牛曉雨 李大彪 麗 麗 解湧芳 朱壽謙 王敬堯

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)高校動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點實驗室，呼和浩特010018)

原蟲在反芻動物瘤胃發(fā)酵過程中具有十分重要的作用，每毫升瘤胃內(nèi)容物中有105～107個原蟲[1]。瘤胃原蟲有吞噬細(xì)菌、降低細(xì)菌對飼糧中淀粉消化率的作用，同時也可以將飼糧中纖維物質(zhì)和淀粉等轉(zhuǎn)化成揮發(fā)性脂肪酸，減緩碳水化合物在瘤胃內(nèi)的發(fā)酵速度，穩(wěn)定瘤胃pH。除此之外，原蟲也有增加甲烷產(chǎn)量的負(fù)面作用[2]。植物單寧也叫鞣酸、鞣質(zhì)或植物多酚，在植物體內(nèi)含量僅次于纖維素、半纖維素和木質(zhì)素[3]。根據(jù)結(jié)構(gòu)及性質(zhì)不同，將單寧分為縮合單寧(CT)和可水解單寧(HT)。CT又名原花青素，分子質(zhì)量大，可以被氧化，但不易被水解[4]。HT是兒茶酚和沒食子兒茶酚單體的多聚物[5]，以多糖為中心結(jié)構(gòu)，其具有的羥基能與酸發(fā)生酯化反應(yīng)，在熱刺激或者弱酸條件下易被分解，是一種能夠改善畜禽健康的優(yōu)質(zhì)天然植物提取物[6]，也是一種天然的反芻動物瘤胃發(fā)酵調(diào)控劑。Cieslak等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在奶牛飼糧中添加越橘單寧，瘤胃原蟲總數(shù)顯著降低。體外培養(yǎng)試驗中，向培養(yǎng)液中混合添加HT和CT或者單獨添加HT時，發(fā)現(xiàn)纖毛蟲數(shù)量均有所下降，分別下降36.2%和12.3%[8]。李大彪等[9]發(fā)現(xiàn)，在綿羊和絨山羊飼糧中添加6%的CT，絨山羊的瘤胃原蟲數(shù)量顯著低于對照組，綿羊瘤胃原蟲數(shù)量與對照組相比有下降趨勢。但是，也有研究表明，在奶牛飼糧中添加的單寧含量達(dá)105 g時，對原蟲數(shù)量無顯著影響[10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中含2%和4%的單寧可顯著降低綿羊單位干物質(zhì)采食量的甲烷排放量[11]，這是否與單寧影響了瘤胃原蟲種群數(shù)量和區(qū)系有關(guān)？為此，本試驗應(yīng)用顯微鏡計數(shù)方法結(jié)合高通量測序技術(shù)，檢測了單寧對綿羊瘤胃原蟲數(shù)量和種群多樣性的影響，旨在為富含單寧粗飼料資源的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計及飼糧

本試驗選取體況良好、體重45 kg左右的杜蒙雜交羯羊15只，隨機分為3組，分別為Ⅰ組(對照組，不含單寧)、Ⅱ組(含2%單寧)和Ⅲ組(含4%單寧)，每組5只羊。飼糧中單寧來自結(jié)莢期的檸條，檸條購自內(nèi)蒙古百瑞草業(yè)有限公司。飼糧的精粗比為4∶6，3組飼糧根據(jù)等能等氮的原則加工成全混合日糧顆粒。檸條的營養(yǎng)成分和縮合單寧含量見表1[11]。試驗動物于每天09：00和17：00分別飼喂1次，自由飲水。試驗動物在預(yù)試期統(tǒng)一驅(qū)蟲處理。試驗預(yù)試期14 d，正試期20 d，采用單因素完全隨機試驗設(shè)計。飼糧營養(yǎng)水平參考《動物營養(yǎng)參數(shù)與飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》[12]，其組成及營養(yǎng)水平見表2。

表1 檸條中的營養(yǎng)成分和縮合單寧含量(風(fēng)干基礎(chǔ))

表2 飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 樣品采集

在正試期的第18天和第19天晨飼前和晨飼后6 h通過口腔采樣器采集瘤胃液，迅速經(jīng)4層紗布過濾后，將一部分瘤胃液用2倍體積的甲基綠福爾馬林(MFS)染色液進行固定，用于計數(shù)原蟲。另外，將晨飼后6 h瘤胃液分裝于凍存管中液氮速凍后-80 ℃保存，用于高通量測序分析。

1.3 瘤胃液中原蟲計數(shù)

1.3.1 固定原蟲用染色液的配制方法

MFS染色液：100 mL 35%福爾馬林、8.0 g氯化鈉、0.6 g甲基綠加入到900 mL蒸餾水中混合均勻。

瘤胃液混勻，過濾，將10 mL濾液和20 mL固定用MFS染色液混勻，輕搖，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 原蟲計數(shù)方法

計數(shù)原蟲數(shù)量選用血球計數(shù)板，深0.5 mm，25個中格，16個小格，按對角線方位，數(shù)左上、左下、右上、右下的4個中方格和中央1個中方格的菌數(shù)，共為80個小格，每個樣品計數(shù)3次，取平均值。

計數(shù)前，輕輕搖均混合溶液，用移液槍吸取0.5 mL混合溶液，從蓋上蓋玻片的計數(shù)板一側(cè)緩慢添加使之不產(chǎn)生氣泡，“H”型玻璃槽被填滿溶液后靜置10～15 min。

1.3.3 計算公式

X=A/5×25×B×0.5×2×1 000。

式中：X為每毫升瘤胃液樣品中所含原蟲數(shù)；A為5個中方格內(nèi)的原蟲數(shù)；B為稀釋倍數(shù)。因每個計數(shù)室體積為0.5 mm3，將其換算成1 cm3(1 mL)時需乘以2×1 000。

1.4 瘤胃液中微生物總DNA提取、擴增和測序

表3 PCR反應(yīng)體系

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2013整理，采用SAS 9.2軟件包中的mixed程序進行方差分析，多重比較采用Duncan氏法，結(jié)果用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 綿羊瘤胃原蟲測序深度

本試驗各組測序覆蓋度均達(dá)到了0.99，表示覆蓋度足夠，滿足后續(xù)分析要求。本試驗的15個樣品中共得到941 190條高質(zhì)量序列，每個樣品為62 746條序列。以97%的一致性聚類為40個OTU。綿羊瘤胃原蟲Shannon稀釋曲線(圖1)最終趨于平緩，說明本試驗的測序深度已經(jīng)覆蓋了瘤胃液中絕大部分的原蟲樣品，可進行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

圖1 原蟲Shannon稀釋曲線

2.2 不同水平單寧對綿羊瘤胃原蟲種群alpha多樣性的影響

由表4可知，Ⅱ組和Ⅲ組綿羊瘤胃原蟲Chao 1指數(shù)顯著低于對照組(P<0.05)，Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Ace指數(shù)隨著飼糧單寧水平增加呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，但3組間差異不顯著(P>0.05)。

表4 飼糧不同水平單寧對綿羊瘤胃原蟲alpha多樣性的影響

2.3 不同水平單寧對綿羊瘤胃原蟲數(shù)量和屬水平物種組成的影響

由表5可知，在晨飼前和晨飼后6 h，Ⅲ組原蟲數(shù)量顯著低于對照組(P<0.05)，Ⅱ組有低于對照組的趨勢，但差異不顯著(P>0.05)。

由表5可知，綿羊瘤胃液中主要原蟲屬為頭毛蟲科下的未分類的屬、內(nèi)毛蟲屬、前毛蟲屬、厚毛蟲屬、兩腰纖毛蟲屬和均毛蟲屬。3個組的優(yōu)勢原蟲屬均為頭毛蟲科下未分類的屬。Ⅲ組的均毛蟲屬相對豐度顯著高于對照組和Ⅱ組(P<0.05)，對照組和Ⅱ組間無顯著差異(P>0.05)。Ⅱ組和Ⅲ組內(nèi)毛蟲屬相對豐度有低于對照組的趨勢(P=0.06)；Ⅱ組和Ⅲ組前毛蟲屬相對豐度有低于對照組的趨勢(P=0.07)；頭毛蟲科下的未分類的屬、厚毛蟲屬和兩腰纖毛蟲屬相對豐度各組間無顯著差異(P>0.05)。

表5 飼糧不同水平單寧對綿羊瘤胃原蟲數(shù)量和屬水平物種組成的影響

2.4 綿羊瘤胃原蟲種群韋恩(Venn)圖分析

由圖2可知，3組綿羊瘤胃共享的核心原蟲OTU數(shù)為29個，占各組OTU數(shù)的比例均為82.9%。對照組和Ⅱ組共享的OTU數(shù)為31個，各自特有的OTU數(shù)分別為1和2個。對照組和Ⅲ組共享的OTU數(shù)為32個，各自特有的OTU數(shù)均為1個。Ⅱ組和Ⅲ組共享的OTU數(shù)為31個，各自特有的OTU數(shù)分別為2和1個。

Ⅰ：對照組；Ⅱ：Ⅱ組；Ⅲ：Ⅲ組。

2.5 綿羊瘤胃原蟲OTU水平主坐標(biāo)分析(PCoA)

由圖3可知，Ⅱ組和Ⅲ組瘤胃原蟲組成明顯單獨聚集成簇(R=0.4760;P=0.0190)(圖3-C)；對照組和Ⅱ組瘤胃原蟲的相似性也較小(R=0.276 0;P=0.096 0)(圖3-A)，而對照組和Ⅲ組之間瘤胃原蟲組成相似性較高(R=-0.064 0;P=0.616 0)(圖3-B)。

3 討 論

3.1 單寧對綿羊瘤胃原蟲數(shù)量的影響

原蟲是反芻動物瘤胃微生物的重要組成部分，而且原蟲在眾多的瘤胃微生物中所占體積最大，占總微生物體積的30%～80%[13]。本試驗中研究得出，飼糧中含4%檸條來源的單寧顯著降低了晨飼前和晨飼后6 h瘤胃原蟲數(shù)量，飼糧中含2%單寧也有降低瘤胃原蟲數(shù)量的趨勢。Jolazadeh等[14]在荷斯坦公牛飼糧中添加從開心果提取的縮合單寧，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其降低了瘤胃原蟲總量。丁學(xué)智[15]研究發(fā)現(xiàn)，在瘤胃體外發(fā)酵試驗中，隨著單寧濃度的增加原蟲數(shù)量顯著減低。楊凱[16]發(fā)現(xiàn)肉牛飼糧中添加6.5、13.0和26.0 g/kg單寧時，瘤胃原蟲數(shù)量均顯著降低。上述研究結(jié)果均與本試驗結(jié)果一致，分析其原因可能是單寧降低了瘤胃細(xì)菌的數(shù)量，間接影響了原蟲氮的供給，進而抑制了原蟲的生長[5，17]。但是，也有試驗結(jié)果表明，單寧對瘤胃原蟲的相對豐度無顯著影響[18]。不同的研究得出的單寧對瘤胃原蟲數(shù)量影響的結(jié)果不一致，這可能與不同的試驗單寧來源、單寧添加量、采樣時間、動物品種不同有關(guān)。

圖3 綿羊瘤胃原蟲種群主坐標(biāo)分析圖

3.2 單寧對綿羊瘤胃原蟲多樣性的影響

瘤胃原蟲在反芻動物瘤胃發(fā)酵過程中扮演十分重要的作用，原蟲的豐度與多樣性受飼糧、動物品種等多種因素的影響。近年來，植物提取物影響反芻動物瘤胃原蟲多樣性與豐度的研究受到廣泛關(guān)注。王彩蝶等[19]研究發(fā)現(xiàn)，醋酸棉酚對綿羊瘤胃液原蟲多樣性無顯著影響。有研究報道，存在于印度田菁葉中的單寧對原蟲多樣性沒有顯著影響[20]。本試驗結(jié)果顯示，綿羊飼糧中含2%和4%檸條來源的單寧對綿羊瘤胃原蟲Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)無顯著影響，但會降低瘤胃原蟲相對豐度。從Venn圖的試驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，對照組與2個試驗組的共享原蟲占總原蟲比例達(dá)到82.9%，這表明單寧對瘤胃液原蟲多樣性沒有產(chǎn)生顯著影響。從主坐標(biāo)分析的試驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，對照組和2個試驗組原蟲組成均具有一定的相似性，這也表明單寧對瘤胃液原蟲多樣性沒有產(chǎn)生顯著影響。本研究得出，在屬水平上，動物瘤胃內(nèi)原蟲各屬的數(shù)量隨著飼糧中單寧含量的變化而有所變化,2個試驗組的內(nèi)毛蟲屬和前毛蟲屬相對豐度都顯示有低于對照組的趨勢，與多樣性指數(shù)中的Chao1指數(shù)得出的結(jié)論一致，這表明在屬水平上，單寧可以降低部分原蟲屬的相對豐度，內(nèi)毛蟲屬在瘤胃蛋白質(zhì)降解和微生物氮循環(huán)中發(fā)揮重要作用，這說明單寧可能會通過降低瘤胃內(nèi)毛蟲屬的數(shù)量對瘤胃蛋白質(zhì)的利用起到負(fù)面效果。除此，有研究發(fā)現(xiàn)，一些植物提取物對反芻動物瘤胃原蟲多樣性會造成影響，趙士萍等[21]研究發(fā)現(xiàn)，奶牛每天飼喂30或40 g茶皂素均可顯著降低瘤胃原蟲的多樣性，其原因可能是單寧有抑制瘤胃細(xì)菌增殖的作用[22]，瘤胃原蟲可以吞噬細(xì)菌，細(xì)菌數(shù)量和多樣性的改變進而導(dǎo)致原蟲多樣性的降低，這還有待通過體外細(xì)菌和原蟲共培養(yǎng)試驗來進一步驗證。

4 結(jié) 論

飼糧含2%和4%來源于檸條的單寧顯著降低綿羊瘤胃原蟲數(shù)量，但對原蟲種群多樣性無顯著影響；飼糧含4%來源于檸條的單寧顯著增加了均毛蟲屬的相對豐度，飼糧含2%和4%來源于檸條的單寧有降低前毛蟲屬和內(nèi)毛蟲屬相對豐度的趨勢。