劉閔豪 李 龍 葉 靖 周軒轅 李周岐 范睿深 徐郡儡

(西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院 楊凌 712100)

杜仲(Eucommiaulmoides)是我國特有的以藥用為主且具有其他多種用途的植物。杜仲樹皮為傳統(tǒng)中藥材，其主要藥用成分為環(huán)烯醚萜類、黃酮類、苯基丙烷、多糖、氨基酸、其他萜類和脂肪族(張京京等， 2014)。此外，杜仲樹皮、樹葉及果實(shí)中含有杜仲膠(反式聚異戊二烯)，能夠廣泛應(yīng)用于電器工業(yè)、化學(xué)工業(yè)和電訊器材工業(yè)中，擁有巨大的潛力。杜仲具有極高的開發(fā)利用價(jià)值，基因功能研究是其資源開發(fā)中一項(xiàng)十分重要的基礎(chǔ)性工作，以往人們對(duì)于藥用成分與杜仲膠合成途徑的基因研究具有高度的熱情，這使得杜仲生長發(fā)育相關(guān)基因的研究受到了忽視。2018年，杜仲首個(gè)全基因測(cè)序完成(Wuyunetal.， 2018)，標(biāo)志著杜仲基因研究進(jìn)入了一個(gè)新的階段。利用杜仲全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，研究杜仲生長發(fā)育相關(guān)基因家族，能夠彌補(bǔ)杜仲生長發(fā)育相關(guān)基因研究的不足，為杜仲的基因挖掘與物種特性研究奠定基礎(chǔ)。

生長素(auxin, Aux)在植物中最主要的成分為吲哚乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)，是發(fā)現(xiàn)的第1種促進(jìn)植物生長的植物激素。生長素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)控制著植物各器官和組織對(duì)生長素的反應(yīng)，在生長素對(duì)植物生長的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

生長素響應(yīng)因子(auxin response factors, ARF)是生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的轉(zhuǎn)錄因子，其能夠特異地結(jié)合生長素響應(yīng)基因啟動(dòng)子區(qū)域的生長素響應(yīng)原件(auxin response element, AuxRE)TGTCTC序列，調(diào)控生長素響應(yīng)基因的表達(dá)，從而能夠與多種途徑的激素信號(hào)協(xié)同作用(Hagenetal.， 2002)。ARF蛋白一般由3部分組成： N端B3型DNA結(jié)合區(qū)域(DNA-binding domain，DBD)、響應(yīng)生長素應(yīng)答的中間區(qū)域(middle region，MR)和C末端二聚化結(jié)構(gòu)區(qū)域(C-terminal domain，CTD)(Tiwari， 2003)。ARF基因家族成員眾多，表達(dá)模式復(fù)雜。目前的研究表明，大多數(shù)ARF基因?qū)Νh(huán)境因子的反應(yīng)較弱，其表達(dá)受microRNAs和反式作用siRNA(ta-siRNA)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控(Liuetal.， 2011a)；并且發(fā)現(xiàn)了擬南芥(Arabidopsisthaliana)中microRNA167(miR167)靶向ARF6和ARF8(Wangetal.， 2015)， microRNA160(miR160)靶向ARF10、ARF16和ARF17(Linetal.， 2015)， TAS3 ta-siRNAs靶向ARF2、ARF3和ARF4(Williamsetal.， 2005)。

近年來，隨著基因組和轉(zhuǎn)錄信息的不斷完善，越來越多的植物物種進(jìn)行了ARF的相關(guān)研究，在模式植物和作物中的研究比較深入，包括擬南芥(Okushimaetal.， 2005)、水稻(Oryzasativa)(Wangetal.， 2007)、玉米(Zeamays)(Xingetal.， 2011)、大麥(Hordeumvulgare)(Huseyin， 2018)和番茄(Solanumlycopersicum)(Wuetal.， 2011)等。由于木本植物基因組比較復(fù)雜，只有部分果樹和用材樹種鑒定過ARF基因，主要有蘋果(Malusdomestica)(Luoetal.， 2014)、甜橙(Citrussinensis)(Lietal.， 2015)、葡萄(Vitisvinifera)(Wanetal.， 2014)、毛果楊(Populustrichocarpa)(Kallurietal.， 2007)和巨桉(Eucalyptusgrandis)(Hongetal.， 2014)等。

本研究從杜仲全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)中鑒定杜仲ARF基因家族全體成員，并從杜仲microRNA測(cè)序數(shù)據(jù)中獲取杜仲的miR160與miR167序列，利用生物信息學(xué)方法對(duì)杜仲ARF基因家族成員進(jìn)行分析，了解其基因外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系和miR160/167的調(diào)控預(yù)測(cè)等。同時(shí)利用杜仲轉(zhuǎn)錄本全長數(shù)據(jù)測(cè)序結(jié)果，分析杜仲ARF基因家族成員在葉片各生長發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平，再通過實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)方法分析杜仲ARF基因家族成員與miR160/167在杜仲不同發(fā)育時(shí)期的根、莖、葉中的表達(dá)量，分析ARF基因家族成員的時(shí)空表達(dá)模式和miR160/167的調(diào)控模式，初步預(yù)測(cè)其功能。本研究為EuARF基因的進(jìn)一步功能研究奠定了基礎(chǔ)，彌補(bǔ)了杜仲生長發(fā)育相關(guān)基因研究的不足。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 供試的植物材料為西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院實(shí)驗(yàn)苗圃(108.4°E，34.2°N)種植的杜仲優(yōu)良品種雜交后代。于6月選取4年生同一親本的雜交后代，混合采集其幼嫩葉片、成熟葉片、幼嫩莖段、成熟莖段、幼嫩根及成熟根，采摘后立即凍存到液氮中，隨后帶回實(shí)驗(yàn)室，并轉(zhuǎn)存到-80 ℃冰箱中備用。所有樣品均為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 杜仲ARF基因家族的鑒定 從基因組數(shù)據(jù)網(wǎng)站Genome Warehouse下載發(fā)布的杜仲基因組測(cè)序數(shù)據(jù)(http:∥bigd.big.ac.cn/gwh/Assembly/13/show)，構(gòu)建本地?cái)?shù)據(jù)庫。以ARF結(jié)構(gòu)域(PF06507)蛋白序列、擬南芥的AtARF蛋白序列以及水稻的OsARF蛋白序列為模板對(duì)基因組測(cè)序數(shù)據(jù)的蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行本地BlastP比對(duì)搜索，初步篩選出E≤10-5的蛋白序列為假定的EuARF蛋白。對(duì)這些假定的EuARF蛋白，使用SMART (http:∥smart.embl-heidelberg.de/)在線分析工具鑒定蛋白的保守序列，刪除不含ARF蛋白特征結(jié)構(gòu)域和特征結(jié)構(gòu)域置信度低的基因。

1.3 杜仲ARF基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 使用ClustalX軟件對(duì)篩選出來的杜仲ARF基因家族蛋白與下載的擬南芥的AtARF蛋白序列、水稻的OsARF蛋白序列、歐美楊(Populus×euramericana)的PeARF蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，蛋白序列均下載自PlantTFDB。比對(duì)結(jié)果使用 MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，構(gòu)建采用鄰接法(neighbor-joining method, NJ)，自展值(bootstrap)設(shè)定為1 000。根據(jù)最后的進(jìn)化樹，將鑒定出的杜仲ARF基因家族按照與擬南芥AtARF基因家族比對(duì)結(jié)果的相似性進(jìn)行命名。

1.4 杜仲ARF基因家族的生物信息學(xué)分析 使用基因結(jié)構(gòu)顯示系統(tǒng)(GSDS2.0)網(wǎng)站(http:∥gsds.cbi.pku.edu.cn/)比較每個(gè)EuARF基因的cDNA序列與基因組序列，生成其外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。使用ProtParam在線軟件(http:∥web.expasy.org/protparam/)分析鑒定出的EuARF蛋白的理化性質(zhì)。利用MEME工具5.0.3版(http:∥meme-suite.org/tools/meme)分析EuARF蛋白的保守基序，預(yù)測(cè)的基序長度設(shè)為6～200個(gè)氨基酸，基序數(shù)量設(shè)為20，分布設(shè)為每個(gè)序列出現(xiàn)1次。

1.5 miRNA靶基因結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè) 使用本地Blastn對(duì)前期研究獲得的杜仲miRNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，篩選杜仲miR160/167。使用RNAhybrid在線工具(https:∥bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid)對(duì)eu-miR160/167和EuARFs的cDNA序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)可能的靶基因以及結(jié)合位點(diǎn)。

1.6EuARFs基因表達(dá)分析 利用前期研究獲得的杜仲轉(zhuǎn)錄本全長數(shù)據(jù)庫(測(cè)序使用4組生長時(shí)期葉片樣本，分別為葉芽、3 cm長的生長葉、新的完全展開的幼葉和完全展開后30天的成熟葉，每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù))檢索EuARFs的FPKM(fragments per kilobase million)值，使用HemI 1.0軟件分析EuARFs在葉片生長過程中的表達(dá)譜。采用qRT-PCR方法分析EuARFs與eu-miR160s/miR167s在不同發(fā)育階段(幼嫩和成熟)不同器官(根、莖、葉)中的表達(dá)量，從而驗(yàn)證EuARFs在葉片中的表達(dá)模式，初步分析EuARFs在根與莖中的表達(dá)模式，預(yù)測(cè)eu-miR160s/miR167s對(duì)EuARFs的調(diào)控作用。

1.7 RNA的提取與qRT-PCR的具體方法 使用Trizol法(Ambion, https:∥www.thermofisher.com/)提取樣品中的總RNA，并使用TAKARA(TaKaRa, http:∥www.takara-bio.com/)的RNase-free DNase處理去掉殘留的DNA。

對(duì)各樣品的RNA使用TAKARA的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，其中eu-miR160s/miR167s的反轉(zhuǎn)錄使用莖環(huán)法，莖環(huán)引物見表1。使用TAKARA的熒光定量試劑盒進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)，內(nèi)參基因選擇為EuUBC(基因登錄號(hào)為： MH890470)(Yeetal.， 2018)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。從EuARFs的保守區(qū)域設(shè)計(jì)用于qRT-PCR的引物，使用稀釋了1、5、25、125和625倍的幼嫩葉片cDNA溶液進(jìn)行每個(gè)引物的qRT-PCR試驗(yàn)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)擴(kuò)增效率對(duì)引物進(jìn)行篩選，最后獲得的引物見表2。eu-miR160/167的qRT-PCR使用的反向引物為通用引物，正向引物見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 EuARF蛋白的鑒定及理化性質(zhì) 經(jīng)過轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)本地BlastP比對(duì)和SMART保守結(jié)構(gòu)域分析后，共鑒定出18個(gè)杜仲ARF蛋白序列，通過生物信息學(xué)進(jìn)一步驗(yàn)證獲得的EuARF蛋白的基本信息和理化性質(zhì)(表3)。所有EuARF蛋白均含有DBD與ARF結(jié)構(gòu)域，為真正的ARF蛋白，大部分EuARF蛋白含有CTD結(jié)構(gòu)域，不含CTD結(jié)構(gòu)域的EuARF蛋白為EuARF3.1、EuARF3.2、EuARF8.2、EuARF10.1、EuARF10.2、EuARF16 和EuARF17； EuARF蛋白的長度為273(EuARF8.2)～1 062個(gè)(EuARF19.1)氨基酸，預(yù)測(cè)的分子質(zhì)量為30.64～117.90 kDa； 理論等電點(diǎn)(pI)為5.36(EuARF10.2)～9.68(EuARF8.2)，其中16個(gè)EuARF蛋白的等電點(diǎn)都小于7，呈弱酸性，在酸性細(xì)胞環(huán)境中發(fā)揮作用，僅有EuARF2.1和EuARF8.2的等電點(diǎn)大于7，呈堿性。

表1 eu-miR160s/eu-miR167s的序列與引物

表2 EuARFs基因的引物

2.2 EuARF蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化 利用鄰接法(NJ)構(gòu)建了擬南芥、水稻、歐美楊和杜仲ARF基因家族的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖1)，可以將18個(gè)EuARFs分到5個(gè)亞族。EuARF3.1、EuARF3.2和EuARF4屬于Ⅰ亞族(AtARF3/4同源)，EuARF10.1、EuARF10.2、EuARF16和EuARF17屬于Ⅱ亞族(AtARF10/16/17同源)，EuARF1、EuARF2.1、EuARF2.2、EuARF9和EuARF18屬于Ⅲ亞族(AtARF1/2同源)，EuARF6.1、EuARF6.2、EuARF8.1和EuARF8.2屬于Ⅴ亞族(AtARF6/8同源)，EuARF19.1和EuARF19.2為Ⅵ亞族(AtARF7/19同源)，EuARF蛋白中沒有Ⅳ亞族蛋白(AtARF5同源)。

從進(jìn)化樹的分支上來看，在Ⅰ亞族和Ⅵ亞族中，EuARFs蛋白與PeARFs的親緣關(guān)系較近； 在Ⅱ亞族和Ⅴ亞族中，EuARFs蛋白與OsARFs和AtARFs的親緣關(guān)系更近； 而在Ⅲ亞族中，EuARF2.1蛋白與AtARF2親緣關(guān)系較近，EuARF9、EuARF18與PeARF9、PeARF18親緣關(guān)系更接近。

2.3 EuARF蛋白的保守結(jié)構(gòu)域和基序 SMART分析的EuARF蛋白保守結(jié)構(gòu)域以及meme分析的保守基序結(jié)果如圖2所示，圖2a是根據(jù)多重序列比較構(gòu)建的18個(gè)EuARF蛋白的進(jìn)化樹，以方便比較各ARF亞族的保守結(jié)構(gòu)域和基序特征。保守結(jié)構(gòu)域分析(表3，圖2b)表明大多數(shù)EuARF蛋白都包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域(DBD、ARF和CTD)，而EuARF10.1、EuARF10.2、EuARF16、EuARF17、EuARF3.1、EuARF3.2和EuARF8.2不含CTD結(jié)構(gòu)域，其中EuARF3.1、EuARF3.2屬于Ⅰ亞族，EuARF10.1、EuARF10.2、EuARF16和EuARF17屬于Ⅱ亞族。比較其基序(圖2c)發(fā)現(xiàn)，DBD結(jié)構(gòu)域由Motif 1、2、9和11組成，ARF結(jié)構(gòu)域由Motif 5、6和13或Motif 5、6和19組成，而CTD結(jié)構(gòu)域由Motif 7和10組成，每個(gè)基序的氨基酸組成如圖2d所示。

表3 杜仲ARF基因家族基本信息①

圖1 ARF基因家族系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

圖2 EuARF蛋白的保守結(jié)構(gòu)域與基序

2.4EuARF基因結(jié)構(gòu) 通過比較EuARF基因的cDNA序列和基因組序列，可以獲得EuARF基因的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)(圖3)，其中圖3a是根據(jù)多重序列比較構(gòu)建的18個(gè)EuARF蛋白的進(jìn)化樹，以方便將基因結(jié)構(gòu)分為亞族比較。從基因結(jié)構(gòu)中可以看出EuARF基因均含有2個(gè)或2個(gè)以上的外顯子，同一亞族的EuARF基因的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)比較相似，例如第Ⅱ亞族的EuARF基因只有2或3個(gè)外顯子，而其他亞族EuARF基因的外顯子更多。

圖3 EuARF基因的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)

2.5EuARF基因受miR160/167調(diào)控的靶位點(diǎn) 在前期研究獲得的杜仲miRNA測(cè)序數(shù)據(jù)中共鑒定到4條miR160/167，命名為eu-miRNA160d、eu-miRNA160f、eu-miRNA167a和eu-miRNA167d，eu-miR160/167的序列見表1。RNAhybrid靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)的結(jié)果(圖4)顯示EuARF基因家族中有7個(gè)基因受到eu-miR160/eu-miR167的調(diào)控，其中eu-miR160s調(diào)控Ⅱ亞族的EuARFs(EuARF10.1、EuARF10.2、EuARF16和EuARF17)，eu-miR167s調(diào)控Ⅴ亞族的EuARFs(EuARF6.1、EuARF6.2和EuARF8.1)，該結(jié)果與擬南芥中miRNA對(duì)AtARFs的調(diào)控情況相同(Wangetal.， 2015； Linetal.， 2015)。

2.6EuARFs和eu-miR160s/167s的表達(dá)模式 在前期研究中，本課題組通過單分子測(cè)序獲得了杜仲葉片不同生長時(shí)期的轉(zhuǎn)錄本全長數(shù)據(jù)。4個(gè)不同生長時(shí)期的葉片分別為葉芽(L1)、生長葉(3 cm長，L2)、幼葉(新的完全展開的葉，L3)和老葉(完全展開后30天，L4)。在轉(zhuǎn)錄本全長序列數(shù)據(jù)中共檢索到17個(gè)EuARF基因的FPKM(EuARF17沒有檢索到)，通過HemI 1.0構(gòu)建的基因表達(dá)譜如圖5所示，可以看出： 在葉片的所有生長發(fā)育時(shí)期，Ⅵ亞族的EuARF19.2的表達(dá)明顯高于其他EuARFs； 在幼葉(L3)中，Ⅴ亞族的EuARFs的表達(dá)量較高；EuARF1、EuARF2.1、EuARF2.2、EuARF10.1在葉芽(L1)和老葉(L4)中表達(dá)較高； Ⅴ亞族的EuARFs除EuARF8.2外均在生長葉(L2)中表達(dá)較高。此外，Ⅰ亞族EuARFs和Ⅲ亞族的EuARF9在葉片不同生長時(shí)期的表達(dá)均較低。EuARFs在葉片不同生長時(shí)期的表達(dá)熱圖(圖5)可以初步反映其在葉片生長過程中存在調(diào)控作用。

圖5 EuARF基因在不同生長時(shí)期葉片中的表達(dá)譜

為了驗(yàn)證EuARF基因在葉片中的表達(dá)模式，初步分析EuARF基因在其他器官中的表達(dá)模式，采用qRT-PCR方法，比較了正常生長條件下不同發(fā)育階段(幼、熟)器官(葉、根、莖)中EuARF基因的表達(dá)水平。結(jié)果(圖6a、b)表明，在正常生長條件下不同發(fā)育階段(幼嫩和成熟)的器官(根、莖和葉)中EuARFs均有表達(dá)，不過表達(dá)量有一定差異。在根中，EuARFs的表達(dá)量最高，并且在成熟根中的表達(dá)量普遍高于幼嫩根，而在葉和莖段中卻相反，表現(xiàn)為在幼嫩的器官中表達(dá)量更高。在表達(dá)水平上，EuARFs之間存在較大區(qū)別。EuARFs在葉片中的表達(dá)與轉(zhuǎn)錄本測(cè)序數(shù)據(jù)的表達(dá)譜相似，其中EuARF19.2在幼葉中的表達(dá)量最高； V亞族的EuARFs(EuARF6.1、EuARF6.2和EuARF8.1)在葉和莖中的表達(dá)水平較高，并表現(xiàn)為在幼嫩和成熟期均有表達(dá)； Ⅱ亞族的EuARFs(EuARF10.1、EuARF10.2、EuARF16和EuARF17)和Ⅴ亞族的EuARF8.2相較于其他EuARFs在所有器官中表達(dá)水平都較低。

eu-miR160s/eu-miR167s在不同發(fā)育階段器官中的表達(dá)模式(圖6c)顯示，eu-miR160s在幼根中的表達(dá)較高，其靶基因Ⅱ亞族的EuARFs在根中均有一定表達(dá)，但與其他亞族的EuARFs相比，這些靶基因在根中的表達(dá)量屬于中等偏低水平，這可能說明這些基因在根中的表達(dá)受到了eu-miR160s的負(fù)調(diào)控。eu-miR167s也存在相同的結(jié)果，eu-miR167s在成熟根和莖中幾乎不表達(dá)，其靶基因EuARF6.1、EuARF6.2和EuARF8.1在成熟根和莖中表達(dá)水平最高，這表明eu-miR167s可能也起到負(fù)調(diào)控作用。

圖6 EuARFs基因和eu-miR160s/eu-miR167s在不同發(fā)育階段不同器官的表達(dá)

3 討論

ARF轉(zhuǎn)錄因子在植物中以家族的形式存在，一般情況下被分為6個(gè)亞族(Xingetal.， 2011； Tangetal.， 2018； Huseyin， 2018)，在有的研究中也被分為5個(gè)亞族(Lietal.， 2015； 董晨等， 2017)。本研究共鑒定出18個(gè)EuARFs，根據(jù)6個(gè)亞族的分類可以分到其中5個(gè)亞族中(圖1)，只有IV亞族中沒有EuARF基因，同亞族的EuARF基因都具有相似的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)(圖3)，同亞族的EuARF蛋白也具有相似的保守結(jié)構(gòu)域和基序(圖2)，這些結(jié)果驗(yàn)證了基于多序列比對(duì)后構(gòu)建的進(jìn)化樹的可靠性。

在家族成員數(shù)量上，EuARFs小于AtARFs，主要原因是Ⅲ亞族的EuARFs數(shù)量(3個(gè))遠(yuǎn)小于AtARFs(12個(gè))，這種現(xiàn)象也存在于其他植物種，包括大麥 (Huseyin， 2018)、番茄(Wuetal.， 2011)、蘋果(Luoetal.， 2014)、甜橙(Lietal.， 2015)、巨桉(Hongetal.， 2014)和荔枝(Litchichinensis)(董晨等， 2017)等。在早期的研究中，這些多出來的AtARFs被單獨(dú)分為一組(Xingetal.， 2011； Wuetal.， 2011； Wanetal.， 2014； Yangetal.， 2014)。這表明，杜仲可能與這些植物一樣，在進(jìn)化過程中丟失了一小部分的ARF基因。

在大部分植物的ARF基因家族中都存在不含CTD結(jié)構(gòu)域的ARF蛋白，杜仲的ARF基因家族中也同樣如此。SMART結(jié)果顯示，Ⅰ亞族和Ⅱ亞族的EuARF蛋白以及Ⅴ亞族的EuARF8.2不含CTD結(jié)構(gòu)域。在擬南芥和其他物種也有相似的情況，與Ⅰ亞族EuARF3.1、EuARF3.2同源的AtARF3也不含CTD結(jié)構(gòu)域，并與EuARF3.1、EuARF3.2一樣表現(xiàn)為完全缺失CTD結(jié)構(gòu)域； Ⅱ亞族的AtARFs(AtARF10、16和17)也不含CTD結(jié)構(gòu)域，并且與Ⅱ亞族的EuARFs一樣表現(xiàn)為CTD結(jié)構(gòu)域不完整。這些不含CTD結(jié)構(gòu)域的ARF蛋白可能不參與生長素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而行使獨(dú)立的功能(Liuetal.， 2011b)，在本研究中則發(fā)現(xiàn)這些不含CTD結(jié)構(gòu)域的EuARFs表達(dá)水平相對(duì)較低，尤其是Ⅱ亞族的EuARFs，這可能與受到eu-miR160s的負(fù)調(diào)控有關(guān)，表明這類EuARFs可能在eu-miR160s的負(fù)調(diào)控下參與其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。此外，通過比較基序(圖2c)可以發(fā)現(xiàn)EuARF8.2蛋白相比于其他Ⅴ亞族的EuARF蛋白除了缺少CTD結(jié)構(gòu)域外，還缺少了Motif 3、4、8、12、15和17，這些基序位于DBD與ARF結(jié)構(gòu)域兩側(cè)，其丟失可能使EuARF8.2喪失了部分功能。

本研究中發(fā)現(xiàn)EuARF基因家族中有7個(gè)基因受到eu-miR160s/eu-miR167s的調(diào)控，其中eu-miR160s調(diào)控Ⅱ亞族的EuARFs，eu-miR167s調(diào)控除了EuARF8.2的V亞族的EuARFs，這與擬南芥中的調(diào)控情況相同(Wangetal.， 2015； Linetal.， 2015)。通過表達(dá)模式分析(圖6c)可以看出eu-miR160s在幼嫩的根中表達(dá)水平極高并且在其他不同發(fā)育階段的器官中也有表達(dá)，而Ⅱ亞族的EuARFs在根中均有一定表達(dá)，但與其他亞族的EuARFs相比，其在根中的表達(dá)量屬于中等偏低水平，這表明eu-miR160s在根的生長發(fā)育中對(duì)Ⅱ亞族EuARFs可能有負(fù)調(diào)控作用，從而調(diào)控根的生長； 在擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)Ⅱ亞族的AtARFs中，AtARF10和AtARF16對(duì)根冠以及根部分生組織的發(fā)育起到調(diào)控作用(Wangetal.， 2005)，杜仲的Ⅱ亞族EuARFs可能擁有相似的功能。eu-miR167s則是主要在葉片中表達(dá)，尤其是在成熟的葉片中，其調(diào)控的Ⅴ亞族EuARFs在根、莖、葉中的表達(dá)水平均較高(圖6a)，不過對(duì)比其他EuARFs基因在根、莖、葉的相對(duì)表達(dá)水平(圖6b)可以發(fā)現(xiàn)，Ⅴ亞族EuARFs在葉片中的表達(dá)水平遠(yuǎn)低于根和莖，推測(cè)Ⅴ亞族的EuARFs在葉片中的表達(dá)受到了負(fù)調(diào)控，這表明Ⅴ亞族EuARFs可能在eu-miR167s的負(fù)調(diào)控下在葉片發(fā)育中發(fā)揮重要的作用。

進(jìn)一步比較EuARFs的表達(dá)水平與其同源ARFs的功能研究結(jié)果可以對(duì)EuARFs的具體功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，這為進(jìn)一步研究這些基因的功能奠定了基礎(chǔ)。例如，研究已經(jīng)證實(shí)AtARF8通過調(diào)節(jié)GH3基因的表達(dá)對(duì)幼苗生長產(chǎn)生影響(Wuetal.， 2006)，本研究中也發(fā)現(xiàn)與AtARF8同源的EuARF8.1在幼嫩的莖中表達(dá)水平極高，并且在葉片發(fā)育中受到eu-miR167s的負(fù)調(diào)控； Zhang等(2015)發(fā)現(xiàn)OsARF19控制著水稻葉夾角和側(cè)根發(fā)育，并且AtARF7/AtARF19被證實(shí)可激活LBD/ASLS基因從而促進(jìn)葉片的增大(Okushimaetal.， 2007)，本研究則發(fā)現(xiàn)與OsARF19和AtARF7/AtARF19同源的EuARF19.2在葉和根中有很高的表達(dá)水平； 先前的研究表明，AtARF2除了參與花器官的發(fā)育，還對(duì)擬南芥葉和根的發(fā)育有調(diào)節(jié)作用(Okushimaetal.， 2005)，與AtARF2同源的EuARF2.1在葉和根中也有很高的表達(dá)水平。

4 結(jié)論

杜仲是重要的葉用經(jīng)濟(jì)樹種，研究杜仲葉片的生長發(fā)育對(duì)杜仲育種研究有重要意義。本研究在杜仲全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)庫中共鑒定出18個(gè)杜仲ARF基因，這些EuARFs可以分到5個(gè)亞族中，基因結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)以及蛋白結(jié)構(gòu)分析說明同亞族的EuARFs具有相似的結(jié)構(gòu)與功能，其中Ⅱ亞族的EuARFs受eu-miR160s調(diào)控，V亞族的EuARFs除了EuARF8.2均受eu-miR167s調(diào)控。EuARFs的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)表達(dá)譜顯示，在幼葉(L3)和生長葉(L2)中，V亞族的EuARFs的表達(dá)量較高，此外，EuARF19.2的表達(dá)明顯高于其他EuARFs。qRT-PCR試驗(yàn)結(jié)果顯示，EuARFs在正常生長條件下不同發(fā)育階段(幼嫩和成熟)的器官(根、莖和葉)中均有表達(dá)，在根中表現(xiàn)為在成熟階段上調(diào)表達(dá)，葉和莖段中表現(xiàn)為在成熟的器官中下調(diào)表達(dá)。eu-miR160s主要在幼嫩的根中表達(dá)，eu-miR167s則是主要在成熟的葉片中表達(dá)。綜合來看，V亞族中EuARFs對(duì)幼苗的生長發(fā)育具有調(diào)控作用，在幼嫩的莖中表達(dá)水平極高，在葉片中受到eu-miR167s的負(fù)調(diào)控從而對(duì)其生長發(fā)育產(chǎn)生影響； 此外，EuARF19.2在葉片中的表達(dá)顯著高于其他EuARFs，可以推測(cè)其對(duì)杜仲葉片生長具有重要的調(diào)控作用，具有極高的研究價(jià)值。本研究初步揭示了大部分EuARFs在植物生長發(fā)育中發(fā)揮的作用，為杜仲EuARFs基因功能的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。