測定舞毒蛾取食和機(jī)械損傷脅迫下苯丙氨酸代謝途徑中關(guān)鍵基因C4H、4CL的表達(dá)量以及酶活性變化情況，從轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上揭示小黑楊誘導(dǎo)抗性的形成和發(fā)展規(guī)律，以期為明確楊樹抗蟲性分子機(jī)制提供理論依據(jù)，并為利用基因工程手段提高寄主抗蟲性提供基因材料。

1 材料與方法

1.1 供試材料

舞毒蛾卵塊和人工飼料購自中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所。將舞毒蛾卵塊包裹于紗布中，使用體積分?jǐn)?shù)為10%為甲醛溶液浸泡1 h，用蒸餾水漂洗，打開紗布，晾干卵塊表面水分后將卵塊放入塑料培養(yǎng)盒(直徑9 cm)，置于溫度(25 ±1)℃、光照14L∶10D、相對濕度75%的人工培養(yǎng)箱內(nèi)，并及時將新孵出的舞毒蛾幼蟲轉(zhuǎn)入盛有人工飼料的培養(yǎng)盒中。選取健康、大小一致的4齡幼蟲進(jìn)行試驗(yàn)。

小黑楊植株由東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。參照劉桂豐等(2002)方法，待組培幼苗在培養(yǎng)瓶中長出完整根系后，打開瓶蓋，置于塑料大棚煉苗3～4天。從瓶中取出幼苗，小心洗去附著在根部的培養(yǎng)基，種植于經(jīng)過除菌劑代森鋅(80%可濕性粉劑，沈陽農(nóng)藥有限公司生產(chǎn)，質(zhì)量濃度4 g·L-1)處理3天后的草炭土與沙子等量混合的基質(zhì)中，置于相對濕度60%～70%的塑料大棚遮蔭培養(yǎng)(姜靜等， 2004)。選用平均直徑18.31 mm±2.15 mm、平均株高110.27 cm±3.79 cm的植株進(jìn)行脅迫處理。

1.2 C4H和4CL基因克隆與分析

采用CTAB法提取健康小黑楊的總RNA(曾凡鎖等， 2007)，用于構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫，采用IIlumina HiSeqTM2000進(jìn)行測序(深圳華大基因科技有限公司)。C4H和4CL基因克隆與分析參考劉鵬等(2017)方法，首先利用NCBI中Blastx和Blastn分析轉(zhuǎn)錄組文庫中的Unigenes 功能，根據(jù)注釋結(jié)果，查找并獲得C4H和4CL基因序列，然后設(shè)計特異性引物進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，通過測序獲得C4H和4CL基因全長序列。開放閱讀框采用ORF Founder (https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)程序確定，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)用ProtParam (http:∥au.expasy.org/tools/protparam.html) 軟件計算推導(dǎo)，利用SignlP4.1 Server (http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)分析氨基酸序列中信號肽，運(yùn)用NCBI的Conserved Domains程序(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預(yù)測蛋白保守區(qū)，通過Blast (http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進(jìn)行序列同源性搜索，選擇與其相似程度高的不同植物C4H和4CL氨基酸序列，用ClustalW進(jìn)行多序列比對。應(yīng)用Clustalx (1.83)和MEGA5.1，采用鄰接法(neighbor-joining, N-J)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(Brodskyetal., 1993)。

1.3 舞毒蛾取食和機(jī)械損傷處理

試驗(yàn)于2018年7月下旬進(jìn)行。選用株高一致、無病蟲害的健康小黑楊植株，隨機(jī)選擇健康、大小一致的舞毒蛾4齡幼蟲(不區(qū)分雌雄)。設(shè)計舞毒蛾取食處理(采用每株放置30頭舞毒蛾幼蟲，使其在植株上均勻分布)、機(jī)械損傷處理(高壓蒸汽滅菌剪刀仿照舞毒蛾取食造成的損傷形狀對小黑楊葉片進(jìn)行機(jī)械損傷處理)和對照(未進(jìn)行任何損傷)3種處理， 處理期間所有植株均用100網(wǎng)目尼龍紗網(wǎng)套籠，以防止其他昆蟲取食和舞毒蛾幼蟲逃逸。根據(jù)舞毒蛾幼蟲取食小黑楊情況，處理24 h后，剪取全株葉片作為測試樣本，并迅速放入液氮中，帶回置于-80 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.4 C4H和4CL活性測定

C4H活性按照試劑盒說明書(北京雷根公司)測定。從冰箱中取0.5 g待測樣品，加入2 mL C4H Lysis Buffer，冰浴下玻璃勻漿器充分勻漿，4 ℃下 10 000 r·min-1離心15～20 min，取上清液，-20 ℃凍存，用于C4H活性測定。測定管中加入1.64 mL蒸餾水、0.05 mL酶液、0.25 mL C4H Lysis Buffer、NADPH工作液(取試劑盒中1支NADPH加入1 mL蒸餾水充分溶解，即為NADPH工作液)和0.05 mL C4H Assay Buffer，對照管中不加入C4H Lysis Buffer，其他成分均與測定管相同。以對照管調(diào)零，立即用分光光度計(比色杯光徑為1 cm)測定OD 290 nm處吸光度。37 ℃準(zhǔn)確孵育1 h，立即用分光光度計測定OD 290 nm處吸光度。以每分鐘每毫克蛋白變化0.01OD為1個酶活性單位(U)。

4CL活性參照Knobloch等(1977)方法測定。準(zhǔn)確稱取1 g待測樣品，加入預(yù)冷提取液(含50 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.9，15 mmol·L-1β-巰基乙醇，5 mmol·L-1EDTA，5 mmol·L-1Vc，10 mmol·L-1leupeptin，1 mmol·L-1PMSF，0.15% PVP，30%甘油)，冰浴下玻璃勻漿器充分勻漿，4 ℃下 4 000 r·min-1離心15 min，取上清液作為4CL粗酶液。測定管反應(yīng)體系為0.45 mL 15 μmol·mL-1Mg2+、0.15 mL 5 μmol·mL-1香豆酸、0.15 mL 50 μmol·mL-1ATP、0.15 mL 1 μmol·mL-1CoA和0.5 mL酶液，對照管同等條件下以0.15 mL ddH2O替代香豆酸。于40 ℃下反應(yīng)10 min，波長333 nm處測定吸光度，以每分鐘每毫克蛋白變化0.000 1OD為1個酶活性單位(U)。蛋白質(zhì)含量測定參照Bradford(1976)的考馬斯亮藍(lán)G-250法。

1.5 實(shí)時熒光定量RT-PCR

隨機(jī)挑選舞毒蛾取食組、機(jī)械損傷組和對照組的小黑楊葉片，采取CTAB法提取總RNA(曾凡鎖等， 2007)，用DNase Ⅰ(Promega)消化總RNA中的DNA，測定質(zhì)量濃度，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa)合成cDNA，將cDNA稀釋10倍，作為模板備用，使用試劑盒TransStart Tip Green qPCR SuperMix(TransGen)進(jìn)行實(shí)時熒光定量RT-PCR。內(nèi)參基因(EF1β和UBQ)、C4H-1、C4H-2和4CL基因引物序列見表1。實(shí)時熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系為10 μL 2 ×TransStart Tip Green qPCR SuperMix酶、正向和反向引物(10 μmol·L-1)各1 μL、2 μL稀釋的cDNA，加去離子水補(bǔ)足20 μL； 反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，81 ℃讀板1 s，45個循環(huán)，每處理重復(fù)3次，采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行基因相對表達(dá)量分析(呂云彤， 2020； Pfaffletal., 2002)。

表1 實(shí)時熒光定量RT-PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 小黑楊C4H和4CL基因特性分析

從小黑楊轉(zhuǎn)錄組文庫中克隆鑒定獲得小黑楊C4H-1、C4H-2和4CL基因，全長基因開放閱讀框大小為1 518～1 740 bp，編碼505～579個氨基酸，蛋白分子質(zhì)量為58.00～63.03 kDa，理論等電點(diǎn)pI為5.63～9.09，C4H-1和C4H-2為堿性蛋白，4CL為酸性蛋白(表2)。Blastp對3個基因保守區(qū)的預(yù)測結(jié)果表明，C4H-1和C4H-2蛋白屬于p450家族基因蛋白，4CL屬于多結(jié)構(gòu)域蛋白超家族(AFD-class-Ⅰ)。

表2 小黑楊C4H和4CL基因特性

通過Blastp進(jìn)行序列同源性搜索，選擇與小黑楊C4H-1、C4H-2同源的35種植物的C4H蛋白以及與小黑楊4CL同源的27種植物的4CL蛋白進(jìn)行多序列比對，分別構(gòu)建C4H和4CL系統(tǒng)進(jìn)化樹。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，小黑楊C4H-1與銀白楊(P.alba)TKR74890.1同源性為98.87%，親緣關(guān)系近聚為一類， C4H-2與毛白楊(P.tomentosa)APR63996.1、歐洲山楊(P.tremuloides)ABF69 102.1、毛果楊×美洲黑楊A(yù)AG50231.1和毛果楊XP002319974.1具有較高同源性聚為一類(圖1)；小黑楊4CL與毛果楊×美洲黑楊A(yù)AK58909.1和毛果楊XP002325815.1親緣關(guān)系較近(圖2)。

圖1 小黑楊C4H蛋白與35種植物C4H蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖2 小黑楊4CL蛋白與27種植物4CL蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2 舞毒蛾取食和機(jī)械損傷對小黑楊C4H和4CL基因表達(dá)量的影響

如圖3所示， 舞毒蛾取食誘導(dǎo)小黑楊C4H-1、C4H-2和4CL基因表達(dá)量增加； 機(jī)械損傷誘導(dǎo)小黑楊C4H-1基因表達(dá)上調(diào)，而對C4H-2和4CL基因表達(dá)下調(diào)。舞毒蛾取食24 h后，小黑楊C4H-1、C4H-2和4CL基因相對表達(dá)量分別為對照組的6.86、1.15和1.50倍； 機(jī)械損傷24 h后，小黑楊C4H-1、C4H-2和4CL基因相對表達(dá)量分別為對照的1.80、0.71和0.60倍。

圖3 舞毒蛾取食和機(jī)械損傷對小黑楊C4H和4CL

2.3 舞毒蛾取食和機(jī)械損傷對小黑楊C4H和4CL活性的影響

如圖4所示，舞毒蛾取食C4H活性為748.60 U·mg-1，是對照的16.69倍； 4CL活性為2 610.36 U·mg-1，是對照的17.05倍。機(jī)械損傷C4H活性為219.19 U·mg-1，是對照的4.89倍； 4CL活性為1 196.93 U·mg-1，是對照的7.82倍。雖然舞毒蛾取食和機(jī)械損傷均能誘導(dǎo)小黑楊C4H和4CL活性，但取食的誘導(dǎo)作用顯著高于機(jī)械損傷，分別為機(jī)械損傷的3.42和2.18倍。

圖4 舞毒蛾取食和機(jī)械損傷對小黑楊C4H和4CL活性的影響

3 討論

植物在進(jìn)化過程中對昆蟲和病原菌危害以及植食性動物取食形成了多種防御機(jī)制，一般可分為組成型防御機(jī)制和誘導(dǎo)型防御機(jī)制，其中誘導(dǎo)防御機(jī)制是植物防御侵害過程中的主要機(jī)制(Waretal., 2012)。植物防御外界侵害時通常會產(chǎn)生包括蛋白酶抑制劑、氧化酶系、苯丙烷類代謝途徑酶、糖結(jié)合蛋白和病程相關(guān)蛋白等一系列防御蛋白(秦秋菊等， 2005)，植物苯丙氨酸生物合成代謝途徑在逆境脅迫條件下，相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄水平會發(fā)生一系列改變，以誘導(dǎo)相應(yīng)化合物的合成與積累(Fahrendorfetal., 1993； 陳鴻翰等， 2013)。Chaman等(2013)研究發(fā)現(xiàn)蚜蟲侵染大麥(Hordeumvulgare)后會引起苯丙氨酸酶(phenyalanine ammonia-lyase,PAL)活性升高，且在具有抗蚜蟲作用的大麥中PAL活性高于敏感品種。Cao等(2011)研究表明，小黑楊被舞毒蛾取食和機(jī)械損傷后PAL活性和mRNA表達(dá)水平增加。木質(zhì)素是植物防御害蟲取食的重要物質(zhì)，C4H和4CL是木質(zhì)素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，通過調(diào)控C4H和4CL基因表達(dá)量可以影響木質(zhì)素的合成量(李偉等， 2003)；同時，木質(zhì)素與細(xì)胞木質(zhì)化以及植物損傷部位傷口愈合密切相關(guān)，能夠間接參與植物對植食性害蟲的防御作用(蘇晶等， 2014)。馬尾松(Pinusmassoniana)受到害蟲取食后，產(chǎn)生的木質(zhì)素對植食性害蟲具有毒殺作用(任琴等， 2007)。

苯丙氨酸在PAL作用下形成反式肉桂酸，經(jīng)C4H和4CL催化的一系列反應(yīng)后成木質(zhì)素單體，最后木質(zhì)素單體聚合形成木質(zhì)素。木質(zhì)素作為植物防御外界侵害的物理屏障，充實(shí)細(xì)胞壁的同時也增強(qiáng)了細(xì)胞壁抗真菌穿透和抗酶溶解的能力(郭艷玲等， 2012)。本研究表明,小黑楊C4H-1和C4H-2屬于p450家族基因蛋白，4CL屬于多結(jié)構(gòu)域蛋白超家族(AFD-class-Ⅰ)。舞毒蛾取食對小黑楊C4H-1、C4H-2和4CL基因表達(dá)量的影響主要表現(xiàn)為誘導(dǎo)上調(diào)，機(jī)械損傷對小黑楊C4H-1基因表現(xiàn)為誘導(dǎo)上調(diào)，而對C4H-2和4CL基因主要表現(xiàn)為抑制其表達(dá)下調(diào)。此外，舞毒蛾取食和機(jī)械損傷均能誘導(dǎo)C4H和4CL活性增加且舞毒蛾取食的活性變化顯著高于機(jī)械損傷，這表明小黑楊機(jī)體可能通過增加木質(zhì)素合成途徑中C4H和4CL的活性以提高木質(zhì)素含量來抵御損傷逆境脅迫。已有研究表明，木質(zhì)素盡管是組成型的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，但具有相當(dāng)強(qiáng)的受誘導(dǎo)合成特性(Buchananetal., 2015)。

小黑楊對舞毒蛾取食和機(jī)械損傷處理表現(xiàn)出不同的應(yīng)激反應(yīng)，這可能是由于舞毒蛾唾液中存在的效應(yīng)因子在調(diào)控植物防御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，而機(jī)械損傷僅僅是一個物理因素。研究發(fā)現(xiàn)，在昆蟲與植物的互作過程中，植食性昆蟲的唾液起重要作用。植物識別不同種昆蟲唾液中的特異性激發(fā)子從而對其防御反應(yīng)進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控(禹海鑫等， 2015)。甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)口腔內(nèi)的分泌物N-(17-羥基亞麻酸基)-L-谷氨酸可誘導(dǎo)植物釋放揮發(fā)性信號物質(zhì)，其中包括可以吸引天敵的誘導(dǎo)素，但機(jī)械損傷單獨(dú)誘導(dǎo)不能產(chǎn)生此類誘導(dǎo)素(Albometal.， 1997)。進(jìn)一步研究，昆蟲的唾液還能降解植物防御次生代謝物質(zhì)，如水稻褐飛虱(Nilaparvatalugens)唾液腺中的一種纖維素酶內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶(endo-β-1，4-glucanase，NIEG1)，能夠幫助褐飛虱適應(yīng)水稻細(xì)胞壁的物理屏障，同時可以水解細(xì)胞壁中的纖維素，提高其在水稻韌皮部的取食效率(Jietal., 2017)；巢菜修尾蚜(Megouraviciae)利用口器刺穿蠶豆(Viciafaba)韌皮部時，會分泌唾液封閉植物篩管細(xì)胞所形成的傷口，導(dǎo)致Ca2+在篩管細(xì)胞內(nèi)外無法產(chǎn)生濃度差，進(jìn)而阻斷Ca2+信號傳遞途徑，抑制植物防御反應(yīng)(Willetal.， 2007)。在一定程度上，誘導(dǎo)抗性強(qiáng)弱與誘導(dǎo)因子類型相關(guān)，且在大多數(shù)情況下為正相關(guān)，誘導(dǎo)因子強(qiáng)度越高，誘導(dǎo)抗性表現(xiàn)越明顯(張斌等， 2016)。因此，本研究舞毒蛾取食處理小黑楊體內(nèi)的C4H和4CL基因表達(dá)水平高于機(jī)械損傷處理，可能是由于昆蟲取食在一定程度上抑制了植物次生代謝產(chǎn)物的抗逆作用，而黃酮類、萜類和多糖類等相關(guān)產(chǎn)物的基因被誘導(dǎo)增強(qiáng)，可產(chǎn)生更多的次生代謝產(chǎn)物。機(jī)械損傷對小黑楊的傷害是瞬時且相對簡單的，當(dāng)產(chǎn)生的木質(zhì)素達(dá)到一定程度時，相關(guān)基因表達(dá)量降低，這可能是苯丙氨酸代謝途徑下游基因4CL表達(dá)量下調(diào)的原因。小黑楊C4H-1基因表達(dá)可能是取食和機(jī)械損傷作用下C4H活性升高的主要來源，而機(jī)械損傷導(dǎo)致4CL活性增加可能存在其他更多4CL家族基因表達(dá)導(dǎo)致的。

4 結(jié)論

舞毒蛾取食和機(jī)械損傷均能誘導(dǎo)小黑楊C4H和4CL活性增加，且取食誘導(dǎo)顯著高于機(jī)械損傷； 舞毒蛾取食和機(jī)械損傷對C4H和4CL基因表達(dá)影響存在差異性。應(yīng)進(jìn)一步研究C4H和4CL家族基因功能及蛋白互作機(jī)制，以助于認(rèn)識昆蟲與寄主植物互作機(jī)制并通過遺傳工程開發(fā)抗性植物控制害蟲。