張凡凡 張玉琳 王旭哲 賈舒安,2 馬春暉*

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子832000；2.新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，烏魯木齊830011)

青貯玉米是世界范圍內(nèi)最為重要的反芻家畜飼料原料之一，而其發(fā)酵過(guò)程受制影響因素諸多，如何控制發(fā)酵體系厭氧條件、含水量、能氮平衡、產(chǎn)酸能力等，以達(dá)到提質(zhì)降耗的目的是青貯加工研究的重點(diǎn)問(wèn)題[1]。一直以來(lái)，添加微生物制劑是國(guó)內(nèi)外學(xué)者改善青貯品質(zhì)的主要手段[2-4]。乳酸菌制劑常被應(yīng)用于各類青貯飼料中，其作為一種發(fā)酵促進(jìn)劑，主要作用是調(diào)節(jié)青貯原料微生物區(qū)系，以確保青貯營(yíng)養(yǎng)成分的保存；同時(shí)促進(jìn)多糖和纖維的轉(zhuǎn)化，提高青貯的消化率及適口性[1]。根據(jù)乳酸菌代謝產(chǎn)物的不同將其分為同質(zhì)型和異質(zhì)型乳酸菌[2-3]。其中，接種乳酸桿菌(Lactobacillusspp.)或片球菌(Pediococcusspp.)等的同質(zhì)型乳酸菌可利用葡萄糖產(chǎn)生乳酸，確保發(fā)酵體系前期快速達(dá)到酸性環(huán)境，以減少蛋白質(zhì)的降解和乙醇的生成；同時(shí)可顯著提高干物質(zhì)回收率和剩余可溶性碳水化合物含量，進(jìn)而改善青貯品質(zhì)[4]。然而同質(zhì)型乳酸菌產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸(乙酸、丙酸)含量極少，不能有效抑制青貯中致腐真菌等的生長(zhǎng)，不僅增加了干物質(zhì)的損失，且造成青貯的二次發(fā)酵，降低有氧穩(wěn)定性(aerobic stability，AS)，并對(duì)家畜健康造成潛在威脅[5-7]。類如布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)或腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)等的異質(zhì)型乳酸菌雖消耗青貯底物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較多，且乳酸轉(zhuǎn)化效率低，但其利用葡萄糖和乳酸源產(chǎn)生的乙酸能夠有效抑制霉菌的生長(zhǎng)，且可通過(guò)提高青貯的有氧穩(wěn)定性以彌補(bǔ)潛在的營(yíng)養(yǎng)損失[6-8]。因此，諸多研究采用同質(zhì)型、異質(zhì)型乳酸菌聯(lián)合接種以改善青貯品質(zhì)[2-3]；但即便聯(lián)合接種，異質(zhì)型乳酸菌在發(fā)酵體系中仍占據(jù)主要地位；眾多研究也證實(shí)了采用同質(zhì)型乳酸菌∶異質(zhì)型乳酸菌=1∶4的比例進(jìn)行聯(lián)合接種效果更優(yōu)[2]。隨著目前飼料業(yè)的飛速發(fā)展，單純?nèi)樗峋苿┮廊徊荒軡M足現(xiàn)有行業(yè)的需求，因此諸多學(xué)者將乳酸菌制劑與纖維素酶、半纖維素酶等酶制劑進(jìn)行配合使用，其主要目的是通過(guò)纖維類物質(zhì)向單糖的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)乳酸菌發(fā)酵，提高飼料利用率及動(dòng)物生產(chǎn)性能[9-10]。那么，利用某些纖維素分解菌(cellulose decomposing bacteria，CDB)產(chǎn)酶特性是否能達(dá)到相同的目的？黑曲霉(Aspergillusniger)、綠色木霉(Trichodermaviride)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)作為美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)和我國(guó)農(nóng)業(yè)部認(rèn)證的安全菌，均能產(chǎn)生高活性的纖維素酶、酸性蛋白酶、果膠酶等多種胞外酶，適合飼用復(fù)合酶的固體生產(chǎn)[11]。這3種產(chǎn)酶菌均為好氧菌，理論上在青貯發(fā)酵早期大量繁殖，產(chǎn)生大量分解底物的酶類物質(zhì)，迅速消耗原料中的氧氣，使青貯飼料進(jìn)入無(wú)氧狀態(tài)，其活動(dòng)還可以提高青貯體系溫度，從而抑制其他好氧腐敗菌的生長(zhǎng)繁殖。此外，某些纖維素分解菌對(duì)青貯品質(zhì)和奶牛消化率的提升作用也均已得到證實(shí)[12-13]。而這些產(chǎn)酶細(xì)菌與異質(zhì)性乳酸菌的協(xié)同效果如何？是否能夠改善青貯品質(zhì)？目前尚未明確。鑒于此，本研究擬將Aspergillusniger、Trichodermaviride、Bacillussubtilis與Lactobacillusbuchneri聯(lián)合接種發(fā)酵青貯玉米，通過(guò)對(duì)青貯玉米發(fā)酵品質(zhì)、微生物含量、有氧穩(wěn)定性、瘤胃降解率等的詳細(xì)分析，明確二者之間協(xié)同作用對(duì)青貯發(fā)酵的影響，為我國(guó)今后新型青貯菌劑的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

青貯玉米試驗(yàn)地位于新疆石河子大學(xué)牧草試驗(yàn)站(N44°20′，E88°30′，海拔420 m)，當(dāng)?shù)貫榈湫偷拇箨懶愿珊禋夂?，年日照時(shí)間2 721～2 818 h，年降水量180～270 mm，年蒸發(fā)量1 000～1 500 mm，年平均溫度7.5～8.2 ℃，無(wú)霜期147～191 d。耕作土層(0～30 cm)有機(jī)質(zhì)含量16.7 g/kg，堿解氮含量17.3 g/kg，速效磷含量0.64 g/kg，pH為6.44。青貯玉米種植時(shí)間為2017年4月10日至2017年8月20日(生長(zhǎng)期為112 d)，玉米種植為穴播，密度按照寬窄行處理(60 cm+40 cm)，種植面積為1 050 m2，灌水方式采用滴灌，按照一般青貯玉米種植管理模式進(jìn)行管理。在青貯玉米進(jìn)入乳熟末期蠟熟初期(玉米乳線超過(guò)2/3)時(shí)進(jìn)行全株刈割，當(dāng)場(chǎng)粉碎至2 cm左右長(zhǎng)度，待貯。

BacillussubtilisACCC19374、AspergillusnigerACCC 30134和TrichodermavirideACCC 30595，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC)，LactobacillusbuchneriCICC 20293購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

全株玉米粉碎后立刻采用真空袋法調(diào)制青貯(同時(shí)留取發(fā)酵初始樣品進(jìn)行各指標(biāo)分析)。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理，CK處理(對(duì)照處理)不添加任何菌種；Y處理添加4.7×105CFU/gLactobacillusbuchneri；YX處理添加4.7×105CFU/gLactobacillusbuchneri和纖維素分解菌，纖維素分解菌添加比例為Aspergillusniger∶Trichodermaviride∶Bacillussubtilis=2∶1∶1(質(zhì)量比)，添加量為0.3%，添加比例和添加量均已在實(shí)驗(yàn)室理論情況下進(jìn)行初步驗(yàn)證[11]。將各菌種分別在MRS(培養(yǎng)Lactobacillusbuchneri)、NB(培養(yǎng)Bacillussubtilis)、PDA(培養(yǎng)Aspergillusniger、Trichodermaviride)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，平板計(jì)數(shù)后確定其數(shù)量，按比例配制菌液，以鮮重為基礎(chǔ)進(jìn)行添加。各處理分別混合均勻后稱取約2.0 kg樣品于聚乙烯厭氧袋中真空密封(真空袋規(guī)格40 cm×50 cm)，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境(23～30 ℃)下發(fā)酵60 d，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，共計(jì)調(diào)制18袋。第60天時(shí)全部模擬開(kāi)窖(厭氧袋開(kāi)袋)，測(cè)定相關(guān)指標(biāo)(測(cè)定3個(gè)重復(fù))。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

發(fā)酵特性主要測(cè)定pH、可溶性碳水化合物(WSC)、有機(jī)酸(乳酸、乙酸、丙酸、丁酸)和氨態(tài)氮(NH3-N)含量。其中，pH用酸度計(jì)(PHSJ3F酸度計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)測(cè)定，WSC含量采用蒽酮比色法(722可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司)測(cè)定，有機(jī)酸含量采用液相色譜法(Agilent 1260高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技公司)測(cè)定，氨態(tài)氮(NH3-N)含量采用苯酚-次氯酸比色法[14-15]測(cè)定。

營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)指標(biāo)主要測(cè)定干物質(zhì)(DM)、粗蛋白質(zhì)(CP)、粗脂肪(EE)、粗灰分(Ash)、淀粉(Starch)、中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量。其中，DM含量采用烘干法(精密型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海合恒儀器設(shè)備有限公司)測(cè)定，CP含量采用凱氏定氮法(Kjeltec 8400 FOSS全自動(dòng)凱氏定氮儀，美國(guó)福斯公司)測(cè)定，EE含量參照索氏浸提法(玻璃索氏提取器)測(cè)定，Ash含量參照采用灰化法(XL-3000型高效節(jié)能智能一體馬弗爐，上海合恒儀器設(shè)備有限公司)測(cè)定[15]，Starch含量參照酶水解法測(cè)定[16]，NDF和ADF含量采用ANKOM A200i全自動(dòng)纖維分析儀(美國(guó)安康公司)測(cè)定。

微生物主要測(cè)定乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)、酵母菌、好氧細(xì)菌(aerobic bacteria，AB)和霉菌數(shù)量。好氧細(xì)菌、乳酸菌、酵母菌、霉菌分別采用MRS培養(yǎng)基、麥芽糖浸粉瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和高鹽察氏培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)(培養(yǎng)基均采購(gòu)自北京路橋集團(tuán)有限公司)，培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，并計(jì)算微生物數(shù)量[17]。

有氧穩(wěn)定性主要測(cè)定樣品60 d開(kāi)袋后的溫度變化(設(shè)定每5 min間隔記錄1次)，將多點(diǎn)式溫度記錄儀(i500-E3TW，玉環(huán)智拓儀器科技有限公司)的多個(gè)探頭分別放置于發(fā)酵袋中心，每個(gè)處理放置3個(gè)溫度探頭，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)室中放置3個(gè)探頭測(cè)定環(huán)境溫度。當(dāng)樣品溫度高于環(huán)境溫度2 ℃時(shí)記錄時(shí)間即為有氧穩(wěn)定性時(shí)間[5]。二氧化碳(CO2)濃度測(cè)定按文獻(xiàn)描述[5,7,18]，自制CO2產(chǎn)氣裝置。所有產(chǎn)氣裝置置于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行測(cè)定。

選用3只體況良好、體重(50.0±2.00) kg、安裝永久性瘤胃瘺管的哈薩克羊。試驗(yàn)飼糧由200 g精料(精料組成：玉米51.0%、麩皮24.0%、豆粕18.0%、碳酸氫鈣2.5%、添加劑2.0%、尿素1.5%、食鹽1.0%，天康畜牧生物技術(shù)公司提供)和1.8 kg青貯玉米組成，于晨飼前(08:00)進(jìn)行投放，全天自由飲水。參照瘤胃瘺管尼龍袋法[19]測(cè)定青貯玉米在瘤胃中12、24、36、48、72 h的DM、NDF、ADF、有機(jī)物(OM)含量，將前期測(cè)定營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)指標(biāo)的烘干樣品復(fù)烘(65 ℃)至恒定過(guò)篩(40目)，裝在尼龍袋中，尼龍袋尺寸為6 cm×9 cm，孔徑40～50 μm，每袋準(zhǔn)確填裝3 g樣品，填裝后用尼龍線扎口綁在鐵鏈上投放至瘤胃中，每個(gè)樣品每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每頭羊設(shè)置4個(gè)重復(fù)，共計(jì)180袋，分2次進(jìn)行投放，各處理樣品隨機(jī)放置于3只羊瘤胃中，每次每只羊30個(gè)。到相應(yīng)時(shí)間后將尼龍袋取出沖洗干凈，在65 ℃烘箱中烘干48 h，測(cè)定各營(yíng)養(yǎng)成分含量。瘤胃降解率和降解特征參數(shù)計(jì)算方法如下[20-21]：

Dx=[(MA-MB)/MA]×100；
Dp=a+b(1-e-ct)×100；
ED=a+[(b×c)/(k+c)]×100。

式中：Dx為待測(cè)樣品某成分的瘤胃降解率(%)；MA為待測(cè)樣品消化前某成分含量(g)；MB為待測(cè)樣品消化后某成分含量(g)；Dp為t時(shí)刻被測(cè)樣品中某成分的實(shí)時(shí)瘤胃降解效率(%)；t為飼料在瘤胃內(nèi)停留的時(shí)間(h)；a為快速降解部分(%)；b為慢速降解部分(%)；c為慢速降解部分的降解速率(%/h)；ED為某成分在瘤胃內(nèi)的有效降解率(%)；k為被測(cè)樣品中某成分瘤胃外流速率常數(shù)(%/h)，取1.8%/h。采用Matlab軟件進(jìn)行偏最小二乘計(jì)算，求得各相關(guān)參數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2016軟件整理，采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行F檢驗(yàn)，F(xiàn)檢驗(yàn)之后進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，多重比較采用Duncan氏法。采用Origin 2017軟件進(jìn)行繪圖。采用模糊相似優(yōu)先比法評(píng)價(jià)最優(yōu)處理[22]，運(yùn)用DPS V7.05軟件將樣品10項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行分析計(jì)算(由于本研究各處理對(duì)某些重要指標(biāo)無(wú)顯著影響，因此僅選擇存在顯著差異的指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià))，對(duì)其設(shè)定識(shí)別標(biāo)識(shí)為1；固定樣本即為參考品種(各指標(biāo)為理論最優(yōu))，對(duì)其設(shè)定識(shí)別標(biāo)識(shí)為0，執(zhí)行“模糊相似優(yōu)先比分析”功能，計(jì)算結(jié)果中待測(cè)樣與參考品種的相似程度大小即反映牧草品質(zhì)的優(yōu)劣。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)青貯玉米發(fā)酵品質(zhì)及微生物數(shù)量的影響

由表1可知，各處理pH、WSC、DM、淀粉、NDF、ADF含量及4類主要微生物(好氧細(xì)菌、乳酸菌、酵母菌、霉菌)數(shù)量均較初始發(fā)酵時(shí)明顯下降，乳酸、乙酸、NH3-N、EE含量較初始發(fā)酵時(shí)明顯上升，CP和Ash含量變化不明顯。其中，Y處理pH顯著低于CK和YX處理(P<0.05)，CK處理WSC含量顯著高于Y和YX處理(P<0.05)，YX處理乳酸含量顯著高于CK和Y處理(P<0.05)，YX處理乙酸含量顯著高于CK處理(P<0.05)，各處理丙酸和丁酸含量均未檢測(cè)出，Y處理DM含量顯著高于CK處理(P<0.05)，YX處理NDF含量顯著低于CK和Y處理(P<0.05)，YX處理EE含量顯著高于CK和Y處理(P<0.05)。各處理間NH3-N、淀粉、CP、ADF、Ash含量及4類主要微生物數(shù)量差異均不顯著(P>0.05)。

2.2 不同處理對(duì)青貯玉米開(kāi)袋第5天時(shí)有氧穩(wěn)定性及微生物數(shù)量的影響

由表2可知，青貯玉米開(kāi)袋第5天時(shí)，YX處理pH和霉菌數(shù)量均顯著高于Y和CK處理(P<0.05)，CK處理CO2濃度顯著高于Y和YX處理(P<0.05)，YX和Y處理有氧穩(wěn)定性顯著高于CK處理(P<0.05)。各處理間好氧細(xì)菌、乳酸菌、酵母菌數(shù)量差異均不顯著(P>0.05)。

表2 不同處理對(duì)青貯玉米開(kāi)袋第5天時(shí)有氧穩(wěn)定性及微生物數(shù)量的影響

2.4 不同處理對(duì)青貯玉米瘤胃營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)降解率及降解參數(shù)的影響

由圖1可知，隨瘤胃停留時(shí)間的延長(zhǎng)，各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在瘤胃中的降解率呈上升趨勢(shì)。其中，DM降解率僅在48 h時(shí)，CK處理顯著高于Y處理(P<0.05)；NDF降解率僅在36 h時(shí)，Y處理顯著高于CK處理(P<0.05)；OM降解率僅在72 h時(shí)，CK和Y處理顯著高于YX處理(P<0.05)。

數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

由表3可知，DM降解參數(shù)中，Y處理的DM基礎(chǔ)含量顯著高于CK處理(P<0.05)，CK處理的DM有效降解率顯著高于YX處理(P<0.05)。NDF降解參數(shù)中，YX處理的NDF基礎(chǔ)含量顯著低于Y和CK處理(P<0.001)，YX處理的NDF慢速降解部分的降解速率顯著高于Y處理(P<0.05)。各處理間其余各指標(biāo)降解參數(shù)差異均不顯著(P>0.05)。

表3 不同處理對(duì)青貯玉米瘤胃降解參數(shù)的影響

2.5 不同處理復(fù)合發(fā)酵青貯玉米綜合價(jià)值評(píng)價(jià)

采用模糊相似優(yōu)先比分析，10個(gè)指標(biāo)權(quán)重選取均設(shè)定見(jiàn)表4，求得不同處理與參考樣本(表4)間各指標(biāo)的相似序號(hào)之和，相似度越小，該處理與參考理想樣本的綜合價(jià)值越接近，綜合價(jià)值越好，結(jié)果表明(表5)，YX處理(1.80)>Y處理(1.95)>CK處理(2.25)。

表4 參考品種綜合品質(zhì)及其權(quán)重

表5 各處理與參考品種相似程度及綜合價(jià)值排序

3 討 論

3.1 纖維素分解菌與Lactobacillus buchneri復(fù)合發(fā)酵對(duì)青貯玉米發(fā)酵品質(zhì)及微生物數(shù)量的影響

青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)是由多個(gè)指標(biāo)所共同決定的。飼料pH的增加是檢驗(yàn)青貯飼料是否變質(zhì)的直觀參數(shù)[23]，NH3-N和有機(jī)酸含量則反映青貯飼料中蛋白質(zhì)和碳水化合物轉(zhuǎn)化情況。其中，青貯過(guò)程中多種微生物對(duì)底物蛋白物質(zhì)的大量消耗，轉(zhuǎn)化成NH3-N和胺類物質(zhì)；且pH在3～7時(shí)，隨著pH的增大，蛋白質(zhì)水解作用增強(qiáng)[1]，本研究雖各處理pH存在差異，但均未顯著影響蛋白質(zhì)的腐敗，即各處理間CP、NH3-N含量差異不顯著，而各處理NH3-N含量較發(fā)酵前有所升高，其原因可能由于梭菌未被完全抑制，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分解所致[4]；此外，由于發(fā)酵結(jié)束時(shí)未檢測(cè)到丙酸與丁酸，更有可能的原因則是由于纖維素分解菌中Aspergillusniger提高了NH3-N含量[24]，具體原因還有待進(jìn)一步探索。以往研究在青貯玉米中單獨(dú)添加Lactobacillusbuchneri或與纖維素酶聯(lián)合接種均可降低青貯pH，提高乳酸、乙酸含量[8-10,25]。本研究Lactobacillusbuchneri與纖維素分解菌聯(lián)合接種時(shí)，乳酸和乙酸含量均最高，說(shuō)明纖維素分解菌的接種并未抑制青貯中乳酸菌的產(chǎn)酸能力，這與前期培養(yǎng)基中理論情況結(jié)論相同[11]；而聯(lián)合接種使得發(fā)酵體系整體pH變高，且開(kāi)袋第5天時(shí)也表現(xiàn)相同結(jié)果，這說(shuō)明接種纖維素分解菌可能降低了青貯抵御外來(lái)好氧微生物的能力，進(jìn)而使得pH有略微升高；另一種可能是由于聯(lián)合接種產(chǎn)生了競(jìng)爭(zhēng)性抑制，進(jìn)而一定程度上促進(jìn)了同質(zhì)性乳酸菌利用底物產(chǎn)乳酸的能力，具體原因還有待繼續(xù)探索。但總體聯(lián)合接種Lactobacillusbuchneri與纖維素分解菌有利于發(fā)酵體系產(chǎn)酸，維持較為適中的酸度。

以往研究表明，纖維素酶和乳酸菌制劑聯(lián)合接種使用可有效減少青貯玉米NDF和ADF含量[9-10,26]。也有研究將纖維素酶、果膠酶與Lactobacillusbuchneri聯(lián)合接種玉米秸稈后發(fā)現(xiàn)，NDF、ADF、纖維素及半纖維素含量顯著降低，玉米秸稈營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)得到改善[27]。本研究得到相同結(jié)果，其原因主要由于纖維素分解菌產(chǎn)胞外酶作用所致，這一結(jié)果證明了纖維素分解菌和Lactobacillusbuchneri復(fù)合接種，纖維素分解菌能夠起到降解纖維的作用。本試驗(yàn)中，各處理DM含量較青貯前有所下降，而其中接種Lactobacillusbuchneri較不添加菌劑處理可顯著提高DM含量，其原因可能是Lactobacillusbuchneri可啟動(dòng)發(fā)酵后期由異質(zhì)型乳酸菌主導(dǎo)的異質(zhì)型發(fā)酵，加速了青貯內(nèi)乙酸等揮發(fā)性脂肪酸的生成，抑制有害微生物的活動(dòng)，從而降低有害微生物對(duì)DM的損耗[2-3,6-8]。另外，本研究中各處理淀粉和WSC含量均較青貯前下降，其主要原因?yàn)榍噘A體系微生物對(duì)底物糖類物質(zhì)的利用所致[1]。本研究中的2個(gè)接種處理均顯著降低了WSC含量，一定程度上促進(jìn)了乳酸、乙酸的生成；然而，各處理間淀粉含量無(wú)顯著差異，其原因可能為纖維素分解菌中Bacillussubtilis產(chǎn)生的α-淀粉酶含量過(guò)低所致[28]。本研究中EE含量較發(fā)酵前有所升高，其與以往研究結(jié)果[29]相似，可能的原因主要由于水分的損失，造成混貯底物總質(zhì)量下降；而復(fù)合接種較其他處理顯著提高了發(fā)酵體系EE含量，其原因可能由于纖維素分解菌的作用抑制了脂肪類物質(zhì)的腐敗[24]。除此以外，發(fā)酵60 d時(shí)主要微生物數(shù)量較發(fā)酵前下降明顯，而各處理之間并未產(chǎn)生顯著差異，其原因主要是在青貯發(fā)酵的過(guò)程中，底物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗使得好氧細(xì)菌、乳酸菌發(fā)酵前期數(shù)量增加而發(fā)酵后期數(shù)量減少，直至趨于穩(wěn)定；酵母菌和霉菌生長(zhǎng)繁殖受到抑制，主要受發(fā)酵體系厭氧環(huán)境和酸性環(huán)境影響[1]。

3.2 纖維素分解菌與Lactobacillus buchneri復(fù)合發(fā)酵對(duì)青貯玉米有氧穩(wěn)定性的影響

有氧穩(wěn)定性是指青貯飼料在開(kāi)封后隨著pH、溫度升高依然保持新鮮、氣味酸香的能力。一般實(shí)際生產(chǎn)中青貯玉米開(kāi)袋后接觸到空氣的部分不會(huì)超過(guò)5 d[6-8,30]。因此，本研究以有氧暴露第5天的各項(xiàng)指標(biāo)分析不同處理對(duì)青貯玉米有氧穩(wěn)定性的影響，結(jié)果表明Lactobacillusbuchneri單獨(dú)或與纖維素分解菌聯(lián)合接種均可顯著降低CO2產(chǎn)氣量，其主要原因由于異質(zhì)型乳酸菌利用底物生成乙酸，抑制好氧微生物的生長(zhǎng)[5]。同時(shí)，諸多研究表明，Lactobacillusbuchneri能夠改善青貯飼料有氧穩(wěn)定性[8]，本研究也得到相同結(jié)論，Lactobacillusbuchneri無(wú)論單獨(dú)或聯(lián)合纖維素分解菌接種，均可使有氧穩(wěn)定時(shí)間持續(xù)在190 h以上，顯著高于不接種處理。霉菌、好氧細(xì)菌和酵母菌一直以來(lái)被認(rèn)為是導(dǎo)致青貯飼料有氧變質(zhì)的主要微生物。本研究中，接種纖維素分解菌的處理使得霉菌數(shù)量顯著高于其他處理，原因主要由于纖維素分解菌中Aspergillusniger和Trichodermaviride增加了發(fā)酵體系霉菌數(shù)量；然而各處理間好氧細(xì)菌、乳酸菌和酵母菌數(shù)量并未產(chǎn)生顯著差異，其原因主要由于開(kāi)袋后發(fā)酵體系變成有氧環(huán)境，青貯底物接觸到更多好氧微生物，不僅為其提供了繁殖所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且pH的升高為好氧微生物創(chuàng)造了更有利的環(huán)境[5]，因而在開(kāi)袋有氧環(huán)境下各類菌劑未能顯著影響微生物生長(zhǎng)。另外，由于本研究采用真空袋法青貯，由于發(fā)酵體系較小(2 kg)，接種的菌劑在有氧環(huán)境下發(fā)揮作用不明顯，因此還需今后擴(kuò)大發(fā)酵體系進(jìn)行更為貼近生產(chǎn)的研究。

3.3 纖維素分解菌與Lactobacillus buchneri復(fù)合發(fā)酵對(duì)青貯玉米瘤胃降解率的影響及綜合評(píng)價(jià)

微生物發(fā)酵可改變飼草原料細(xì)胞壁的微觀結(jié)構(gòu)，破解纖維素之間的碳鏈，使纖維結(jié)構(gòu)疏松，有利于瘤胃微生物附著并產(chǎn)生消化酶，促進(jìn)纖維成分快速降解，同時(shí)也有利于被木質(zhì)化成分包被的營(yíng)養(yǎng)成分釋放，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的瘤胃降解率[1,19,31]。諸多研究證實(shí)，青貯玉米在瘤胃中各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的有效降解率主要取決于瘤胃消化時(shí)間，尤其是纖維性物質(zhì)在瘤胃消化需要保證有效的消化時(shí)間[32]。在本試驗(yàn)中，DM、ADF、NDF、OM降解率隨瘤胃停留時(shí)間的延長(zhǎng)(12～72 h)逐漸升高，這與以往研究結(jié)果相同。瘤胃內(nèi)環(huán)境作為一個(gè)相對(duì)復(fù)雜的微生物系統(tǒng)，其中多種微生物發(fā)揮著重要作用[19]，而本研究接種各菌劑處理并未顯著影響ADF、NDF和OM有效降解率，其原因可能由于接種的菌劑主要在發(fā)酵過(guò)程中起作用，僅改變了青貯的發(fā)酵品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等，對(duì)瘤胃微生物區(qū)系的影響甚小。其中，Lactobacillusbuchneri和纖維素分解菌聯(lián)合接種顯著降低了DM有效降解率，其原因可能是二者的協(xié)同性作用限制了反芻家畜對(duì)DM的實(shí)際利用效率，具體還需要繼續(xù)對(duì)協(xié)同效應(yīng)進(jìn)行深入研究。

目前，對(duì)于青貯質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)往往單純以發(fā)酵指標(biāo)、飼用指標(biāo)等進(jìn)行評(píng)價(jià)；或采用V-Score、隸屬函數(shù)法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)[5,22,33]。采用這些評(píng)價(jià)方法評(píng)價(jià)較為片面且未考慮權(quán)重因素，因此本研究通過(guò)經(jīng)驗(yàn)和文獻(xiàn)法設(shè)定主要指標(biāo)(各處理間產(chǎn)生顯著變化的指標(biāo))權(quán)重，采用相似優(yōu)先比分析，通過(guò)對(duì)標(biāo)參考樣本(理論設(shè)定各指標(biāo)均為最優(yōu))進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)出的結(jié)果更具有全面性，以此得到最優(yōu)處理為L(zhǎng)actobacillusbuchneri和纖維素分解菌聯(lián)合接種綜合效果最優(yōu)，然而由于目前尚無(wú)青貯有氧穩(wěn)定性和瘤胃降解率的相關(guān)國(guó)標(biāo)，且在指標(biāo)選取中，選擇的指標(biāo)不同造成了權(quán)重的不確定性，因此今后還需繼續(xù)深入研究，明確各指標(biāo)在青貯中的重要程度，以此作出更為科學(xué)的評(píng)價(jià)。

4 結(jié) 論

青貯玉米中Lactobacillusbuchneri單獨(dú)或與纖維素分解菌群聯(lián)合接種可有效改善青貯玉米的發(fā)酵品質(zhì)，提高青貯的有氧穩(wěn)定性。綜合評(píng)價(jià)表明，纖維素分解菌和Lactobacillusbuchneri聯(lián)合接種效果最好。