（石家莊醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 河北 050000）

高效液相色譜法（HPLC）是在經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上引入氣相色譜法的塔板理論和速率理論，逐步發(fā)展起來(lái)的一種分離分析方法。高效液相色譜法最大的優(yōu)勢(shì)是分離混合物中各種組分，相較于經(jīng)典液相色譜法，HPLC中加入了高壓泵，而且固定相顆粒比經(jīng)典液相色譜法固定相顆粒直徑要小且均勻，從而提高了分離分析的速度，通常分離分析僅需要幾分鐘到幾十分鐘。相較于氣相色譜法來(lái)說(shuō)，高效液相色譜法可用于熱不穩(wěn)定物質(zhì)的分離分析。由于分離分析速度快，分離效果好等優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、檢驗(yàn)等各領(lǐng)域，高效液相色譜法都有著十分廣泛的應(yīng)用。

1.高效液相色譜法測(cè)定條件的選擇

HPLC在分離混合物時(shí)，如何選擇色譜條件，決定著分離效果。HPLC色譜分離條件的選擇主要以塔板理論和速率理論作為指導(dǎo)，包括色譜柱規(guī)格的選擇、固定相和流動(dòng)相的選擇、柱溫的控制、流動(dòng)相流速控制等。

(1)色譜柱規(guī)格的選擇

色譜柱規(guī)格主要包括柱長(zhǎng)，柱內(nèi)徑以及固定相顆粒直徑。

高效液相色譜柱柱內(nèi)徑的規(guī)格有2.1mm、3mm、4.6mm等，但目前最常用的是4.6mm。其它條件相同情況下，色譜柱內(nèi)徑越大，能分離樣品的量越大，得到的峰形越好，對(duì)高效液相色譜儀器中的死體積敏感性越低，柱效相對(duì)也會(huì)高一些，但內(nèi)徑越大，在相同流速下，會(huì)消耗更多的溶劑。

綜上所述，在色譜柱規(guī)格選擇上，要進(jìn)行綜合考量。

(2)固定相和流動(dòng)相的選擇

固定相和流動(dòng)相選擇合理，才能使混合物中各組分得到較好的分離效果。

①固定相的選擇

在液-固色譜法中，現(xiàn)在應(yīng)用最廣泛的固定相有硅膠、活性炭等，硅膠同時(shí)還可用于液-液分配色譜法中的載體和鍵合相色譜中的基體。近年來(lái)，鍵合相色譜法應(yīng)用較多，因?yàn)檫@種方法可減少固定液的流失，分離效果好，適用范圍廣。弱極性脂溶性成分一般用正相鍵合相色譜，而弱極性、中等極性和較強(qiáng)極性的物質(zhì)一般采用反相鍵合相色譜，可見反相鍵合相色譜應(yīng)用范圍更廣一些。在反相鍵合相色譜中固定相常用的是C18，即把十八個(gè)碳原子的烷烴通過(guò)反應(yīng)鍵合到硅膠上，固定相顆粒分為全多孔型和表面多孔型（薄殼型微珠）。相對(duì)分子量超過(guò)2000的高分子化合物如蛋白質(zhì)、核酸和聚合物等可以采用凝膠色譜法，在這種方法中，應(yīng)用最多的固定相是葡聚糖凝膠。當(dāng)被分離的物質(zhì)為離子或者可解離的化合物，可以采用離子交換色譜法，這種方法的固定相普遍使用的是鍵合型離子交換劑。

②流動(dòng)相的選擇

高效液相色譜法流動(dòng)相可以是一種溶劑組成，也可以是兩種或兩種以上溶劑組成。常見流動(dòng)相有水、甲醇、乙腈、四氫呋喃，這幾種溶劑為極性溶劑，常用于反相色譜中。在正相色譜中，普遍使用的流動(dòng)相有正己烷、乙醚、乙酸乙酯等。在實(shí)際應(yīng)用中，常常把幾種溶劑按照合適的比例混合在一起，溶劑成分和比例不同，極性也不同，對(duì)被測(cè)物的溶解能力不同，分離的效果自然也會(huì)不同，出峰時(shí)間也會(huì)相應(yīng)發(fā)生變化。流動(dòng)相對(duì)于被分離的物質(zhì)必須要有合適的極性和選擇性。

反相色譜中，流動(dòng)相的pH值影響組分的保留時(shí)間，同時(shí)也會(huì)影響色譜峰的峰形以及分離度。分離弱酸性樣品時(shí)，常加入少量的弱酸，抑制樣品的解離，反之分離弱堿性樣品時(shí)，常加入少量的弱堿，抑制弱堿樣品的解離，以獲得良好的峰形。

(3)柱溫的控制

高效液相色譜法中，一般情況下，提高柱溫，可以影響分離度，降低保留時(shí)間，提高柱效，增大樣品的溶解度，使得色譜峰更加對(duì)稱，但過(guò)高的柱溫會(huì)使得流動(dòng)相產(chǎn)生氣泡。柱溫的控制要根據(jù)樣品組分的性質(zhì)而定，如對(duì)于黏度大或高分子化合物，設(shè)置柱溫時(shí)要高于室溫，對(duì)于具有生物活性的生物分子，溫度過(guò)高會(huì)使其失去生物活性，所以柱溫要設(shè)置為低于室溫。

(4)流動(dòng)相流速控制

根據(jù)范第姆特方程，流動(dòng)相的流速會(huì)對(duì)色譜柱的柱效和組分的保留時(shí)間有一定的影響，在一定范圍內(nèi)，流速越大，柱效會(huì)提高，分析時(shí)間會(huì)縮短，但超過(guò)某一流速值，柱效就會(huì)降低，這個(gè)流速值稱為最佳流速。其它條件相同的前提下，色譜柱內(nèi)徑不同，設(shè)定的流速也應(yīng)當(dāng)不同，比如當(dāng)內(nèi)徑是4.6mm時(shí)，通常將流速設(shè)定為1mL/min。

(5)檢測(cè)器的選擇

高效液相色譜法的檢測(cè)器分為示差折光檢測(cè)器、紫外吸收檢測(cè)器、光電二極管陣列檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器等。不同的檢測(cè)器都有相應(yīng)的優(yōu)勢(shì)和缺陷，要根據(jù)被測(cè)物的種類、被測(cè)物含量以及流動(dòng)相對(duì)測(cè)定是否有影響等因素，選擇合適檢測(cè)器。

如光電二極管陣列檢測(cè)器可以全波段掃描，能得到三維立體圖譜，而紫外吸收檢測(cè)器只能用設(shè)定的波長(zhǎng)對(duì)被分離后的組分進(jìn)行掃描。示差折光檢測(cè)器常用于萜類化合物、多糖類化合物含量的測(cè)定，但不能采用梯度洗脫。熒光檢測(cè)器適用于能顯示熒光的被測(cè)物含量檢測(cè)，常用于生化分析和藥物分析中，這種檢測(cè)器的靈敏度很高，痕量組分檢測(cè)就可以考慮選擇熒光檢測(cè)器，如PM2.5中苯并[a]芘含量的測(cè)定。

2.高效液相色譜法在檢驗(yàn)領(lǐng)域中的應(yīng)用與發(fā)展

高效液相色譜法廣泛應(yīng)用于藥物檢驗(yàn)、食品檢驗(yàn)、生物化學(xué)檢驗(yàn)、臨床檢驗(yàn)等領(lǐng)域，例如通過(guò)檢驗(yàn)生物體內(nèi)的多肽和蛋白質(zhì)含量，可分析出生物體內(nèi)的多肽和蛋白質(zhì)的變化情況。食品檢驗(yàn)中可以檢測(cè)防腐劑、黃曲霉素、瘦肉精等含量。臨床檢驗(yàn)中，高效液相色譜法可以檢測(cè)體內(nèi)氨基酸、膽汁酸、核酸、多種同工酶。

高效液相色譜法最大優(yōu)勢(shì)在于分離混合物中物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)相近的組分。但高效液相色譜法在定性分析和定量分析中有一定局限性，比如要有參照物或者標(biāo)準(zhǔn)樣品，用紫外吸收檢測(cè)器在最大波長(zhǎng)處可能會(huì)受干擾，靈敏度低等因素，所以高效液相色譜法經(jīng)常與其它檢驗(yàn)方法一起使用，比如質(zhì)譜法。用高效液相色譜法對(duì)混合物進(jìn)行分離，分離后各組分的含量用質(zhì)譜法進(jìn)行分析測(cè)定，質(zhì)譜法靈敏度高，檢測(cè)下限低，而且能夠提供相對(duì)分子量和結(jié)構(gòu)等信息，充分發(fā)揮了兩種測(cè)定方法的優(yōu)勢(shì)，是近幾年來(lái)被廣泛應(yīng)用的一種分析方法。

3.小結(jié)

綜上所述，在采用高效液相色譜法時(shí)，為保證良好的分離效果，需要通過(guò)綜合考量和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，最終確定最優(yōu)的測(cè)定條件。由于高效液相色譜法在定性分析和定量分析的限制性，高效液相色譜法常常與質(zhì)譜法聯(lián)合應(yīng)用，從而擴(kuò)大了檢測(cè)范圍。今后，高效液相色譜法還可以通過(guò)與其它檢驗(yàn)方法的聯(lián)合使用，進(jìn)一步擴(kuò)大檢測(cè)范圍，在檢驗(yàn)領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。