張冠怡 姚冬婷 胡曉波

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院檢驗科，上海200030)

中國臨床感染性疾病調(diào)查研究顯示，在非白念珠菌中，光滑念珠菌(Candidaglabrata)成為第二大引起侵襲性真菌感染疾病的病原體[1]。在臨床治療中，光滑念珠菌對唑類藥物具有天然抗藥的特點，特別是對氟康唑具有迅速產(chǎn)生抗藥的趨勢[2]。近年來，隨著抗真菌藥物長期和廣泛使用，臨床治療中光滑念珠菌耐藥問題日趨嚴(yán)重，了解臨床菌株的耐藥情況和尋求新的治療途徑具有重要臨床意義。

中藥治療真菌感染具有不良反應(yīng)少、激發(fā)形成耐藥低和預(yù)后良好等優(yōu)點。眾多研究表明，中藥對念珠菌具有一定抑菌作用，如五倍子[3,4]。中西醫(yī)結(jié)合治療標(biāo)本兼顧，可以減少唑類藥物的不良反應(yīng)、提高患者的免疫力以及改善預(yù)后[5]。焦性沒食子酸(鄰苯三酚)是一種多酚類化合物，可在芡實、月季等中藥材中提取得到[6]。研究表明不同濃度的焦性沒食子酸對白念珠菌、金色葡萄球菌、大腸桿菌等均具有抑菌作用[7]。

本實驗研究目的在于了解臨床分離的光滑念珠菌的藥敏情況，便于更好的指導(dǎo)臨床用藥。運(yùn)用氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑三種唑類藥物聯(lián)合焦性沒食子酸作用于臨床分離的光滑念珠菌，觀察焦性沒食子酸聯(lián)合唑類藥物對光滑念珠菌的抑菌作用，以改善光滑念珠菌臨床耐藥以及預(yù)后情況。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株來源 從上海仁濟(jì)醫(yī)院、上海東方醫(yī)院和上海龍華醫(yī)院共收集光滑念珠菌116株，質(zhì)控菌株為ATCC90030，另從上海龍華醫(yī)院收集臨床白念珠菌49株、熱帶念珠菌42株、克柔念珠菌4株、近平滑念珠菌13株。所有菌株均由飛行質(zhì)譜儀(布魯克)鑒定到種。

藥物 唑類藥物氟康唑(fluconazole，F(xiàn)LC)、伊曲康唑(itraconazole,ITR)購于東方生物公司、伏立康唑(voriconazole，VRC)(匯德利康)購于龍華醫(yī)院、焦性沒食子酸(pyrogallic acid)購于上海友絲有限公司。

試劑 DMSO購于BIOSHARP生物公司、MOPS購于生工生物工程有限公司、RPMI1640培養(yǎng)基購于埃樂生物公司。

1.2 方法

藥物敏感性試驗 按照ATB FUNGUS3藥敏試條(法國梅里埃)說明操作，培養(yǎng)24 h和48 h，通過肉眼判讀觀察其生長情況，記錄菌株的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)值。根據(jù)2017年CLSI M60指南判斷光滑念珠菌對氟康唑的敏感性，MIC≤32 μg/mL為劑量依賴性敏感(susceptible does-dependent,SDD)，MIC≥64 μg/mL為耐藥(resistant,R)[8]，采用ECVs(epidemiologicalcutoff values)判斷伏立康唑和伊曲康唑的敏感性，分別為MIC<0.25 μg/mL和MIC<4 μg/mL為野生菌株(wild-type,WT)，MIC≥0.25 μg/mL和MIC≥4 μg/mL為非野生菌株(non wild-Type，non-WT)(Clinical and Laboratory Standards Institute [CLSI], 2018)。

藥劑配制 ①RPMI肉湯：稱取34.53 gMOPS、10.4 gRPMI粉劑,加入900 mL無菌蒸餾水，定容至1 L，過濾器過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆?。②焦性沒食子酸：100 mg焦性沒食子酸粉末加入1000 μL DMSO，取128 μL儲存液加入至50 mL RPMI肉湯中搖勻，倍比稀釋得到濃度為128 μg/mL、64 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL、8 μg/mL、4 μg/mL。③氟康唑配制：100 mg氟康唑粉末中加入20 mL無菌蒸餾水，取2048 μL的氟康唑儲存液和7952 μL的RPMI肉湯，混勻，倍比稀釋得到濃度為512 μg/mL、256 μg/mL、128 μg/mL、64 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL、8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL。④伊曲康唑配制：100 mg伊曲康唑粉末中加入2 mLDMSO加熱至完全溶解，取64 μL伊曲康唑儲備液加入50 mL無菌蒸餾水中加熱，倍比稀釋得到濃度為32 μg/mL、16 μg/mL、8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/mL、0.125 μg/mL、0.0625 μg/mL。⑤伏立康唑配制：100 mg伏立康唑用5 mL專用溶媒(乙醇、丙二醇各2.5 mL)溶解，后用生理鹽水稀釋至2000 μg/mL，50 mL試管中加入46.8 mL無菌蒸餾水和3.2 mL的儲備液，混勻，得到濃度為128 μg/mL的伏立康唑，倍比稀釋得到濃度為64 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL、8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/mL、0.125 μg/mL。

菌懸液的配制 配置0.5麥?zhǔn)隙鹊木鷳乙篬細(xì)胞濃度(1～5)×106CFU/mL]。取3個離心管，編號1～3，分別加入900 μL、900 μL的生理鹽水和9 mL的RPMI肉湯，取100 μL的0.5麥?zhǔn)隙鹊木鷳乙褐恋?個離心管中，得到1∶10稀釋菌懸液，從第1個管中取100 μL至第2個離心管，得到1∶100的稀釋菌懸液，將第2個離心管的1 mL菌懸液移入9 mL的RPMI肉湯中，得到1∶1000稀釋菌懸液[細(xì)胞濃度(1～5)×103CFU/mL]。

棋盤肉湯稀釋法 在96孔板的A～H行中依次加倍比稀釋的焦性沒食子酸和RPMI肉湯，1～12列中分別加入倍比稀釋的唑類藥物和RPMI肉湯，H12為生長對照孔。根據(jù)部分抑菌濃度指數(shù)(fractional inhibitory concentration index FICI)判斷相互作用，F(xiàn)ICI≤0.5協(xié)同作用、0.54拮抗作用，F(xiàn)ICI指數(shù)=聯(lián)合時甲藥的MIC/甲藥的MIC+聯(lián)合時乙藥的MIC/乙藥的MIC[13]。

統(tǒng)計學(xué)方法 通過SPSS 24.0軟件計算，運(yùn)用非參數(shù)秩和檢驗方法，P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 藥敏試驗結(jié)果

根據(jù)CLSI M60推薦的念珠菌屬參考范圍，臨床分離的116株光滑念珠菌對氟胞嘧啶和兩性霉素B均表現(xiàn)為敏感，對FLC的耐藥率為14.66%(17株)，22.41%(26株)菌株為ITR非野生型，81.03%(94株)菌株為VRC非野生型，同時表現(xiàn)FLC耐藥以及ITR和VRC均為非野生型的光滑念珠菌12.93%(15株)。

2.2 焦性沒食子酸單獨用藥時對5種念珠菌的抑菌效果

116株光滑念珠菌中，MIC50為32 μg/mL；49株白念珠菌中，MIC50為64 μg/mL；42株熱帶念珠菌中，MIC50為64 μg/mL；4株克柔念珠菌中，MIC50為32 μg/mL；13株近平滑念珠菌中，MIC50為64 μg/mL(見表1)。光滑念珠菌、熱帶念珠菌和白念珠菌三者之間的抑菌效果差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=43.692,P<0.05)。

表1 焦性沒食子酸單獨用藥時對5種念珠菌的抑菌效果

2.3 焦性沒食子酸單獨用藥時對光滑念珠菌的抑菌效果

116株光滑念珠菌分為3組，對三種唑類藥物均表現(xiàn)為敏感的為全敏感組(22株)，單一唑類耐藥的為單一耐藥組(66株)，對兩種以上的唑類藥物耐藥的為交叉耐藥組(28株)(見表2)。全敏感組與單一耐藥組之間以及全敏感組與交叉耐藥組之間具有統(tǒng)計學(xué)差異(Z=-2.706,P<0.05)，單一耐藥組與交叉耐藥組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(Z=-0.953,P>0.05)。

2.4 焦性沒食子酸聯(lián)合唑類藥物對念珠菌的抑菌效果

焦性沒食子酸與唑類藥物聯(lián)合用藥實驗中，檢測焦性沒食子酸聯(lián)合FLC和ITR藥物對9株白念珠菌、19株熱帶念珠菌、1株克柔念珠菌和3株近平滑念珠菌的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)FICI為1～8，抑菌

表2 焦性沒食子酸單獨用藥時對光滑念珠菌的抑菌效果

效果均表現(xiàn)為無關(guān)或拮抗作用。同時檢測了焦性沒食子酸聯(lián)合FLC、ITR和VRC對116株光滑念珠菌的抑菌情況，其中，聯(lián)合FLC時，對41.38%(48株)的光滑念珠菌具有協(xié)同作用，對58.62%(68株)的光滑念珠菌具有加強(qiáng)作用；聯(lián)合ITR時，對37.93%(44株)的光滑念珠菌具有協(xié)同作用，對61.21%(71株)的光滑念珠菌具有加強(qiáng)作用；聯(lián)合VRC時，對50%(58株)的光滑念珠菌具有協(xié)同作用，對49.71%(57株)的光滑念珠菌具有加強(qiáng)作用。焦性沒食子酸聯(lián)合ITR和VRC對光滑念珠菌的抑菌作用中分別有1例表現(xiàn)為無關(guān)作用(FICI=1.25)，其對ITR和VRC均表現(xiàn)為非野生型菌株。不同唑類藥物聯(lián)合焦性沒食子酸對光滑念珠菌的抑菌作用之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.505，P>0.05)。

焦性沒食子酸與FLC聯(lián)合用藥時，81.03%(94株)的光滑念珠菌降低的唑類MIC值為2～3個濃度梯度，最高降低6個濃度梯度。與ITR聯(lián)合用藥時，68.1%(79株)菌株的MIC值降低的濃度梯度為2～3個濃度梯度，降低最高為4個濃度梯度。與VRC聯(lián)合用藥時，77.59%(90株)的光滑念珠菌降低的唑類MIC值為2～3個濃度梯度，最高為5個濃度梯度(見表3)。聯(lián)合用藥時FLC劑量依賴性敏感菌株(SDD)和耐藥株(R)氟康唑MIC值降低的梯度，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-4.226,P<0.01)；ITR和VRC的WT和non-WT之間差異性也具有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-4.698,P<0.05;Z=-5.023,P<0.05)，表明聯(lián)合用藥時對耐藥菌株和非野生菌株的抑菌效果更好。

3 討 論

光滑念珠菌作為臨床侵襲性真菌感染的主要病原菌之一，其高死亡率和高耐藥率已發(fā)展成為1個全球的問題，在歐洲和北美地區(qū)，光滑念珠菌已成為第2常見的血液感染病原體[9]。其血流感染的死亡率占50%[10]，常在免疫低下的患者中檢出，且大部分為深部感染，對于導(dǎo)管插管的患者和長期使用抗生素的患者感染機(jī)會增加[11]。光滑念珠菌對臨床治療藥物的耐藥率也在逐年增加，唑類藥物作為臨床治療念珠菌感染的常用藥物，具有迅速獲得耐藥的特點，光滑念珠菌對兩性霉素B和氟胞嘧啶均具有較高的敏感性，但其長期使用具有一定的肝損傷和腎損傷，不建議使用[12]，所以唑類藥物仍然作為臨床治療念珠菌感染的首選藥物。

表3 焦性沒食子酸對唑類藥物MIC值的影響

本研究中，光滑念珠菌對唑類藥物出現(xiàn)不同程度的耐藥現(xiàn)象，特別是在伏立康唑的藥敏實驗中81.03%的菌株表現(xiàn)為非野生型菌株。這些非野生型菌株對氟康唑和伊曲康唑也具有一定的耐藥現(xiàn)象，其中有17株存在交叉耐藥的現(xiàn)象，15株耐氟康唑的菌株，對伏立康唑和伊曲康唑表現(xiàn)為非野生型。

中藥在治療念珠菌感染的方面具有一定的療效，與唑類聯(lián)合用藥協(xié)同作用增加療效，縮短療程，同時提高患者免疫力，改善復(fù)發(fā)的情況[13]。與焦性沒食子酸相比，沒食子酸來源和藥理活性較廣泛[14]，可通過破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜達(dá)到抑菌效果，但其藥物毒副作用尚不明確[15]，且在前期研究中發(fā)現(xiàn)沒食子酸對光滑念珠菌不具有抑菌作用。焦性沒食子酸可由沒食子酸脫羧得到，比后者少了一個羧基[16]。研究表明焦性沒食子酸在抗菌作用方面要強(qiáng)于沒食子酸[17],其羥基可以增加抗菌活性[18]。本研究發(fā)現(xiàn)焦性沒食子酸對光滑念珠菌的抑菌作用和熱帶念珠菌以及白念珠菌相比具有一定的差異性，對光滑念珠菌的抑菌效果更加顯著。進(jìn)一步統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，焦性沒食子酸對光滑念珠菌全敏感組與單一耐藥組以及全敏感組與交叉耐藥組的抑菌效果之間也具有一定的差異性，對全敏感組的抑菌效果更加顯著。

本研究中聯(lián)合用藥實驗結(jié)果顯示，焦性沒食子酸聯(lián)合唑類藥物對光滑念珠菌表現(xiàn)為協(xié)同和相加作用，對其他念珠菌菌株的作用均表現(xiàn)為無關(guān)或拮抗作用。三組唑類藥物與焦性沒食子酸聯(lián)合用藥對光滑念珠菌的抑菌作用之間無差異性。聯(lián)合用藥顯著降低了唑類藥物的MIC值，非敏感組唑類藥物MIC值的降低程度均高于敏感組，表明焦性沒食子酸聯(lián)合唑類藥物對非敏感組的抑菌效果更加顯著，可以有效的降低唑類藥物的MIC值，同時改善非敏感菌株的抑菌情況。

光滑念珠菌的耐藥機(jī)制包括生物膜的形成、藥物的外排作用、線粒體的功能性缺失等，其中藥物的外排作用成為光滑念珠菌耐藥的主要機(jī)制[19]。外排基因包括PDR1、CDR1、CDR2等，PDR1、CDR1、CDR2基因的表達(dá)上調(diào)使得細(xì)胞內(nèi)的藥物排出，細(xì)胞內(nèi)藥物濃度的降低從而形成了耐藥，焦性沒食子酸是否通過影響PDR1、CDR1、CDR2等基因來降低唑類藥物的耐藥性有待進(jìn)一步研究。Wang等[20]運(yùn)用從大黃當(dāng)中提取的巴馬汀聯(lián)合氟康唑和伊曲康唑?qū)饣钪榫M(jìn)行抑菌試驗，其抑菌機(jī)制是CDR1、CDR2等相關(guān)外排基因的表達(dá)下調(diào)，從而使得聯(lián)合用藥達(dá)到其抑菌效果。Moraes等[21]從毛刺鉤藤中提取出不溶性部分與氟康唑聯(lián)合用藥進(jìn)行光滑念珠菌體外抑菌試驗，發(fā)現(xiàn)兩者之間具有協(xié)同作用，其抑菌機(jī)制為聯(lián)合藥物破壞了光滑念珠菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到抑菌作用。

綜上所述，光滑念珠菌對唑類藥物具有較高的耐藥率，焦性沒食子酸聯(lián)合唑類藥物可有效地抑制光滑念珠菌的生長，并且非敏感組比敏感組的效果更加顯著，對其他4種念珠菌，聯(lián)合用藥時表現(xiàn)為無關(guān)作用和拮抗作用，焦性沒食子酸聯(lián)合唑類藥物可作為臨床治療光滑念珠菌感染的新途徑。