張鳳國,張永勤,邢明霞,許文廷,呂興霜,王裕曉,王鵬博

(青島科技大學(xué) 化工學(xué)院，山東青島266042)

Lowrry法[1]作為一種蛋白濃度的測定方法，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、醫(yī)療診斷、酶制劑、生物化工等行業(yè)的蛋白濃度測定。相較于BCA法[2-3]、考馬斯亮藍(lán)(Bardford)G250法[4-5]、熒光光譜法[6]、紫外法[7]等蛋白濃度測定方法，Lowrry法的靈敏度最高[8]，因而測定不易受雜質(zhì)干擾而廣為采納。迄今為止，有多項(xiàng)國家標(biāo)準(zhǔn)[9-10]將該方法應(yīng)用于蛋白酶活力測定中的蛋白濃度測定;Sigma公司也出售相關(guān)試劑并提供相應(yīng)的蛋白濃度測定方法[11]。

該法的測定原理是基于蛋白質(zhì)分子中所存在的酪氨酸和色氨酸，它們與堿性硫酸銅作用形成銅-肽鍵絡(luò)合物，后者與酪氨酸共同作用使酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸還原生成鉬藍(lán)和鎢藍(lán)，其顏色與酪氨酸含量成正比。

然而，目前文獻(xiàn)所報(bào)道測定條件有多種，主要集中在兩方面。其一，所用的Folin A試劑不同，有的使用Folin A(以下簡稱為Folin A法)[12]，而有的是Na2CO3(以下簡稱Na2CO3法)[9-11];其二，文獻(xiàn)報(bào)道的檢測波長有多種[13-25]。但有關(guān)測定波長方面的研究至今未見相關(guān)報(bào)道。NOLASCO-SORIA等[26]較全面地綜述了蛋白酶活力測定方法中的Lowrry法，但并未評述其最適檢測波長，也未比較Folin A試劑及其替代試劑Na2CO3間是否有差異，這為選擇適宜的測定條件帶來了混亂。因此，本工作擬對此進(jìn)行必要的研究，以便正確地確定Lowrry法測定蛋白濃度的條件。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 材料與儀器

酪氨酸、酪蛋白，上海阿拉丁生化科技股份有限公司;牛血清白蛋白，美國Sigma公司;磷酸、鉬酸鈉、鎢酸鈉、溴水、硫酸鋰、碳酸鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、磷酸鈉、磷酸二氫鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

紫外-可見光分光光度計(jì)，UV2600型，日本島津公司;移液器，賽默飛世爾(上海)儀器有限公司;電子天平，AL-201型，瑞士梅特勒-托利多公司。

1．2 試劑的配制

1．2．1 酪氨酸溶液的配制

將酪氨酸于105℃干燥至恒重，以減量法準(zhǔn)確稱取0.1 g(精確至0.000 1 g)，用水溶解并定容至100 m L，即得酪氨酸溶液(1 mg·m L－1)，用水按比例稀釋1 mg·m L－1的酪氨酸溶液，充分混勻后，取10 m L加水定容至100 m L，配成100μg·m L－1的酪氨酸溶液。

1．2．2 Folin試劑的配制

參考LOWRRY等[1，12]的方法，方法需要配制Folin A液和Folin B液兩種試劑。具體配制方法如下。

1．2．2．1 Folin A液

A1液:將4%Na2CO3(%為w/V，以下同)溶液和0.2 mol·L－1NaOH按照體積比1∶1混合;A2液:1%CuSO4·5 H2O和2%酒石酸鉀鈉按照1∶1的體積比混合，再將A1液與A2液按照50∶1的體積比混合，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1．2．2．2 Folin B液

在2 000 m L的磨口回流裝置中加入100 g的二水合鎢酸鈉、25 g的二水合鉬酸鈉、700 m L的蒸餾水以及50 m L體積分?jǐn)?shù)85%的磷酸和100 m L的濃鹽酸，充分混合后，微沸以小火回流10 h，再加入150 g的硫酸鋰，50 m L的蒸餾水及數(shù)滴液體溴。然后開口繼續(xù)沸騰15 min以除去多余的溴，冷卻后用水定容至到1 000 m L容量瓶中，混勻后過濾，于棕色瓶貯存。該試劑經(jīng)NaOH標(biāo)定，其HCl的含量為2.016 mol·L－1。將該溶液與水分別按照1∶1和1∶2的體積比得到Folin B1也和Folin B2液。

1．3 實(shí)驗(yàn)方法

1．3．1 蛋白質(zhì)濃度的測定

1．3．1．1 Folin A法

根據(jù)Lowrry法，將L-酪氨酸溶液0.4 m L與Folin A液2 m L充分混合10 min后，再加入Folin B液(原液與水1∶1稀釋)0.2 m L，迅速混勻，于25℃水浴放置30 min后，用分光光度計(jì)在540～750 nm內(nèi)進(jìn)行波譜掃描。每個(gè)待測樣品做3個(gè)平行樣。

1．3．1．2 Na2CO3法

參照文獻(xiàn)的方法[9]略有修改，將L-酪氨酸溶液0.4與2.0 m L的碳酸鈉(0.4 mol·L－1)充分混合10 min后，加0.4 m L Folin B液(原液與水體積比1∶2)，迅速混勻，于25℃水浴放置30 min后，用分光光度計(jì)在540～750 nm內(nèi)進(jìn)行波譜掃描。每個(gè)待測樣品做3個(gè)平行樣。

1．3．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與波譜掃描

1．3．2．1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與波譜掃描

分別將L-酪氨酸溶液(100μg·m L－1)按比例稀釋成10個(gè)濃度梯度的L-酪氨酸溶液(0，5，10，20，30，40，50，60，70，80，100μg·m L－1)，每個(gè)濃度3個(gè)平行樣，按照1.3.1的方法進(jìn)行波譜掃描，并獲得不同波長下的吸光度值。將L-酪氨酸的濃度范圍分為8組，分別為0～20，0～30，0～40，0～50，0～60，0～70，0～80，0～100μg·m L－1，編號分別為1，2，3，4，5，6，7，8。以L-酪氨酸濃度為橫坐標(biāo)，以每個(gè)波長下各濃度的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制上述8組每個(gè)濃度范圍的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1．3．2．2 BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與波譜掃描

分別將牛血清白蛋白(BSA)溶液(0.50 mg·m L－1)按比例稀釋成9個(gè)濃度梯度的BSA溶液(0，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35，0.40，0.50 mg·m L－1)，每個(gè)濃度3個(gè)平行樣，按照1.3.1的方法進(jìn)行波譜掃描，并獲得不同波長下的吸光度值。將BSA的濃度范圍分為5組，分別為0～0.10，0～0.20，0～0.25，0～0.30，0～0.40，0～0.50 mg·m L－1，編號分別為1，2，3，4，5，6。以BSA的濃度為橫坐標(biāo)，以每個(gè)波長下各濃度的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制上述5組每個(gè)濃度范圍的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1．3．3 激活劑對蛋白質(zhì)測定的影響

將相同體積的BSA溶液與含有激活劑的PBS混合(2.2 mmol·L－1EDTA，11 mmol·L－1L-半胱氨酸，0.134 mmol·L－12-巰基乙醇)，并以不含激活劑的PBS為對照，分別按照1.3.1.1、1.3.1.2的方法，以水為空白進(jìn)行測定。

1．3．4 數(shù)據(jù)處理與選擇最佳波長的方法

采用Excel 2016進(jìn)行圖表及數(shù)據(jù)處理，并計(jì)算每個(gè)波長下的斜率、R2和截距;通過對各波長下線性回歸的斜率、回歸系數(shù)R2、線性截距、空白等進(jìn)行綜合評價(jià)，確定出最佳測定波長。

2 結(jié)果與討論

2．1 檢測波長對酪氨酸濃度測定的影響

為便于蛋白質(zhì)濃度計(jì)算，過原點(diǎn)的線性回歸方程為首選，因?yàn)樵谠摋l件下，蛋白溶液的稀釋倍數(shù)不會(huì)影響測定結(jié)果。

利用Folin A法測定波長對酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率、R2和截距的影響見圖1。

圖1 測定波長對Folin A法測定酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率、R 2和截距的影響Fig．1 Effect of detection wavelength on the slope，R 2 and intercept of L-tyrosine standard curve by Folin A methods

標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率隨波長增大而增大(圖1(a))，但線性決定系數(shù)R2卻隨之降低(圖1(b))，而且其濃度范圍越寬，斜率越低，R2越差。究其原因是由于酪氨酸濃度為0的空白吸光度值(圖1(c)內(nèi)圖)隨波長的增大幅度明顯大于酪氨酸在高濃度區(qū)域的增大幅度，從而導(dǎo)致截距增大(如圖1(c)所示)。因此，選取截距趨近于0的波長區(qū)域(540～600 nm)是蛋白質(zhì)測定時(shí)的最佳選擇，在該波長區(qū)域的R2均在0.999 5以上。在酪氨酸的寬濃度范圍(0～100μg·m L－1)以600 nm以下波長測量為宜，以555 nm為例，其線性回歸方程為y＝0.008 58x＋0.000 2(R2＝0.999 9)。而高波長區(qū)域則適合于對低濃度(≤40μg·m L－1)的酪氨酸測定，以750 nm為例，其線性回歸方程y＝0.013x＋0.011(R2＝0.998 2)。

與Folin A法相比，Na2CO3法的波譜曲線更加平滑，這可能與產(chǎn)物的穩(wěn)定性有關(guān)。在Na2CO3法中，測定波長在660～750 nm區(qū)域內(nèi)，其線性方程的變化趨勢(圖2的(a)、(b)、(c))同F(xiàn)olin A法的類似，其最高酪氨酸濃度范圍為0～40μg·m L－1。該濃度范圍在該波長區(qū)域內(nèi)的線性方程均接近原點(diǎn)，如圖2(c)所示，以檢測波長750 nm為例，其回歸方程為y＝0.012 5x＋0.002 8(R2＝0.999 3)。在測定波長540～660 nm區(qū)域內(nèi)，酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線在0～100μg·m L－1濃度范圍內(nèi)均保持良好的線性關(guān)系(圖2(b))。但是，酪氨酸濃度范圍越寬，即，酪氨酸濃度越高，標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距越大(圖2(c))，雖然R2仍在0.999以上(圖2的(b))。為便于蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確測定，應(yīng)選擇過原點(diǎn)的高靈敏度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，因此，測定波長660～665 nm為最佳選擇，以665 nm為例，其線性方程為y＝0.010 3x＋0.000 3(R2＝0.999 7)，此結(jié)果與文獻(xiàn)[11，20]報(bào)道相一致。

圖2 測定波長對Na2 CO3法測定酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率、R 2和截距的影響Fig．2 Effect of detection wavelength on the slope，R 2 and intercept of L-tyrosine standard curve by Na2 CO3 methods

2．2 激活劑對兩種酪氨酸測定方法的影響

Lowrry法除了可以用于測定酪氨酸，因酪氨酸是組成蛋白質(zhì)的常見20種氨基酸之一，所以該法還可用于測定蛋白濃度、蛋白酶活力等酪氨酸組成物質(zhì)的領(lǐng)域。但在蛋白酶活力測定方法中，為保持蛋白酶活力，常需加入2-巰基乙醇、L-半胱氨酸鹽酸鹽和EDTA等[27-29]相應(yīng)的激活劑。這類蛋白酶有木瓜蛋白酶[30-31]、組織蛋白酶系列[32-34]等。因此，為了考察了激活劑對蛋白測定的影響，以牛血清白蛋白(BSA，0.167 mg·m L－1)為研究對象，以加激活劑和不加激活劑作對比，分別采用Folin A法和Na2CO3法進(jìn)行蛋白濃度測定，并進(jìn)行波譜掃描，結(jié)果見圖3。

圖3 激活劑對蛋白質(zhì)測定的影響Fig．3 Effect of activators on the protein assay

從圖3可以看出，在加入激活劑后，F(xiàn)olin A法和Na2CO3法測定值均增大，具體數(shù)值見表1。在Na2CO3法中，加與不加激活劑在680 nm下，其測定值相差84.5倍，且測定值在5.0(605～760 nm)以上，已超出測定范圍;而在Folin A法中，在555 nm下測定的吸光度值則相差3.9倍。在實(shí)際應(yīng)用中，激活劑已是不可或缺的一部分，用不加激活劑的酶活力測定方法去評估在激活劑存在下的蛋白酶活力，將不利于蛋白酶制劑的實(shí)際應(yīng)用與研發(fā)。因此，相較Na2CO3法，F(xiàn)olin A法更有可能通過條件優(yōu)化而達(dá)到定量測定條件。

表1 激活劑對Na2 CO3和Folin A法測定吸光度值的影響Table 1 Effect of activators on the BSA assay by Na2 CO3 and Folin A methods

2．3 檢測波長對BSA濃度測定的影響

在蛋白質(zhì)濃度測定中，往往以分子結(jié)構(gòu)中含有L-酪氨酸單元的BSA作為參考物質(zhì)計(jì)算待測溶液的蛋白濃度。由于待測溶液往往含有可能影響測定的非蛋白成分，因此，首選Folin A法研究波長對BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線測定的影響，見圖4。標(biāo)準(zhǔn)曲線隨波長的變化情況與酪氨酸的類似，斜率隨檢測波長的增加而增加，其濃度范圍越寬，斜率越低(圖4(a))，R2越差(圖4(b))，其最大值在550～600 nm區(qū)域。BSA濃度為0的空白吸光度值(圖4(c)內(nèi)圖)隨波長的增大幅度明顯大于高濃度酪氨酸的增大幅度，從而導(dǎo)致截距增大，如圖4(c)所示，隨著蛋白濃度范圍的增大，標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距逐漸偏離原點(diǎn)，特別是在波長大于550 nm區(qū)域，截距明顯增大，這不利于蛋白濃度的定量測定。

圖4 測定波長對Folin A法測定BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率、R 2和截距的影響Fig．4 Effect of detection wavelength on the slope，R 2，intercept of BSA standard curve by Folin A methods

綜合圖4的結(jié)果，當(dāng)BSA在0～0.3 mg·m L－1范圍內(nèi)，其最佳檢測波長為555 nm，其線性回歸方程為y＝1.916 2x＋0.006 6(R2＝0.998 1);當(dāng)BSA在0～0.25 mg·m L－1范圍內(nèi)，其R2在450～570 nm區(qū)域內(nèi)維持在0.999以上，以560 nm為例，其線性回歸方程y＝1.999 4x＋0.002(R2＝0.999);當(dāng)BSA在0～0.2 mg·m L－1范圍內(nèi)，其R2在467～631 nm區(qū)域內(nèi)維持在0.999 9以上，以630 nm為例，其線性回歸方程y＝2.491 3x＋0.000 9(R2＝0.999 9)(見表2)。

表2 波長對Folin A法測定BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響Table 2 Effect of wavelength on the determination of BSA standard curve by Folin A method

3 結(jié) 論

以酪氨酸和BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線為研究對象，對蛋白濃度的測定方法的波長及檢測蛋白濃度的范圍進(jìn)行研究，對酪氨酸測定而言，在0～100μg·m L－1范圍內(nèi)，F(xiàn)olin A法在540～600 nm之間測定，線性相關(guān)性較好，其中截距在555 nm處是最低的，回歸方程y＝0.008 58x＋0.000 2(R2＝0.999 9)，而Na2CO3法則是在660～665 nm線性相關(guān)性較好，以665 nm為例，其線性方程為y＝0.010 3x＋0.000 3(R2＝0.999 7)，相比于Folin A(555 nm)具有更高的靈敏度，特別適合于不需要2-巰基乙醇、L-半胱氨酸鹽酸鹽和EDTA等激活劑存在的蛋白酶活力測定中的蛋白濃度測定。Folin A法更適合于測定波長在600 nm以下的蛋白濃度測定以及含有激活劑的的蛋白酶活力測定中的蛋白濃度測定。在Folin A法中，BSA的最佳檢測波長為555 nm，而在低濃度范圍(0～0.2 mg·m L－1)，其R2在540～631 nm區(qū)域均保持0.999 9以上，以630 nm為例，其線性方程為y＝2.491 3x＋0.000 9(R2＝0.999 9)。