江靜 陳勇 蔣璐

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤，也是影響全球女性癌癥死亡的主要原因之一[1]。目前宮頸癌的主要治療方法包括手術(包括盆腔淋巴結切除術和根治性子宮切除術)、放療和化療。雖然這些治療方法取得了一定的進展，但宮頸癌患者的生存率并未得到顯著提高。放療和化療產(chǎn)生較大的不良反應，嚴重阻礙治療效果，且在很大程度上影響患者的生活質量[2]。目前，包括分子靶向治療和基因治療等治療方式替代輔助治療，在腫瘤治療中得到廣泛應用[3,4]。宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展與癌基因的激活、抑癌基因的失活等多基因調控密切相關[5]。因此，發(fā)掘與宮頸癌發(fā)生相關的基因，并探索其作用機制對宮頸癌的基因治療和患者預后具有重要意義。細胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白2A(cyclin-dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A)基因位于染色體9p21上，屬于腫瘤抑制基因。有報道在幾種類型的惡性腫瘤中CDKN2A基因啟動子區(qū)域的高甲基化導致其失活，包括食管癌、乳腺癌和鱗狀細胞肺癌等[6-8]。系統(tǒng)鑒定浸潤性宮頸癌發(fā)展中的關鍵基因和途徑中發(fā)現(xiàn)，CDKN2A等基因的調節(jié)異常可能與宮頸癌的進展相關[9]。但CDKN2A在宮頸癌組織的表達情況及對宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響筆者尚未見報道。因此，本研究檢測CDKN2A在宮頸癌組織的表達情況，并通過體外實驗研究CDKN2A對宮頸癌SiHa細胞增殖和凋亡的影響，并進一步探究其可能的分子機制，以期為宮頸癌的基因治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2018年6月至2019年6月在重慶市第七人民醫(yī)院和陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院行手術切除的宮頸癌組織及相應癌旁組織(距腫瘤邊緣>5 cm)標本，共30例，標本取下立即置于液氮中保存，患者年齡35～65歲。標本均經(jīng)病理科鑒定，標本采集均經(jīng)患者及家屬知情同意并簽署知情同意書，且經(jīng)過醫(yī)院的倫理學通過；患者術前均未接受放療或化療等其他輔助治療。

1.2 細胞株與主要試劑 人宮頸癌SiHa細胞株(中國科學院上海細胞庫)；胰蛋白酶、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)；青霉素-鏈霉素雙抗(北京雷根生物技術有限公司)；CDKN2A過表達載體質粒(pc-CDKN2A)及空載質粒(pcDNA)(廣州銳博生物科技有限公司)；Lipofectamine 2000脂質體轉染試劑(美國Invitrogen公司)；MTT試劑(美國Sigma公司)；AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色細凋亡檢測試劑盒(日本TaKaRa公司)；RIPA裂解液(上海碧云天生物技術研究所)；BCA蛋白濃度檢測試劑盒、ECL化學發(fā)光檢測試劑盒(美國Piece公司)；PCNA、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、β-catenin和c-myc單抗及二抗(美國CST公司)。

1.3 細胞培養(yǎng) 從液氮中取出保存的人宮頸癌SiHa細胞，溶解復蘇后接種在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(含100 mg/L青霉素-鏈霉素雙抗)的培養(yǎng)瓶中，放置于5% CO2、飽和濕度、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，及時更換新的培養(yǎng)液，細胞貼壁后融合度>90%，以0.25%的胰蛋白酶消化細胞，根據(jù)需要進行傳代培養(yǎng)，取對數(shù)期的SiHa細胞用于后續(xù)研究。

1.4 細胞轉染與分組 生長狀態(tài)良好的SiHa細胞以胰酶消化，以1×106個/孔接種到6孔板中，于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，待細胞生長密度達60%時進行轉染，轉染具體操作參照Lipofectamine 2000脂質體轉染試劑使用說明書，分別將CDKN2A過表達載體質?；蚩蛰d質粒轉染至SiHa細胞，其中轉染CDKN2A過表達載體質粒的SiHa細胞為pc-CDKN2A組，轉染空載質粒的SiHa細胞為pcDNA組，同時將未行轉染的SiHa細胞為Control組，3組SiHa細胞轉染后于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，6 h后更換成正常培養(yǎng)液，轉染48 h分別收集3組SiHa細胞，進行相關指標檢測。

1.5 Western blot檢測 取出保存的宮頸癌組織及癌旁組織標本，研磨并加入RIPA裂解液提取蛋白，轉染48 h 3組SiHa細胞加入RIPA裂解液提取總蛋白。提取的蛋白以BCA法測定濃度，加熱變性后，取40 μg蛋白行SDS-PAGE電泳，蛋白分離后轉移到PVDF膜上，將膜浸入5%脫脂牛奶中封阻2 h，洗膜后加入相應一抗(CDKN2A一抗為1∶500稀釋，PCNA、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9一抗均為1∶800稀釋，β-catenin和c-myc一抗均為1∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜，洗膜后加入1∶3 000稀釋的二抗，置搖床上孵育2 h，洗膜后加入ECL顯色試劑，避光顯影，以凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，用GAPDH標定，采用Image J軟件分析3組SiHa細胞中目的蛋白相對表達水平。實驗至少重復3次。

1.6 MTT實驗 轉染后，即將3組SiHa細胞以5×103個/孔接種到96孔板中，每組設置3個復孔，放置在37℃培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，48 h后向細胞中加入MTT試劑(100 μl/孔)，37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，除去培養(yǎng)液，再向細胞中加入二甲基亞砜(150 μl/孔)，于搖床上反應10 min，待沉淀全部溶解后使用酶標儀測定各孔細胞在450 nm波長處光密度(OD)值，計算3組SiHa細胞存活率，細胞存活率=試驗組OD值/對照組OD值×100%。實驗至少重復3次。

1.7 AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色法檢測 3組SiHa細胞轉染48 h用胰酶消化，預冷的PBS將細胞洗滌2次，收集約1×105個細胞，向細胞中加入Binding Buffer緩沖液100 μl重懸細胞，將細胞懸液加入到流式管內，再向管中添加AnnexinⅤ-FITC 5 μl，PI 5 μl，充分混勻，室溫下避光反應15 min，再向管中加入Binding Buffer緩沖液400 μl，混勻，立即上流式細胞儀檢測。實驗至少重復3次。

2 結果

2.1 CDKN2A在宮頸癌組織中的表達 與癌旁組織相比，CDKN2A在宮頸癌組織中的蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 Western blot檢測宮頸癌組織和癌旁組織中CDKN2A蛋白表達

表1 宮頸癌組織和癌旁組織中CDKN2A蛋白表達水平比較

2.2 轉染CDKN2A過表達載體質粒后SiHa細胞中CDKN2A的蛋白表達 Western blot檢測轉染48 h后Control組、pcDNA組和pc-CDKN2A組SiHa細胞中CDKN2A的蛋白表達。與pcDNA組相比，pc-CDKN2A組SiHa細胞中CDKN2A的蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與Control組相比，pcDNA組中CDKN2A的蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2，表2。

表2 3組SiHa細胞中CDKN2A蛋白表達水平比較

圖2 Western blot檢測3組SiHa細胞中CDKN2A的蛋白表達

2.3 過表達CDKN2A降低SiHa細胞的增殖能力 與pcDNA組相比，pc-CDKN2A組SiHa細胞存活率明顯降低(P<0.05)，而Control組SiHa細胞存活率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Western blot進一步檢測與增殖相關蛋白PCNA的表達，與pcDNA組相比，pc-CDKN2A組SiHa細胞中PCNA蛋白表達明顯下調(P<0.05)，而Control組PCNA的表達無明顯變化(P>0.05)。見圖3，表3。

圖3 Western blot檢測3組SiHa細胞中PCNA的表達

表3 3組SiHa細胞存活率和PCNA蛋白表達水平比較

2.4 過表達CDKN2A促進SiHa細胞的凋亡 AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色法檢測轉染48 h后3組SiHa細胞凋亡率。與pcDNA組相比，pc-CDKN2A組SiHa細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，而Control組細胞凋亡率無明顯改變(P>0.05)。Western blot檢測凋亡相關蛋白Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9表達水平。與pcDNA組相比，pc-CDKN2A組SiHa細胞中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表達均明顯上調(P<0.05)，而Control組Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表達均無明顯改變(P>0.05)。見圖4，表4。

表4 3組SiHa細胞凋亡率及Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表達水平比較

圖4 干擾CDKN2A對SiHa細胞凋亡的影響;A AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色法檢測3組SiHa細胞凋亡；B Western blot檢測3組SiHa細胞中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表達

2.5 過表達CDKN2A抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活 Western blot檢測SiHa細胞中Wnt/β-catenin信號通路關鍵蛋白β-catenin和下游關鍵分子c-myc表達情況，與pcDNA組相比，pc-CDKN2A組SiHa細胞中β-catenin和c-myc蛋白表達水平均明顯下調(P<0.05)，而Control組β-catenin和c-myc的表達水平均無明顯改變(P>0.05)。見圖5，表5。

圖5 Western blot檢測SiHa細胞中β-catenin和c-myc的表達

表5 3組SiHa細胞中β-catenin和c-myc蛋白表達水平比較

3 討論

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率較高，特別是在許多發(fā)展中國家[10]。中國國家癌癥中心早些時候公布的數(shù)據(jù)顯示，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率分別為10.4/105和2.59/105。隨著腫瘤治療手段不斷發(fā)展，其中基因治療取得較好的治療效果[11]。目前有研究證實，通過對宮頸癌患者實施基因治療能夠有效抑制宮頸癌細胞的生長[12]。CDKN2A是一個經(jīng)典的腫瘤抑制基因，可參與調控細胞周期進程來抑制細胞增殖和分裂。有研究顯示，CDKN2A在乳腺癌、胰腺癌等多種實體瘤中表達缺失，并且CDKN2A的突變與腫瘤患者臨床分期、病理類型及預后密切相關[13,14]。本研究中，通過Western blot檢測宮頸癌組織和相應癌旁組織中CDKN2A的表達，結果發(fā)現(xiàn)CDKN2A在宮頸癌組織中的表達明顯下調，提示CDKN2A在宮頸癌中發(fā)揮抑癌基因的作用。

有研究顯示，CDKN2A可調控乳腺癌MDA-MB-231細胞、鼻咽癌C666-1細胞的增殖[15,16]。Alsaran等[17]研究發(fā)現(xiàn)，鋅通過增強人乳腺癌MCF-7細胞中CDKN2A的表達誘導細胞凋亡。宮頸癌的發(fā)病是一種復雜的病理過程，其中宮頸癌細胞的增殖和凋亡起著重要作用。本實驗通過在人宮頸癌SiHa細胞中過表達CDKN2A以探究其對SiHa細胞增殖和凋亡的影響，并初步探索其作用機制。MTT和AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色法檢測結果發(fā)現(xiàn)，過表達CDKN2A能夠抑制SiHa細胞增殖并促進細胞凋亡。PCNA參與細胞中DNA的合成過程，存在與處于增殖及腫瘤細胞中，在宮頸癌、胃癌等惡性腫瘤中異常表達，目前公認其為腫瘤細胞處于增殖的標志分子之一[18]。Caspase-3和Caspase-9是Caspase家族重要成員，當細胞接受凋亡信號刺激激活凋亡啟動因子Caspase-9，進而引發(fā)線粒體凋亡途徑經(jīng)一系列級聯(lián)反應激活細胞凋亡執(zhí)行者Caspase-3，最終誘發(fā)細胞凋亡[19]。本實驗結果顯示，過表達CDKN2A可下調PCNA的表達，上調Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表達，提示CDKN2A可通過調控PCNA的表達及Caspase-3和Caspase-9的激活影響SiHa細胞增殖和凋亡。

Wnt/β-catenin信號傳導途徑是一系列由癌基因和抗癌基因編碼的蛋白質組成，并且特別涉及胚胎發(fā)育，細胞內轉運和細胞凋亡等過程。此外，Wnt/β-catenin信號通路的異常激活與各種類型癌癥的腫瘤發(fā)生、侵襲和轉移密切相關[20]。許多Wnt/β-catenin信號傳導途徑成員的上調與某些癌癥類型有關，先前已在多種癌癥中檢測到β-catenin的過度表達，例如宮頸癌、腸癌和卵巢癌[21-23]。在激活Wnt/β-catenin信號傳導過程中，β-catenin通過TCF/淋巴增強因子DNA結合蛋白與DNA相互作用，隨后激活下游靶基因的表達，編碼促進細胞增殖的c-Myc。本研究中，過表達CDKN2A可下調β-catenin和下游靶基因c-Myc的表達，表明過表達CDKN2A能夠抑制Wnt/β-catenin途徑的激活。提示過表達CDKN2A可能通過阻斷Wnt/β-catenin信號通路的激活抑制SiHa細胞增殖，誘導細胞凋亡。

綜上所述，CDKN2A在宮頸癌組織中呈低表達，過表達CDKN2A能夠抑制宮頸癌SiHa細胞增殖，并促進細胞凋亡，其作用機制可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路的活化有關。本實驗結果提示，CDKN2A有望成為宮頸癌靶向治療的一個新的靶點。