劉建平 郭雄昌 涂 越 蔡力創(chuàng) 張志紅 歐陽(yáng)克氙* 周秋白

(1.江西省科學(xué)院生物資源研究所，江西省功能性飼料添加劑工程實(shí)驗(yàn)室，南昌330096；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南昌330045)

高密度養(yǎng)殖條件下，大量氮排泄易引起水體的富營(yíng)養(yǎng)化，進(jìn)而引起魚(yú)類應(yīng)激和疾病的發(fā)生。此外，魚(yú)類在運(yùn)輸過(guò)程中，由于道路顛簸、天氣悶熱等各種環(huán)境的影響，經(jīng)常出現(xiàn)傷亡[1]。在我國(guó)當(dāng)前禁抗、減抗、限抗的大背景下，如何有效提高養(yǎng)殖魚(yú)類的免疫力是亟需解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

二十八烷醇是一種長(zhǎng)碳鏈脂肪伯醇，主要來(lái)源甘蔗蠟、米糠蠟及蜂蠟等，于20世紀(jì)90年代由古巴科學(xué)家從甘蔗蠟中提取分離得到，具有增強(qiáng)耐力、抗疲勞、促進(jìn)新陳代謝、耐缺氧、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化等功能。研究表明，二十八烷醇可提高斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能、調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝[2]，提高蛋雞的生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)以及改善脂質(zhì)代謝[3-5]，改善肉雞的生長(zhǎng)性能、飼料利用率和屠宰性能[6]。

當(dāng)前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于二十八烷醇在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用的研究鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)擬通過(guò)在飼料中添加二十八烷醇，研究其對(duì)彭澤鯽生長(zhǎng)性能、血脂水平、免疫力、耐缺氧能力以及養(yǎng)殖水體環(huán)境因子的影響，旨在為二十八烷醇在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的研究與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

二十八烷醇：以米糠蠟為原料，經(jīng)皂化、精餾提純、過(guò)濾等工藝制備而成，經(jīng)氣相色譜檢測(cè)，含量為95.2%。

2%亞硝酸鈉溶液：將分析純亞硝酸鈉經(jīng)110 ℃烘干后，置于干燥器內(nèi)冷卻，用蒸餾水稀釋配制。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與飼料

試驗(yàn)用彭澤鯽由南昌茅蓮湖水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)提供，基礎(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖試驗(yàn)于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。試驗(yàn)前，先將試驗(yàn)魚(yú)馴養(yǎng)4周，期間飼喂基礎(chǔ)飼料。選擇健康無(wú)病、體重[(43.77±0.08) g]相近的彭澤鯽180尾，隨機(jī)分為5組(Ⅰ～Ⅴ組)，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)9尾。Ⅰ組為對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)飼料；Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組為試驗(yàn)組，分別飼喂在基礎(chǔ)飼料的基礎(chǔ)上添加12.5、25.0、50.0、100.0 mg/kg二十八烷醇(含量為95.2%)的試驗(yàn)飼料。試驗(yàn)統(tǒng)一選擇大小規(guī)格一致的單體循環(huán)水族箱，24 h通氧，每天飼喂2次，“四定”(定時(shí)、定質(zhì)、定量、定位)法投喂飼料，投飼率為3%。養(yǎng)殖試驗(yàn)在室內(nèi)進(jìn)行，自然溫度下養(yǎng)殖，每周換水2次，并定期清洗水族箱，保持箱內(nèi)水質(zhì)穩(wěn)定。

試驗(yàn)期為90 d，在試驗(yàn)過(guò)程中若發(fā)現(xiàn)有魚(yú)體死亡，及時(shí)記錄死亡魚(yú)體的體重和所在的水族箱，但是不補(bǔ)充新的魚(yú)體。試驗(yàn)期間水溫為25～28 ℃，pH為7.30～7.50，溶解氧濃度>5.0 mg/L，氨氮濃度<0.9 mg/L。

1.4 樣品采集與指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 生長(zhǎng)性能

分別于試驗(yàn)開(kāi)始(第1天)、第21天(第3周末)和第56天(第8周末)進(jìn)行體重測(cè)量，并計(jì)算各采樣時(shí)間點(diǎn)的平均體重，計(jì)算第1～21天和第1～56天的特定生長(zhǎng)率(special grow rate，SGR)及成活率(survival rate，SR)。

特定生長(zhǎng)率(%/d)=[(ln測(cè)量日平均體重-
ln初始平均體重)/試驗(yàn)天數(shù)]×100；
成活率(%)=測(cè)量日活魚(yú)數(shù)/初始活魚(yú)數(shù)。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.4.2 血液指標(biāo)

血清制備：試驗(yàn)第90天時(shí)從每組取8尾魚(yú)尾靜脈取血，室溫靜置30 min，離心分離血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

血脂指標(biāo)：采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的相應(yīng)試劑盒測(cè)定血清中總膽固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)水平。

免疫指標(biāo)：血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性按照試劑盒(南京建成生物工程研究所)的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。按照血球計(jì)數(shù)板說(shuō)明書(shū)分別對(duì)血液中紅細(xì)胞(red blood cells,RBC)、白細(xì)胞(white blood cells,WBC)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.4.3 養(yǎng)殖水體環(huán)境因子

試驗(yàn)期間，在每次換水前3天關(guān)閉增氧泵，分6個(gè)階段按水族箱序號(hào)逐一取樣，采用廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)的相應(yīng)試劑盒測(cè)定養(yǎng)殖水體中的氨氮、亞硝酸鹽濃度。

1.4.4 耐缺氧能力

試驗(yàn)結(jié)束后，分2批進(jìn)行亞硝酸鹽致死試驗(yàn)，以注射完毒劑至鰓蓋閉合呼吸停止為標(biāo)準(zhǔn)，記錄致死時(shí)間。亞硝酸鹽溶液注射量為魚(yú)體重的2%，采用背部肌肉注射。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)用Excel 2019記錄整理后，用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和Duncan氏法多重比較，分別以P<0.05和P<0.01為差異顯著和極顯著標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示。

2 結(jié) 果

2.1 二十八烷醇對(duì)彭澤鯽生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，在試驗(yàn)第21天和第56天時(shí)，各試驗(yàn)組的平均體重均低于對(duì)照組，但差異不顯著(P>0.05)。在試驗(yàn)第1～21天時(shí)，Ⅱ組與Ⅲ組的特定生長(zhǎng)率高于對(duì)照組，Ⅳ組和Ⅴ組則低于對(duì)照組，但差異均不顯著(P>0.05)；在試驗(yàn)第1～56天時(shí)，Ⅱ組、Ⅲ組與Ⅳ組的特定生長(zhǎng)率均高于對(duì)照組，Ⅴ組則低于對(duì)照組，但差異均不顯著(P>0.05)。在成活率方面，各試驗(yàn)組與對(duì)照組均為100%，各組間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表2 二十八烷醇對(duì)彭澤鯽生長(zhǎng)性能的影響

2.2 二十八烷醇對(duì)彭澤鯽血脂水平的影響

由表3可知，各試驗(yàn)組血清TC水平均低于對(duì)照組，但差異不顯著(P>0.05)，其中Ⅳ組和Ⅴ組血清TC水平均有降低的趨勢(shì)(P=0.081、P=0.071)。各試驗(yàn)組血清HDL-C水平均高對(duì)照組，但差異不顯著(P>0.05)。各試驗(yàn)組血清LDL-C水平均低于對(duì)照組，其中Ⅲ組顯著降低(P<0.05)，Ⅳ組有降低趨勢(shì)(P=0.069)；此外，Ⅲ組與Ⅱ組之間差異顯著(P<0.05)，其他試驗(yàn)組之間差異不顯著(P>0.05)。

表3 二十八烷醇對(duì)彭澤鯽血脂水平的影響

2.3 二十八烷醇對(duì)彭澤鯽免疫力的影響

由表4可知，各試驗(yàn)組血清SOD活性均高于對(duì)照組，并存在劑量依賴性，其中Ⅳ組與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，Ⅴ組與對(duì)照組的差異極顯著(P<0.01)，Ⅲ組則較對(duì)照組有升高趨勢(shì)(P=0.088)，各試驗(yàn)組之間差異不顯著(P>0.05)。各試驗(yàn)組血液紅細(xì)胞數(shù)均低于對(duì)照組，并存在劑量依賴性，其中Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)，各試驗(yàn)組之間差異不顯著(P>0.05)。試驗(yàn)組血液白細(xì)胞數(shù)均高于對(duì)照組，并存在劑量依賴性，其中Ⅴ組與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)；此外，Ⅴ組與Ⅱ組差異顯著(P<0.05)，其他試驗(yàn)組之間差異不顯著(P>0.05)。

表4 二十八烷醇對(duì)彭澤鯽血液免疫指標(biāo)的影響

2.4 二十八烷醇對(duì)彭澤鯽耐缺氧能力的影響

由表5可知，Ⅲ組的存活時(shí)間顯著高于對(duì)照組以及Ⅱ組、Ⅳ組和Ⅴ組(P<0.05)，對(duì)照組以及Ⅱ組、Ⅳ組和Ⅴ組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表5 二十八烷醇對(duì)亞硝酸鹽攻毒后彭澤鯽存活時(shí)間的影響

2.5 二十八烷醇對(duì)養(yǎng)殖水體環(huán)境因子的影響

由表6、表7可知，在不同的飼養(yǎng)階段，各試驗(yàn)組養(yǎng)殖水體中氨氮、亞硝酸鹽濃度與對(duì)照組之間均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

3.1 二十八烷醇對(duì)彭澤鯽生長(zhǎng)性能的影響

已有研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加8 mg/kg含量為53.7%的二十八烷醇能夠顯著提高斷奶仔豬的平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化率[2]；飼糧中添加含量為92%以上的二十八烷醇可以顯著提高肉雞的平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化率，并且存在劑量依賴性[6]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加12.5和25.0 mg/kg含量為95.2%二十八烷醇后彭澤鯽的平均體重、特定生長(zhǎng)率略有提升，但效果不如上述文獻(xiàn)報(bào)道的顯著，這可能是由于試驗(yàn)對(duì)象存在差異性，具體原因還需深入研究。

表6 二十八烷醇對(duì)養(yǎng)殖水體中氨氮濃度的影響

表7 二十八烷醇對(duì)養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽濃度的影響

3.2 二十八烷醇對(duì)彭澤鯽血脂水平的影響

膽固醇在血液中主要以脂蛋白載體形式存在，是重要的血液生化指標(biāo)。高密度脂蛋白能夠與游離膽固醇結(jié)合形成HDL-C，將膽固醇運(yùn)輸進(jìn)入肝臟，膽固醇經(jīng)肝臟代謝形成膽汁酸并經(jīng)膽管排入腸道，從而降低組織中膽固醇的沉積。而低密度脂蛋白能夠?qū)⒛懝檀嫁D(zhuǎn)運(yùn)到外周組織，低密度脂蛋白長(zhǎng)期超標(biāo)可引起動(dòng)脈硬化。Sharma等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在高脂處理?xiàng)l件下，灌飼60 mg/(kg BW·d)含量分別為18%和99%以上的二十八烷醇對(duì)小鼠血液TC和甘油三酯(triglyceride,TG)水平均無(wú)顯著影響。Peng等[3]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加18 mg/kg以上含量為53.7%的二十八烷醇可以顯著降低健康蛋雞血液TC、LDL-C和TG水平，對(duì)HDL-C水平無(wú)顯著影響，且調(diào)脂效果與劑量、試驗(yàn)周期有關(guān)。Lee等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在高膽固醇處理?xiàng)l件下，飼糧中添加6 mg/kg以上含量為62.3%的二十八烷醇可以顯著降低大鼠血液TC、LDL-C和TG水平，具有提高HDL-C水平的趨勢(shì)，且調(diào)脂效果與劑量有關(guān)。Nam等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在高脂高膽固醇處理?xiàng)l件下，添加20 mg/kg BW含量為65.04%的二十八烷醇可以有效降低大鼠血液TC、LDL-C和TG水平，同時(shí)提高HDL-C水平。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加25.0 mg/kg含量為95.2%的二十八烷醇可以顯著降低彭澤鯽血清LDL-C水平，添加50.0 mg/kg以上劑量時(shí)則有降低血清TC水平的趨勢(shì)，但均對(duì)血清HDL-C水平無(wú)顯著影響，其調(diào)節(jié)血脂的效果不如上述文獻(xiàn)[3,8-9]報(bào)道的含量為50%～70%的二十八烷醇顯著。綜合分析文獻(xiàn)與本試驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，二十八烷醇調(diào)節(jié)血脂效果除了與劑量、試驗(yàn)周期相關(guān)外，并非二十八烷醇的含量越高效果就越好，這可能是由于二十八烷醇與高級(jí)脂肪烷醇之間存在協(xié)同作用，具體原因還有待于進(jìn)一步研究。

3.3 二十八烷醇對(duì)彭澤鯽免疫力的影響

SOD是一種重要的抗氧化酶，在防御機(jī)體衰老和生物分子損傷等方面有很大的作用。SOD與水生生物的免疫力密切相關(guān)，對(duì)增強(qiáng)吞噬細(xì)胞防御能力和整個(gè)機(jī)體的免疫功能具有重要作用，可作為水產(chǎn)動(dòng)物機(jī)體的免疫指標(biāo)。龐偉毅等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在高脂處理?xiàng)l件下，灌飼6 mg/(kg BW·d)以上含量為61.11%的二十八烷醇可以顯著升高大鼠血清SOD與谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性，同時(shí)顯著降低血清丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量，且抗氧化功能與劑量有關(guān)。龍蕾等[2]發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加8 mg/kg含量為53.7%的二十八烷醇可以有效提高斷奶仔豬血液SOD活性和總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)，降低血液MDA含量。于長(zhǎng)青等[11]發(fā)現(xiàn)，飲水中添加含量為99.9%的二十八烷醇能夠有效降低力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心肌線粒體中MDA的含量，并提高SOD和GSH-Px的活性。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加12.5 mg/kg以上含量為95.2%的二十八烷醇可有效提高彭澤鯽血清SOD活性，并且存在劑量依賴性，這與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，二十八烷醇通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力來(lái)提高免疫力，其效果與各種高級(jí)脂肪烷醇之間的協(xié)同作用無(wú)相關(guān)性。

紅細(xì)胞也稱紅血球，是脊椎動(dòng)物體內(nèi)通過(guò)血液運(yùn)送氧氣的最主要媒介，同時(shí)其還具有免疫功能。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加25.0 mg/kg以上含量為95.2%的二十八烷醇可以減少彭澤鯽血液中紅細(xì)胞數(shù)，這說(shuō)明二十八烷醇能夠使彭澤鯽對(duì)氧氣的相對(duì)需求量降低，而且有助于降低血液黏稠度，從而降低心臟負(fù)荷，提高機(jī)體耐缺氧能力。

白細(xì)胞在機(jī)體損傷治愈、抗御病原入侵方面起著重要的作用。血液中白細(xì)胞數(shù)過(guò)高或過(guò)低都會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不利的影響，當(dāng)白細(xì)胞數(shù)過(guò)低時(shí)，機(jī)體的免疫能力較低下；當(dāng)白細(xì)胞數(shù)過(guò)高時(shí)，機(jī)體有感染炎癥的可能。巫苗苗[12]研究發(fā)現(xiàn)，口服二十八烷醇可以明顯升高運(yùn)動(dòng)員血液中白細(xì)胞數(shù)，并保持在一個(gè)較好的水平，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體免疫力。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加二十八烷醇可增加彭澤鯽血液中白細(xì)胞數(shù)，其中添加100.0 mg/kg含量為95.2%的二十八烷醇使血液白細(xì)胞數(shù)顯著增加，并維持在一個(gè)正常水平，這有助于提升機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)力和抗逆性，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。

3.4 二十八烷醇對(duì)彭澤鯽耐缺氧能力的影響

在精養(yǎng)魚(yú)池中，水體銨態(tài)氮(NH4-N)和亞硝態(tài)氮(NO2-N)濃度高，在魚(yú)類主要生長(zhǎng)季節(jié)甚至能分別達(dá)到三態(tài)氮的60%和15%。當(dāng)水體亞硝酸鹽濃度為20.3 mg/L時(shí)，魚(yú)體在24 h內(nèi)死亡率達(dá)90%，48 h內(nèi)全部死亡[13]。這是因?yàn)閬喯鯌B(tài)氮進(jìn)入魚(yú)體血液后，血紅蛋白分子中的二價(jià)鐵離子(Fe2+)會(huì)被氧化成三價(jià)鐵離子(Fe3+)，血液的載氧能力被抑制[14]。水體中亞硝態(tài)氮濃度越高，高鐵血紅蛋白越多，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致魚(yú)類缺氧死亡。

盧國(guó)守[15]研究發(fā)現(xiàn)，二十八烷醇通過(guò)提高慢性缺氧大鼠機(jī)體抗氧化能力，降低機(jī)體活性氧水平，減輕氧化損傷，提高細(xì)胞色素氧化酶活性和線粒體功能，改善肝功能，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體抗缺氧能力?；蒎\[16]研究發(fā)現(xiàn)，含量為98%以上的二十八烷醇可以明顯增強(qiáng)小鼠的耐缺氧能力，減少大腦耗能，改善心肌缺氧，顯著延長(zhǎng)小鼠在常壓密閉缺氧環(huán)境中的生存時(shí)間；二十八烷醇不是通過(guò)改善機(jī)體血氧運(yùn)輸效率，而是通過(guò)提高紅細(xì)胞中血紅蛋白濃度，減小紅細(xì)胞體積來(lái)降低血液黏滯度，從而改善微循環(huán)和組織供氧。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加25.0 mg/kg含量為95.2%的二十八烷醇可有效提高亞硝酸鹽應(yīng)激下彭澤鯽的耐缺氧能力，與上述文獻(xiàn)報(bào)道是一致的。周梅[17]研究發(fā)現(xiàn)，3種低含量(22.44%、33.72%和41.86%)的二十八烷醇均具有抗缺氧作用，且其功效大小與二十八烷醇含量無(wú)顯著相關(guān)性，這說(shuō)明二十八烷醇的抗缺氧作用與其含量高低無(wú)關(guān)，可能與其他高級(jí)脂肪醇之間存在協(xié)同效應(yīng)，關(guān)于二十八烷醇與其他高級(jí)脂肪烷醇的協(xié)同機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究探討。

4 結(jié) 論

飼料中添加高含量(95.2%)的二十八烷醇可以有效調(diào)節(jié)彭澤鯽的血脂水平，改善免疫力和耐缺氧能力，對(duì)生長(zhǎng)性能和養(yǎng)殖水體環(huán)境無(wú)負(fù)面影響。綜合考慮，本試驗(yàn)條件下，彭澤鯽飼料中含量為95.2%的二十八烷醇的建議添加量為25.0 mg/kg。