劉曉 李若瑜 宋營改

(北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科，北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心，北京市皮膚病分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家皮膚與免疫疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100034)

真菌感染是一個(gè)全球關(guān)注的人類健康問題。侵襲性真菌感染(invasive fungal infection, IFI)在重癥患者及免疫抑制人群中具有較高的發(fā)病率和病死率[1-3],以念珠菌感染最常見，可達(dá)53%[4]，其次為曲霉、毛霉及隱球菌[5]。侵襲性曲霉病及毛霉病臨床表現(xiàn)缺乏特異性，病原學(xué)診斷困難，往往術(shù)后或尸檢才能診斷，缺少精確的診斷方法。組織病理學(xué)是診斷侵襲性真菌感染的金標(biāo)準(zhǔn)之一。由于不同真菌在組織中的形態(tài)類似，僅通過HE染色、各種特殊染色方法觀察真菌形態(tài)特征來鑒定感染真菌的屬和種比較困難，尤其是難以區(qū)分曲霉、毛霉、鐮刀菌及賽多孢霉等絲狀真菌感染[6]。福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織中病原真菌的早期診斷并將致病菌種鑒定至種，對(duì)提高診斷水平、精準(zhǔn)治療及改善預(yù)后至關(guān)重要。分子病理診斷是準(zhǔn)確診斷病原真菌的重要檢測手段，現(xiàn)對(duì)侵襲性真菌感染分子病理診斷方法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 FFPE組織中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)及產(chǎn)物分析

PCR技術(shù)作為診斷FFPE組織中真菌感染的分子診斷方法之一，具有高效、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。

2017年ESCMID-ECMM-ERS[歐洲臨床微生物與感染性疾病學(xué)會(huì)(ESCMID)-歐洲醫(yī)學(xué)真菌學(xué)聯(lián)盟(ECMM)-歐洲呼吸學(xué)會(huì)(ERS)]指定的曲霉病診斷和治療指南[7]中指出：寬范圍(broad-range) PCR用于鑒別可見菌絲的新鮮組織或石蠟包埋組織中真菌的種、屬具有較高證據(jù)等級(jí)(AII級(jí))，而對(duì)于未見菌絲的活檢組織則屬于CII級(jí)。但FFPE組織PCR在DNA提取、引物的選擇、PCR平臺(tái)選擇方面仍缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。不同研究發(fā)現(xiàn)PCR診斷FFPE組織中真菌感染的陽性率15%～90%不等，但特異性較高。PCR陽性率高低的決定因素包括組織樣本的選擇、DNA的提取、DNA的污染、引物的選擇、PCR平臺(tái)的選擇等[8]。

1.1 組織樣本的選擇

①樣本的大?。篏omez等[9]利用ITS2區(qū)和D2區(qū)引物對(duì)FFPE組織和新鮮組織進(jìn)行PCR，發(fā)現(xiàn)手術(shù)切除標(biāo)本的診斷率(71.5%)高于芯針活檢(50.0%) 和細(xì)針抽吸活檢(0%)，結(jié)果顯示組織樣本的大小對(duì)于PCR的診斷率存在影響；②樣本含菌量的多少：Dadwal等[10,11]指出由于FFPE組織中真菌負(fù)荷量低或DNA片段化，可能造成敏感性降低(敏感性為57%，而特異性為100%)。

1.2 DNA的提取

由于FFPE組織中DNA降解以及DNA交聯(lián)的存在，DNA提取更為困難，使得FFPE組織PCR的陽性率明顯低于新鮮組織。目前DNA的提取多采用商業(yè)化的試劑盒，不同試劑盒提取DNA的效率有所差異，其中自動(dòng)提取試劑盒的效率最高。在不使用溶細(xì)胞酶情況下，MO BIO BiOstic FFPE Tissue DNA Isolation Kit可以分離出更高質(zhì)量的真菌DNA[12,13]。

1.3 DNA污染

DNA污染包括提取過程中其他真菌的污染以及宿主組織DNA的干擾。操作應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行以避免空氣中真菌的污染。對(duì)于組織DNA的干擾：更為優(yōu)化的方案是基于激光捕獲顯微切割技術(shù)(laser capture microdissection, LCM)提取DNA，將組織切片染色，精準(zhǔn)切割病原真菌。LCM是一種有價(jià)值的工具，可在小樣本組織中獲得大數(shù)據(jù)[14]，幫助研究人員從復(fù)雜的異質(zhì)生物樣品中對(duì)單個(gè)細(xì)胞或一組細(xì)胞進(jìn)行選擇性取樣。其UV-LCM的基本原理[15]是利用波長為337 nm的脈沖UVA激光，從乙烯乙酸乙烯酯膜上分離特定大小的細(xì)胞或組織區(qū)域，通過聚焦激光束的激光壓力彈射，將分離的細(xì)胞或組織區(qū)域轉(zhuǎn)移到放置在分離區(qū)域下方的離心管蓋中。LCM不僅在腫瘤、細(xì)菌及病毒感染的診斷中發(fā)揮重要作用，近年來也發(fā)現(xiàn)其在真菌感染中具備診斷潛力：趙作濤等[16]利用LCM成功鑒定了皮膚FFPE組織中的隱球菌感染；Schofield[17]成功捕獲鑒定小鼠舌組織中的白念珠菌感染；Zhou等[18]利用LCM-PCR技術(shù)成功鑒定1例人類肺FFPE組織單用PCR技術(shù)難以確診的長枝木霉病原菌感染；Olias等[15]利用LCM對(duì)鳥類肺組織中曲霉菌的感染進(jìn)行鑒定，證實(shí)基于LCM的分子鑒定具有普遍適用性；Wang等[19]利用LCM-PCR技術(shù)，診斷小鼠侵襲性肺曲霉病的靈敏度達(dá)到89%，特異度為100%，表明以LCM為基礎(chǔ)的PCR技術(shù)在準(zhǔn)確診斷侵襲性肺曲霉病方面有較大的潛力。由于在整個(gè)組織的分析中，含量較少的真菌DNA可能會(huì)被組織DNA稀釋、混淆，LCM成功克服這一缺點(diǎn)，為獲得不受周圍組織成分污染或污染程度極低的純特異性細(xì)胞提供可能。

1.4 引物的選擇

引物可以是泛真菌引物亦可為種、屬特異性引物；引物靶點(diǎn)多針對(duì)真菌的ITS1、ITS2區(qū)以及18S rRNA、5.8S rRNA、28S rRNA基因。由于真菌混合感染可能性的存在，選擇泛真菌PCR尤為重要。對(duì)于泛真菌引物而言，針對(duì)ITS1、ITS2區(qū)的序列使用率較高[20,21]。28S rDNA的D1/D2區(qū)、18S rDNA具有較高的屬鑒別能力[8,22-23]。由于FFPE組織中真菌DNA受到福爾馬林影響，PCR引物擴(kuò)增DNA片段長度以短于300 bp最為合適。

1.5 PCR平臺(tái)的選擇

目前PCR常用的平臺(tái)為傳統(tǒng)PCR、巢式PCR、實(shí)時(shí)定量PCR。巢式PCR及實(shí)時(shí)定量PCR具有更高的靈敏度，但選擇何種平臺(tái)目前尚無確定標(biāo)準(zhǔn)。選擇合適的引物及平臺(tái)可將診斷的靈敏度提高至79.3%～96%[24,25]。

1.6 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析

測序技術(shù)從第1代測序發(fā)展到第3代測序，而FFPE組織提取DNA行PCR擴(kuò)增后多進(jìn)行第1代測序。第1代測序技術(shù)具有操作快速、簡單的優(yōu)勢(shì)，對(duì)ITS區(qū)測序可鑒定大多數(shù)真菌菌種，目前被廣泛應(yīng)用于中、小片段DNA測序鑒定。第2代及第3代測序使得全基因組測序進(jìn)一步發(fā)展，具有通量高和讀長較長的優(yōu)勢(shì)，可大大降低測序成本，提高測序速度和效率。目前第3代測序技術(shù)尚未在FFPE組織DNA中應(yīng)用。

2 熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in Situ hybridization, FISH)

熒光原位雜交技術(shù)(FISH)作為一種基于組織學(xué)并進(jìn)行原位觀察的分子診斷技術(shù)，可避免實(shí)驗(yàn)人員暴露于危險(xiǎn)病原微生物，具有較好的應(yīng)用前景。其基本原理[26]是根據(jù)兩條同源單鏈核酸在合適的雜交條件下按堿基配對(duì)形成雙鏈的原理，利用熒光標(biāo)記探針檢測組織細(xì)胞內(nèi)特定的DNA或RNA序列。有多種因素可以影響原位雜交對(duì)目標(biāo)DNA或RNA序列的檢測，包括組織片段的預(yù)處理、雜交緩沖液中甲酰胺的濃度、沖洗液中NaCl的濃度、探針序列以及雜交的有效性。目前在熒光強(qiáng)度及探針選取方面仍存在一定限制。在高pH值的溶液中高溫加熱可有效增強(qiáng)探針結(jié)合強(qiáng)度(pH 9.5, 95℃)[27]。常用的探針包括RNA探針、dsDNA探針、寡核苷酸(DNA)探針、LNA(Locked nucleic acids)探針及PNA探針，LNA、PNA探針與DNA探針相比具有較強(qiáng)的熒光信號(hào)[28]。

國內(nèi)外已有較多關(guān)于原位雜交技術(shù)用于組織中病原真菌鑒定的文獻(xiàn)報(bào)道。FISH常用于念珠菌病的診斷，其對(duì)診斷酵母菌的靈敏度要高于絲狀真菌[29]。PNA-FISH可用于鑒別念珠菌及毛孢子菌[30]。但FISH在絲狀真菌的診斷方面研究較少，可以確定的是針對(duì)煙曲霉ALP基因的特異性dsDNA探針、鐮刀菌屬28S rRNA的PNA探針具有較高的診斷價(jià)值[31,32]。而毛霉因其D1-D2區(qū)的高度異質(zhì)性，故難以設(shè)計(jì)針對(duì)28S rRNA基因的毛霉目特異性探針[29]。針對(duì)28S rRNA基因、18S rRNA基因的泛真菌探針診斷靈敏度可達(dá)60%～80%[33-34]。表明針對(duì)rRNA靶點(diǎn)的FISH已成為診斷FFPE組織中真菌感染的有效手段。

3 小 結(jié)

侵襲性真菌感染的分子病理診斷技術(shù)在不斷成熟。目前的研究中值得肯定的是，PCR技術(shù)：對(duì)于組織病理可見真菌成分者，泛真菌PCR技術(shù)的價(jià)值肯定，已被寫入2017 ESCMID-ECMM-ERS侵襲性曲霉病診療指南中 (AII)；FISH技術(shù)：用于酵母菌的診斷比較穩(wěn)定，對(duì)于絲狀真菌，針對(duì)煙曲霉ALP基因的dsDNA探針和鐮刀菌屬的PNA探針具有一定的診斷價(jià)值。分子病理在侵襲性真菌感染的早期診斷方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，但由于PCR技術(shù)在各個(gè)層面尚缺乏標(biāo)準(zhǔn)化、存在假陽性的可能，以及FISH對(duì)于絲狀真菌特異性探針的缺乏，兩者目前尚未在臨床推廣應(yīng)用。因此需要進(jìn)一步優(yōu)化、篩選PCR引物和針對(duì)絲狀真菌的FISH特異性探針，建立一套標(biāo)準(zhǔn)化、具有穩(wěn)定的高靈敏度及特異度的分子病理診斷方法，高效、快速、準(zhǔn)確地將致病真菌鑒定到種水平，以便于臨床選擇敏感抗菌藥物，有效治療疾病，改善患者預(yù)后，降低死亡率。