張彩霞 張玉欣 接琳琳

（1.山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，山東 煙臺(tái) 204199；2.莒縣中醫(yī)醫(yī)院，山東 日照 276500）

大量研究表明，60歲以后隨著年齡的增長(zhǎng)人的認(rèn)知記憶能力逐漸衰退，主要表現(xiàn)為老年人進(jìn)行性記憶功能、認(rèn)知功能和行為功能等障礙，這都是老齡化的表現(xiàn)。而認(rèn)知記憶能力衰退又進(jìn)一步影響到老年人生活質(zhì)量與活動(dòng)能力[1]。目前，改善老年人認(rèn)知能力衰退多用中藥方劑調(diào)理，如補(bǔ)腎益智方、健腦益智湯、補(bǔ)陽(yáng)還五湯等，通過(guò)保護(hù)海馬神經(jīng)元，而達(dá)到緩解的作用[2]。臨床研究表明，補(bǔ)腎益智方可通過(guò)改善小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)，從而改善阿爾茨海默病模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[5]，進(jìn)而緩解老年遺忘型輕度認(rèn)知功能障礙[3]。因此，本研究探討應(yīng)用補(bǔ)腎益智方對(duì)治療老年型記憶衰退的作用，為防治老年人記憶衰退開辟一條新途徑。

一、材料與方法

1.動(dòng)物與分組

快速老化模型SAMP8小鼠 24只，3月齡，雄性，體質(zhì)量為20～25 g。購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司，動(dòng)物許可證號(hào) SCXK（京）2019-0008。飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心 SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)小鼠可自由飲水，通風(fēng)良好，自然光照，室溫 （22±2）℃，明暗交替。適應(yīng)性喂養(yǎng)2周。

將 SAMP8小鼠隨機(jī)分為 3組，分別為模型組、補(bǔ)腎益智方中藥低劑量組和補(bǔ)腎益智方中藥高劑量組。模型組小鼠按體重給予生理鹽水灌胃，低劑量中藥組給予補(bǔ)腎益智方藥液2.68 g/（kg·d）進(jìn)行灌胃，高劑量中藥組給予補(bǔ)腎益智方藥液5.36 g/（kg·d）進(jìn)行灌胃，連續(xù)灌胃6周。

2.儀器與試劑

Morris水迷宮測(cè)試軟件和設(shè)備購(gòu)于廣州飛迪生物科技有限公司。蘇木精-伊紅（haematoxylin-eosin，HE）染色液購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司。

3.方法

3.1 補(bǔ)腎益智方的制備 補(bǔ)腎益智方組成：熟地黃15 g、枸杞子20 g、山茱萸12g、鹽益智仁6g、丹參15 g、當(dāng)歸10g、生白術(shù)10g、郁金10g、石菖蒲10 g、川芎10 g、人參12 g、遠(yuǎn)志6 g，以上藥物經(jīng)山東天江藥業(yè)制成免煎顆粒。補(bǔ)腎益智方劑量設(shè)定是根據(jù)成人的臨床給藥劑量 1.34 g/kg·d的2 倍、4倍確立，低劑量補(bǔ)腎益智方藥液終濃度為2.68 g/（kg·d）進(jìn)行灌胃，高劑量補(bǔ)腎益智方藥液終濃度為5.36 g/（kg·d）。藥液配制完成后放置于 4℃冰箱冷藏備用，用前37℃溫水浴后搖勻。

3.2 Morris 水迷宮測(cè)試試驗(yàn) 灌胃 42 d 后SAMP8小鼠可進(jìn)行水迷宮適應(yīng)訓(xùn)練。首先訓(xùn)練小鼠站臺(tái)，將SAMP8小鼠置于平臺(tái)上 1 min后，進(jìn)行入水訓(xùn)練，小鼠由不同象限入水，1 min/次。每只SAMP8小鼠參與訓(xùn)練 2 次。若小鼠在規(guī)定時(shí)間內(nèi)找不到站臺(tái)，人為引導(dǎo)到站臺(tái)，且停滯1 min。小鼠定位航行實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行 5 d，將平臺(tái)轉(zhuǎn)移至第三象限中心，分別于上、下午各進(jìn)行試驗(yàn)1 次，試驗(yàn)時(shí)間為1 min/次。調(diào)整第一象限的池壁中點(diǎn)作為入新的水點(diǎn)，上午和下午均以相同順序入水進(jìn)行。若小鼠在60s內(nèi)未能找到平臺(tái)，人為將小鼠引導(dǎo)至平臺(tái)，且在平臺(tái)停滯 1 min，再將小鼠放回籠內(nèi)。以小鼠入水后的逃避潛伏期設(shè)為觀測(cè)指標(biāo)，若小鼠在1min 內(nèi)不能找到平臺(tái)，記錄為60s。定位航行試驗(yàn)結(jié)束后，次日上午撤除平臺(tái)，進(jìn)行小鼠空間探索試驗(yàn)。在第一象限入水，記錄游泳軌跡，測(cè)量小鼠逃避潛伏期數(shù)據(jù)收集并進(jìn)行比較分析。

3.3 動(dòng)物取材及 HE染色 SAMP8小鼠 Morris 水迷宮試驗(yàn)完成后，模型組、補(bǔ)腎益智方高劑量組和補(bǔ)腎益智方低劑量組小鼠，烏拉坦麻醉后，4%多聚甲醛灌流固定，剝離小鼠大腦，將大腦置于預(yù)冷的4%多聚甲醛溶液，4℃固定過(guò)夜，脫水、透明、全腦修塊、浸蠟、包埋，常規(guī)制作石蠟切片，進(jìn)行HE染色，攝片。

4.數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件，按獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

1.補(bǔ)腎益智方對(duì) SAMP8模型小鼠 Morris 水迷宮逃避潛伏期的影響

在Morris 水迷宮定位航行試驗(yàn)中，隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加SAMP8模型小鼠的逃避潛伏期均呈下降趨勢(shì)（表1）。與模型組相比，補(bǔ)腎益智方組逃避潛伏期均明顯縮短。而高劑量組逃避潛伏期比低劑量組逃避潛伏期明顯縮短。

表1 各組小鼠定位航行實(shí)驗(yàn)潛伏期用時(shí)比較（±s）

表1 各組小鼠定位航行實(shí)驗(yàn)潛伏期用時(shí)比較（±s）

注：與模型組比較，△P＜0.05。

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2.補(bǔ)腎益智方對(duì)SAMP8模型小鼠腦組織病理形態(tài)的影響

模型組小鼠的海馬神經(jīng)元排列紊亂、疏松，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰。神經(jīng)元數(shù)目減少，體積縮小，細(xì)胞核固縮呈不規(guī)則形。與模型組相比，補(bǔ)腎益智方組神經(jīng)元排列緊密、整齊，輪廓相對(duì)清晰，未見核固縮等病理?yè)p傷。

三、討論

我國(guó)是世界上老年人口最多的國(guó)家，而且也是人口老齡化發(fā)展速度最快的國(guó)家之一[5]。隨著人口老齡化問題的日益加重，人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注于如何延緩衰老過(guò)程中記憶認(rèn)知功能下降，促進(jìn)記憶認(rèn)知能力的發(fā)展，維持終生的腦健康。人類的老齡化過(guò)程會(huì)伴隨大腦的結(jié)構(gòu)和功能變化，從而導(dǎo)致老年人的反應(yīng)遲緩、工作和情節(jié)記憶以及執(zhí)行能力等記憶認(rèn)知能力下降，而老年人的記憶認(rèn)知損害又進(jìn)一步影響到老年人日常生活質(zhì)量與活動(dòng)能力。目前，改善老年人記憶衰退多用中藥方劑調(diào)理，如補(bǔ)腎益智方、健腦益智湯、補(bǔ)陽(yáng)還五湯等，通過(guò)保護(hù)海馬神經(jīng)元，而達(dá)到緩解的作用。

補(bǔ)腎益智方是針對(duì)阿爾茨海默病腎精不足、氣血虧虛的病理而設(shè)計(jì)的組方，具有補(bǔ)腎填精、益髓健腦、益氣養(yǎng)血活血的功效[6]。研究表明補(bǔ)腎益智方能夠降低阿爾茨海默癥大鼠腦內(nèi)谷氨酸（Gu）和天冬氨酸（Asp）的含量，導(dǎo)致抑制性γ氨基丁酸（Y-GABA）和氨基酸甘氨酸（Gly）的含量升高，從而有預(yù)防及緩解阿爾茨海默病癥狀的功效[7]。實(shí)驗(yàn)室水迷宮試驗(yàn)也表明，補(bǔ)腎益智方能夠顯著提高大鼠學(xué)習(xí)記憶能力[8]。本研究利用快速老齡化SAMP8小鼠為模型，補(bǔ)腎益智方連續(xù)灌胃6周后，在 Morris 水迷宮試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)模型組SAMP8小鼠有學(xué)習(xí)記憶功能受損的現(xiàn)象，而補(bǔ)腎益智方組小鼠的空間記憶學(xué)習(xí)功能有提高現(xiàn)象。表明補(bǔ)腎益智方能顯著提高SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，且補(bǔ)腎益智方高劑量效果優(yōu)于低劑量。通過(guò)HE染色觀察，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎益智方組能夠減輕SAMP8小鼠腦組織病理變化，有良好的保護(hù)神經(jīng)元的作用。這可能與抗細(xì)胞凋亡機(jī)制有關(guān)。

綜上所述，本研究提示補(bǔ)腎益智方能改善老齡化引起的空間學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知障礙，表現(xiàn)為SAMP8模型小鼠行為學(xué)能力的提高及腦病理學(xué)變化，這可能與補(bǔ)腎益智方能夠調(diào)控神經(jīng)元凋亡機(jī)制密切相關(guān)。但是中藥方劑具有靶點(diǎn)多、途徑多的特點(diǎn)，中藥方劑對(duì)神經(jīng)元藥物的相關(guān)機(jī)制還有不明確，有待于進(jìn)一步深入研究。