劉 輝 吳小芹 葉建仁 陳 丹

1.南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 南京 210037； 2.安徽師范大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院 蕪湖 241002)

土壤磷素存量大，但其中約95%不能被植物直接吸收利用，溶磷微生物(phosphate-solubilizing microorganisms, PSM)是一類參與土壤磷循環(huán)的重要微生物類群，其可將土壤磷庫中的難溶性磷酸鹽轉(zhuǎn)化為可溶性磷，從而顯著提高土壤有效磷含量，促進(jìn)植物生長和發(fā)育(Kuceyetal., 1989； 陳哲等， 2009)。目前，學(xué)者們已對 PSM 的種類、溶磷能力和應(yīng)用效果等開展了廣泛而深入的研究(Oliveriaetal., 2009; Wangetal., 2017; Chenetal., 2019)。有研究發(fā)現(xiàn)，許多在離體條件下表現(xiàn)出明顯溶磷能力的 PSM 在實際應(yīng)用中效果并不理想(Collavinoetal., 2010; 張英等， 2015)。影響 PSM 應(yīng)用效果的因素很多，分析其原因主要有2方面： 一方面是由于 PSM 種類較多，溶磷過程十分復(fù)雜，其潛在機(jī)制也因 PSM 種類和菌株不同而有所區(qū)別(Antoun, 2012)，當(dāng)前對 PSM 溶磷機(jī)制認(rèn)識的局限性制約了該類菌肥的研發(fā)和推廣應(yīng)用進(jìn)程； 另一方面是由于磷在土壤中的移動性較小，PSM 釋放到土壤中的磷必須在植物可以吸收的范圍內(nèi)(根際)才能被利用(朱培淼等， 2007)。Gupta 等(2011)研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)10208 的溶磷能力是唐菖蒲伯克氏菌(Burkholderiagladioli)10216 的 13.8 倍，但對甜葉菊(Steviarebaudiana)促生效應(yīng)和地上部磷吸收量之間的差異并不顯著，分析其原因發(fā)現(xiàn)可能是 10216 菌株在甜葉菊根際定殖數(shù)量比 10208 菌株高1個數(shù)量級造成的?？梢姡琍SM 能否在植物根際成功定殖也是影響其應(yīng)用效果的關(guān)鍵因素(Mamtaetal., 2010)。在自然和半自然生態(tài)系統(tǒng)中，植物的根部常常被菌根真菌侵染，根際的概念已擴(kuò)大到包括菌根真菌部分而被稱作菌根際(Mycorrhizosphere)(Johanssonetal., 2004)。據(jù)報道，PSM 和菌根真菌在磷素資源可持續(xù)利用方面具有重要作用，但只有PSM 在植物根際或菌根際高效定殖才能達(dá)到更好為宿主植物提供有效磷的目的(Antoun, 2012)。因此，在評價 PSM 的應(yīng)用潛力時，其與菌根真菌的相容性問題不容忽視。

筆者課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)菌株JW-JS1和紅絨蓋牛肝菌(Xerocomuschrysenteron, Xc)共接種對NL-895楊(Populus×euramericanacv. ‘Nanlin-895’)的生長、光合效應(yīng)、氮代謝、礦質(zhì)元素含量、土壤酶活性和微生物多樣性等的影響均表現(xiàn)出顯著的正交互效應(yīng)(姚如斌等， 2012; 劉輝等， 2018； 2019)，但關(guān)于JW-JS1菌株的溶磷機(jī)制及其在楊樹根際和菌根際的定殖動態(tài)尚不明確。鑒于此，本研究以熒光假單胞菌菌株JW-JS1和紅絨蓋牛肝菌 Xc 為研究對象，通過分析JW-JS1菌株溶磷能力與pH、可滴定酸含量以及有機(jī)酸種類和含量的關(guān)系，初步揭示其溶磷機(jī)制， 利用抗利福平標(biāo)記篩選穩(wěn)定的標(biāo)記菌株，采用灌根法對其在楊樹根際和菌根際的定殖動態(tài)進(jìn)行深入研究，進(jìn)一步揭示溶磷細(xì)菌與外生菌根真菌的互作機(jī)制，以期為楊樹專用復(fù)合菌劑的開發(fā)與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 溶磷細(xì)菌： 熒光假單胞菌菌株JW-JS1，從楊樹根際土壤中分離篩選獲得(Liuetal., 2011)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，編號CCTCC M 209027； 外生菌根真菌： 紅絨蓋牛肝菌，保存于南京林業(yè)大學(xué)森林病理實驗室。

1.1.2 供試試劑與培養(yǎng)基 利福平(Rifampicin)購自美國 Sigma 公司； 磷酸鹽生長培養(yǎng)基(NBRIP)： 葡萄糖 10.0 g，MgCl25.0 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，KCl 0.2 g，(NH4)2SO40.1 g，Ca3(PO4)25.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0； 細(xì)菌活化培養(yǎng)基(NA)： 牛肉膏 3.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂 15.0～20.0 g，pH7.2～7.4，蒸餾水1 000 mL； 細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)基(NB)： 牛肉膏 3.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH7.2～7.4。以上培養(yǎng)基均于 121 ℃條件下滅菌 20 min，備用。

1.1.3 供試植物材料 采用0.5% 高錳酸鉀水溶液浸泡美洲黑楊(Populusdeltoides)種子(采自南京林業(yè)大學(xué)實驗基地)10 min，殺菌處理后播種于分別盛有滅菌盆栽基質(zhì)和含有0.5% 紅絨蓋牛肝菌 Xc 固體菌劑(曾麗瓊， 2010)的滅菌盆栽基質(zhì)的花盆中，置于日光溫室培養(yǎng)，出苗2周后按照每盆中央1株、周圍5株的方式保留6株實生苗，定期澆水保濕，培養(yǎng) 3 個月后備用?；ㄅ枰?guī)格為12 cm×9 cm×12 cm(上口徑×下口徑×高)，裝干盆栽基質(zhì)每盆質(zhì)量0.6 kg； 盆栽基質(zhì)為土壤(pH7.56，有機(jī)質(zhì)2.65 g·kg-1、采自南京林業(yè)大學(xué)校園后山)、砂子、蛭石按2∶1∶1比例混合并攪拌均勻在1.01×106Pa 壓力下滅菌120 min 后備用。 經(jīng)檢測，接種Xc的美洲黑楊實生苗菌根侵染率約為 70%。

1.2 試驗方法

1.2.1 JW-JS1菌株溶磷能力測定 將供試菌株活化后接種于 NB 培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng) 18～24 h 制成種子液，菌數(shù)約 109cfu·mL-1。按 1% 接種量接入 NBRIP 培養(yǎng)基，以不接菌處理為對照，30 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)。每隔 24 h 取 3 個重復(fù)，培養(yǎng)液離心 20 min(4 ℃、10 000 r·min-1)，上清液采用鉬銻抗比色法測定可溶性磷含量(扣除對照后的值)(劉輝等， 2013)，滴定法測定可滴定酸含量(劉輝等， 2010)， pH 計(上海雷磁 pHS-3C 型號)測定上清液pH 變化。

1.2.2 JW-JS1菌株分泌有機(jī)酸的種類及含量測定 按1.2.1方法制備JW-JS1菌株的種子液，按1% 接種量接入NBRIP 培養(yǎng)基，以不接菌處理為對照，30 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng) 72 h 后，培養(yǎng)液離心 20 min(4 ℃、10 000 r·min-1)。取 5 mL 培養(yǎng)液上清液過 0.22 μm 孔徑濾膜，采用高效液相色譜儀(HPLC)(Agilent 1100 series，美國產(chǎn))測定有機(jī)酸種類和含量。色譜條件： 色譜柱為菲羅門 C18柱，緩沖液為 0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀(pH 2～3)，柱溫 30 ℃，流速 1.0 mL·min-1，檢測波長 214 nm。有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)樣品： 乙酸、草酸、酒石酸、檸檬酸、順丁烯二酸、反丁烯二酸、丁二酸和乳酸。

1.2.3 抗利福平標(biāo)記菌株的篩選及穩(wěn)定性分析 采用抗利福平標(biāo)記法(王長方等， 2006)篩選JW-JS1菌株的標(biāo)記菌株，直至所篩選菌株在含有 300 μg·mL-1利福平的 NA 平板上能穩(wěn)定生長，菌落形態(tài)與原始菌株保持一致，菌株編號為JW-JS1Rif。按1.2.1方法，測定 JW-JS1和JW-JS1Rif菌株的溶磷能力。

1.2.4 JW-JS1Rif在楊樹根際和菌根際的定殖動態(tài)測定 將標(biāo)記菌株JW-JS1Rif活化后接種于 NB 培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng) 36 h制成接種劑，菌數(shù)約109cfu·mL-1。采用灌根法將標(biāo)記菌株接種劑均勻澆灌于各植株周圍土壤，接種量為每盆50 mL，以清水為對照(CK)，每處理3次重復(fù)(3盆)。參照居正英(2008)菌株分離回收方法，分別于接種后第 1、2、3、4、5、7、9、11、16、20、25、30、40 和 50 天取楊樹處理組和對照組進(jìn)行目標(biāo)菌株分離回收。使用抖土法收集楊樹根際和菌根際的土壤樣品，采用平板稀釋法計數(shù)菌落，具體方法如下： 稱取楊樹根際和菌根際待測土樣各1.0 g，加入9.0 mL無菌水進(jìn)行梯度稀釋，選取10-2、10-3、10-4土壤梯度稀釋液各100 μL均勻涂布于 NA 培養(yǎng)基平板上(含300 μg·mL-1利福平)，28 ℃培養(yǎng)48 h后，分別計數(shù)每皿菌落數(shù)，并換算成每克干土中的菌落數(shù)(cfu·g-1)。每處理 3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016和SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析并制圖，利用單因素(One-way ANOVA)和Duncan法進(jìn)行方差分析和多重比較(α= 0.05)。圖表中數(shù)據(jù)為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 JW-JS1菌株的溶磷能力

JW-JS1 菌株在 NBRIP 培養(yǎng)基中培養(yǎng)后培養(yǎng)液可溶性磷含量隨接種時間延長逐漸增加。由圖 1 可知，可溶性磷含量在培養(yǎng) 1～3 天時增速較大，3 天后基本達(dá)到平衡狀態(tài)，增速明顯變緩(4～7 天)，7 天后含量達(dá) 616.39 mg·L-1。培養(yǎng)液 pH 在培養(yǎng)1天時迅速下降，從初始的 7.0 降至 3.73，隨后(2～7 天)基本維持在這一水平(圖 1)。相關(guān)分析表明，JW-JS1 菌株培養(yǎng)液 pH(X)與可溶性磷含量(Y)呈極顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.889**)。

培養(yǎng)液可滴定酸含量的變化趨勢與可溶性磷基本一致。由圖2可知，可滴定酸含量在培養(yǎng)1天時迅速增加，隨后增速變緩(2～7 天)，7 天后含量為 56.30 mmol·L-1。相關(guān)分析表明，JW-JS1 菌株培養(yǎng)液可滴定酸含量(X)與可溶性磷含量(Y)呈極顯著正相關(guān)(r= 0.958**)。進(jìn)一步分析JW-JS1 菌株培養(yǎng)液 pH 與可滴定酸含量的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，二者呈極顯著負(fù)相關(guān)(r=- 0.980**)。

表1 熒光假單胞菌菌株JW-JS1分泌有機(jī)酸種類和含量及可溶性磷含量①

圖1 熒光假單胞菌菌株JW-JS1的溶磷能力與pH的關(guān)系

圖2 熒光假單胞菌菌株JW-JS1的溶磷能力與可滴定酸含量的關(guān)系

2.2 JW-JS1菌株分泌有機(jī)酸的種類和含量

HPLC分析表明，JW-JS1 菌株在 NBRIP 培養(yǎng)基中培養(yǎng) 72 h 后能夠分泌多種有機(jī)酸。由表1可知，JW-JS1 菌株分泌的總有機(jī)酸量(434.39 mg·L-1)明顯高于 CK(25.94 mg·L-1)，是 CK 的 16.74 倍。在培養(yǎng)液中共檢測出為草酸、酒石酸、檸檬酸、順丁烯二酸和反丁烯二酸 5 種有機(jī)酸，其中，草酸含量(273.69 mg·L-1)明顯高于其他種類有機(jī)酸，約占總有機(jī)酸量的 63.01%，這說明 JW-JS1 菌株分泌的草酸可能在溶磷過程中發(fā)揮重要作用。

2.3 JW-JS1菌株在楊樹菌根際的定殖動態(tài)

2.3.1 抗利福平標(biāo)記菌株的篩選及穩(wěn)定性 通過對JW-JS1菌株進(jìn)行抗利福平標(biāo)記，篩選得到抗利福平(300 μg·mL-1)突變菌株JW-JS1Rif。標(biāo)記菌株在不含利福平的NA平板上連續(xù)傳代10次，轉(zhuǎn)接于含300 μg·mL-1利福平的NA平板上生長良好，菌落形態(tài)和顏色等與原始菌株基本相同，即 JW-JS1Rif菌株與JW-JS1菌株的菌落均為乳黃色，圓形菌落小，濕潤，邊緣整齊，說明突變菌株抗性標(biāo)記穩(wěn)定。由表2可知，原始JW-JS1菌株培養(yǎng)液可溶性磷含量為584.17 mg·L-1，在NBRIP培養(yǎng)基中培養(yǎng) 72 h 后，標(biāo)記菌株JW-JS1Rif培養(yǎng)液可溶性磷含量為579.26 mg·L-1，二者差異不顯著(P<0.05)，這說明標(biāo)記菌株JW-JS1Rif的溶磷能力基本未退化，可作為溶磷細(xì)菌的靶標(biāo)細(xì)菌，適合開展定殖試驗研究。

表2 JW-JS1Rif 菌株與 JW-JS1 菌株溶磷能力比較

2.3.2 JW-JS1Rif菌株在楊樹根際和菌根際的定殖動態(tài) 采用灌根法接種后，在楊樹根際和菌根際中均回收到標(biāo)記菌株JW-JS1Rif，而無菌水對照組在含300 μg·mL-1利福平的NA平板上未見細(xì)菌菌落生長。灌根接種處理后，標(biāo)記菌株在楊樹根際和菌根際均能長期穩(wěn)定存活并保持一定的定殖數(shù)量，隨接種時間延長定殖數(shù)量呈下降趨勢，定殖動態(tài)基本一致(圖3)。接種第 1 天時JW-JS1Rif菌株在楊樹根際和菌根際的定殖數(shù)量最大，分別為2.34 × 106和1.34 × 106cfu·g-1，第 2 天時急劇下降，之后趨于平緩，進(jìn)入穩(wěn)定期。接種后第1～9 天JW-JS1Rif菌株在楊樹根際的定殖數(shù)量高于菌根際，隨著接種時間延長，第9～50 天定殖數(shù)量基本保持一致，接種50 天后定殖數(shù)量分別為 5.2×104和4.5×104cfu·g-1。

圖3 JW-JS1Rif菌株在楊樹根際和菌根際的定殖動態(tài)

3 討論

不同種類溶磷微生物的溶磷過程存在較大差異，溶磷機(jī)制也不盡相同。有研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)介質(zhì) pH 降低是溶磷的重要條件而并不是必要條件(Kucey, 1988)，但近年來的研究認(rèn)為培養(yǎng)介質(zhì) pH 與溶磷量之間存在一定的負(fù)相關(guān)(Seshadrietal., 2004)。本研究 JW-JS1 菌株在溶磷過程中，隨著 pH 快速下降，培養(yǎng)液可溶性磷含量迅速上升，當(dāng) pH 降到一定值時可溶性磷基本達(dá)到平衡狀態(tài)，其含量雖有少量增加，但增速明顯變緩，與熒光假單胞菌RAF15 菌株的溶磷規(guī)律基本一致(Parketal., 2009)。分析其其原因可能是： 隨著接種時間延長，培養(yǎng)液中碳源、氮源等營養(yǎng)物質(zhì)逐漸被消耗，一定時間后微生物生長進(jìn)入穩(wěn)定期，可溶性磷含量不再增加。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，JW-JS1 菌株的溶磷能力與培養(yǎng)液 pH 呈極顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.889**)，與趙小蓉(2002)、Antoun(2012)和張英等(2015)研究結(jié)論基本一致。可滴定酸含量可間接反映有機(jī)酸的變化情況(Tyletal., 2017)，JW-JS1菌株的溶磷能力與可滴定酸含量呈極顯著正相關(guān)(r= 0.958**)，與劉輝等(2010)和 Tyl 等(2017)研究結(jié)論基本一致。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，JW-JS1菌株培養(yǎng)液pH與可滴定酸含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(r=- 0.980**)，這說明培養(yǎng)液 pH 降低和可滴定酸含量增加可能是由于JW-JS1 菌株分泌有機(jī)酸引起的。

分泌有機(jī)酸是微生物溶解無機(jī)磷的主要機(jī)制之一，分泌的酸既可降低培養(yǎng)介質(zhì) pH，又可通過羥基或羧基與 Ca2+、Fe3+、AL3+等金屬陽離子螯合，使難溶性磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷(Khanetal., 2007)。目前，已報道的 PSM 產(chǎn)生的有機(jī)酸多種多樣，主要包括草酸、乳酸、蘋果酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、丁二酸、乙酸和葡萄糖酸等(Chenetal., 2006; Songetal., 2008)。本研究通過 HPLC 檢測發(fā)現(xiàn)， JW-JS1 菌株在溶磷過程中能夠分泌草酸、酒石酸、檸檬酸、順丁烯二酸和反丁烯二酸。不同微生物在溶解不溶性磷酸鹽時，產(chǎn)生的有機(jī)酸種類和數(shù)量有很大不同，特定的溶磷微生物在溶磷過程中分泌的有機(jī)酸種類和數(shù)量也在變化(Vyasetal., 2009)，與本研究結(jié)果相一致。草酸屬共軛酸，草酸根遇到 Ca2+會形成草酸鈣沉淀，從而使與 Ca2+結(jié)合的磷酸根得以釋放，對提高難溶性磷酸鈣鹽的溶解性起到重要作用(王樹起等， 2009)。本研究發(fā)現(xiàn)，在檢測出的5種有機(jī)酸中，草酸分泌量最大，其含量明顯高于其他種類有機(jī)酸，這說明 JW-JS1 菌株分泌的草酸可能在溶磷過程中發(fā)揮重要作用，與 Li 等(2016)、馮哲葉等(2017)研究論相似。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，有關(guān)溶磷基因的報道很多，如pqq基因(焦子偉等， 2016)、gab-Y基因(Babu-khanetal., 1995)、GDH基因(楊美英等， 2016)等；gcd基因(Sulemanetal., 2018)的成功克隆不僅說明了溶磷基因的豐富性，而且也佐證了溶磷機(jī)制的復(fù)雜性。因此，今后應(yīng)采用分子生物學(xué)技術(shù)深入揭示溶磷相關(guān)基因的種類和功能，從而更深入地闡明熒光假單胞菌菌株JW-JS1的溶磷機(jī)制。

植物根際有益微生物一直面臨著應(yīng)用效果不穩(wěn)定的問題，而造成不穩(wěn)定的因素主要是有益微生物在植物根際的定殖能力存在差別(孫真等， 2017)。李阜棣(1996)研究認(rèn)為，外源微生物介入土壤必須經(jīng)過與土著微生物生態(tài)位的競爭(包括營養(yǎng)、空間等)，才能在根際定殖并發(fā)揮作用。王恒煦等(2019)利用利福平標(biāo)記3株芽孢桿菌(Bacillussp.)，明確了其在水稻(Oryzasativa)根際的定殖能力。本研究利用利福平標(biāo)記篩選出含 300 μg·mL-1利福平抗性的菌株JW-JS1Rif，灌根法定殖檢測發(fā)現(xiàn)，JW-JS1Rif菌株在楊樹根際和菌根際均能穩(wěn)定存活并保持一定的定殖數(shù)量，隨接種時間延長定殖數(shù)量呈下降趨勢，定殖動態(tài)基本一致，分析其原因可能是標(biāo)記菌株在楊樹根際和菌根際定殖需要一個適應(yīng)過程，定殖數(shù)量在早期迅速下降，但經(jīng)過一段時間適應(yīng)后逐漸趨于穩(wěn)定，與Theoduloz等(2003)和王恒煦等(2019)研究結(jié)論一致。接種后第1～9天JW-JS1Rif菌株在楊樹根際的定殖數(shù)量略高于菌根際，這可能是因為楊樹根際環(huán)境不存在外生菌根真菌的競爭，更適于其繁殖，而楊樹菌根際由于紅絨蓋牛肝菌Xc 的存在，可能對JW-JS1Rif菌株在營養(yǎng)、生態(tài)位等方面產(chǎn)生一定的競爭性，從而導(dǎo)致其定殖數(shù)量低于根際，但隨著接種時間延長，二者定殖數(shù)量基本維持在同一水平，這也說明該菌株與Xc 生物兼容性較好，能夠在同一生態(tài)位上形成穩(wěn)定的功能菌群，在活化土壤磷營養(yǎng)和促進(jìn)楊樹生長上發(fā)揮協(xié)同互作作用，與姚如斌等(2012)、劉輝等(2018； 2019)研究結(jié)論一致。單一菌種向多種功能菌種的組合應(yīng)用是提高微生物肥料效果的有效途徑(楊順等， 2018)，本研究結(jié)果表明熒光假單胞菌菌株JW-JS1 與紅絨蓋牛肝菌 Xc 是構(gòu)建楊樹專用功能復(fù)合微生物肥料的理想材料。

4 結(jié)論

熒光假單胞菌菌株 JW-JS1 的溶磷能力與培養(yǎng)液 pH 呈極顯著負(fù)相關(guān)、與可滴定酸含量呈極顯著正相關(guān)，培養(yǎng)液 pH降低和可滴定酸含量增加可能是由于JW-JS1菌株分泌有機(jī)酸引起的。JW-JS1菌株在溶磷過程中能夠分泌草酸、酒石酸、檸檬酸、順丁烯二酸和反丁烯二酸，其中草酸可能在溶磷過程中發(fā)揮重要作用。JW-JS1 菌株在楊樹根際和菌根際均能長期穩(wěn)定存活并保持一定的定殖數(shù)量，定殖動態(tài)基本一致，熒光假單胞菌菌株JW-JS1與紅絨蓋牛肝菌 Xc 生物兼容性較好，能夠在同一生態(tài)位形成穩(wěn)定的功能菌群，具有開發(fā)成楊樹專用功能復(fù)合微生物肥料的潛力。