陳 信，丁 勇，黃志宏，厲 桓，詹 妍，張冬萱，喬宏興

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動物醫(yī)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450001)

由多殺性巴氏桿菌引起的巴氏桿菌病是一種重要的人畜共患傳染病，主要引起畜禽發(fā)生出血性敗血病或傳染性肺炎，可以在動物之間相互傳染，同時也可通過與動物接觸使人感染致病[1]。多殺性巴氏桿菌多為呼吸道常見菌，不引起疾病。但在動物營養(yǎng)不良和抵抗力下降時，可直接或間接地導(dǎo)致某些疾病的發(fā)生，如禽霍亂、鴿霍亂、豬肺疫和牛呼吸道等疾病。這些疾病的高發(fā)病率和高死亡率一直嚴(yán)重影響國內(nèi)畜牧行業(yè)的發(fā)展[2]。巴氏桿菌是一種條件致病菌，易與其他病原菌混合感染或繼發(fā)感染。巴氏桿菌在飼養(yǎng)動物雞、豬和牛較為常見，但在鴿子飼養(yǎng)中較為少見。

隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和國人消費(fèi)水平的不斷提高，對鴿類的市場需求量也在逐年上升，鴿子養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，然而鴿病的發(fā)生和流行是妨礙鴿子養(yǎng)殖行業(yè)發(fā)展的主要問題之一[3]。其中鴿霍亂屢有發(fā)生和流行，并且呈現(xiàn)上升趨勢，嚴(yán)重危害養(yǎng)鴿業(yè)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展。因此對鴿源巴氏桿菌的研究對鴿病的防控具有現(xiàn)實指導(dǎo)意義。

本試驗從發(fā)病鴿的肝、脾等組織病料中分離出一株鴿源巴氏桿菌，利用生化試驗進(jìn)行細(xì)菌鑒定，通過藥敏試驗分析其敏感藥物，了解該場鴿源巴氏桿菌的耐藥情況。本研究篩選出了高度敏感的抗菌藥，同時也為臨床上鴿源巴氏桿菌引起的多殺性巴氏桿菌病的防治提供科學(xué)參考依據(jù)。

1 材料

1.1 培養(yǎng)基及主要試劑

營養(yǎng)瓊脂：購于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；犢牛血清：購于蘭杰柯科技有限公司;麥康凱瓊脂、胰蛋白胨大豆瓊脂、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、鮮血瓊脂平板、革蘭氏染色液試劑盒、細(xì)菌微量生化鑒定管、藥物敏感紙片：購自青島高科技園海博生物技術(shù)有限公司。

2 實驗方法

2.1 發(fā)病情況

駐馬店一養(yǎng)鴿廠南北兩棚均有10日齡左右乳鴿，開始發(fā)病，零星死亡。一對母鴿撫養(yǎng)3只乳鴿，至少死亡1只，之前未發(fā)生這種情況，最近半年幾乎到這個日齡發(fā)病?？股赜昧硕喾N，治療后有效果但不能徹底根治，影響生產(chǎn)。平時防疫情況：母鴿每年3月和9月防疫新城疫和流感二聯(lián)苗，以后每隔2個月飲水。

2.2 臨床癥狀

鴿患此病后一般表現(xiàn)為急性經(jīng)過，病鴿體溫高達(dá)43～44 ℃，先是精神萎靡，食欲減退或不食，渴欲增強(qiáng)，頻繁飲水。羽毛蓬松雜亂，后出現(xiàn)呼吸困難，口鼻流出泡沫狀黏液。大多數(shù)鴿子有嚴(yán)重下痢，糞便呈灰色、銅綠色或黃白色。 整個病程1～3 天，最終死于衰竭。

2.3 剖檢病理變化

剖檢時可見病鴿各漿膜、皮下脂肪和心冠脂肪等處密布出血點(圖1)；肝臟腫脹到幾乎覆蓋整個腹腔，質(zhì)感脆，有針尖大小的灰白色壞死點(圖2)；腸道黏膜出血，腸壁薄，尤其是十二指腸黏膜有明顯的出血點。個別有腹水，氣管上有出血點，腎臟腫脹。心包發(fā)炎，心包積液增多(圖3)，肺出血。

圖1 肝臟腫脹

2.4 培養(yǎng)基的配制

麥康凱培養(yǎng)基：胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基4.0 g，蒸餾水100 mL；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基3.0 g，蒸餾水100 mL；5%血清營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基3.3 g營養(yǎng)瓊脂，5 mL犢牛血清，100 mL蒸餾水，高壓滅菌備用。

圖2 肝臟上灰白色壞死點

圖3 各臟器出血

2.5 細(xì)菌分離培養(yǎng)

實驗室無菌采集病鴿的肝臟，對采集的病料病變部位表面進(jìn)行灼燒滅菌，分別接種于5 %血清營養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、鮮血平板、TSA平板。所有平板劃線結(jié)束，30 min后將平板倒扣并做標(biāo)記。放入37 ℃恒溫箱中，培養(yǎng)24 h后，肉眼觀察培養(yǎng)基中細(xì)菌的菌落形態(tài)。

2.6 細(xì)菌形態(tài)學(xué)鑒定

待平板上長出肉眼可見的菌落后，觀察菌落的形態(tài)并標(biāo)記疑似多殺性巴氏桿菌的單菌落，挑取菌落用記號筆標(biāo)出，涂片、固定、染色、脫色、復(fù)染均按試劑盒說明書進(jìn)行革蘭氏染色，干燥后，用顯微鏡觀察，并記錄結(jié)果。

2.7 細(xì)菌純化培養(yǎng)

制備100 mL TSB，各取3 mL放入4只10 mL EP管，從斜面挑取菌落接種于各試管中，37 ℃, 200 r/min搖菌5～6 h；將試管中的菌液接種于三角瓶剩余TSB中，繼續(xù)搖菌24 h，條件同上，觀察菌液性狀。取菌液接種于平板上，進(jìn)行“Z”字形劃線，將平板倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。若在新板上有長出菌落，可再次劃線直至完全純化。

2.8 生化實驗

用接種針從平板上挑取已純化單個菌落，用生理鹽水稀釋后，與麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷幔瞥蓾舛葹?.5×108CFU/mL細(xì)菌懸液，滴入上述微量生化鑒定管中，每管三滴，接種完后放37 ℃恒溫培養(yǎng)中培養(yǎng)。按照說明書，不同的生化鑒定管按照不同的時間培養(yǎng)，觀察結(jié)果并記錄。

2.9 藥敏實驗

挑取平板上已純化的單個菌落，制成1.5×108CFU/mL的細(xì)菌懸液，采用紙片瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗。37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，觀察藥物紙片周圍有無抑菌圈并記錄各種藥敏片的抑菌圈直徑大小，進(jìn)而為該菌株對各種藥物的敏感性進(jìn)行判定。

3 結(jié)果與分析

3.1 分離菌株的形態(tài)學(xué)

接種于鮮血瓊脂平板生長狀態(tài)良好，呈現(xiàn)灰褐色、半透明、稍突起、光滑、邊緣整齊的濕潤粘稠菌落、未出現(xiàn)溶血區(qū)，見圖4。在麥康凱瓊脂平板上不生長，見圖5。在5%血清瓊脂生長狀態(tài)良好，形成乳白色、圓形、半隆起、濕潤、表面光滑的露滴狀單個菌落，見圖6。在TSA平板上生長可見淡黃白色、圓形隆起、濕潤、邊緣整齊的露珠樣菌落，見圖7。

圖4 12 h鮮血平板菌落形態(tài)

圖5 24 h麥康凱菌落形態(tài)

圖6 24 h 5%血清瓊脂菌落形態(tài)

圖7 12 h TSA菌落形態(tài)

3.2 細(xì)菌形態(tài)特性

革蘭氏染色鏡檢陰性，本菌細(xì)小短桿狀，多呈單個存在，很少成對或形成短鏈狀。顯微鏡下見到菌體兩極著染較深，不形成芽孢，無運(yùn)動性，有的菌株具有莢膜，見圖8。

圖8 革蘭氏染色 (1000×)

3.3 純化培養(yǎng)

在TSB中連續(xù)培養(yǎng)24 h，呈現(xiàn)輕度混濁，瓶底出現(xiàn)乳白色粘稠沉淀見圖9～10，純化培養(yǎng)菌落形態(tài)如圖11。

圖9 菌液輕度混濁

圖10 瓶底白色沉淀

圖11 純化培養(yǎng)菌落形態(tài)

3.4 生化實驗

生化實驗表明該菌株能利用麥芽糖、蔗糖、木糖、甘露醇和山梨醇，VP實驗呈陽性;不能利用乳糖、尿素酶、硫化氫，MR實驗呈陰性。分離菌株生化實驗結(jié)果見表1。

3.5 藥敏實驗

分離的本株細(xì)菌藥敏試驗結(jié)果見表2。根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，結(jié)合當(dāng)?shù)亓餍胁∏闆r，推薦首先選擇慶大霉素、阿米卡星、新霉素治療，同時采取有效的防治措施，及時隔離發(fā)病鴿，對污染的場地和鴿舍進(jìn)行徹底消毒工作。2019年4月19日，該廠治療結(jié)果反饋，病情基本得到控制。

4 討論

多殺性巴氏桿菌是禽霍亂的重要致病菌，正常畜禽呼吸道和消化道也存在，屬于一種條件致病菌[4,5]。圈舍產(chǎn)生氣溫驟變、通風(fēng)不良等應(yīng)激因素導(dǎo)致機(jī)體抵抗力下降，容易導(dǎo)致禽霍亂的爆發(fā)[6,7]，該病嚴(yán)重影響?zhàn)B禽業(yè)的發(fā)展。近年養(yǎng)鴿業(yè)經(jīng)過穩(wěn)步發(fā)展，已逐步走向了成熟，但無論肉鴿廠還是種鴿廠，多殺性巴氏桿菌在各大養(yǎng)鴿廠也經(jīng)常被報道。鴿感染后常以急性型敗血癥為主要特征，發(fā)病率和死亡率都較高，在各地方呈散發(fā)性或地方流行性。小型養(yǎng)鴿廠尤為嚴(yán)重，所以對鴿巴氏桿菌病的診斷與防治是極其重要的。目前對多殺性巴氏桿菌病采取藥物治療進(jìn)行控制，但隨著抗菌藥物的不合理應(yīng)用，多殺性巴氏桿菌的耐藥范圍更廣，多重耐藥越來越嚴(yán)重[8]。2016年林志敏等[9]研究表明，多殺性巴氏桿菌的耐藥種類與質(zhì)粒攜帶特征可能有關(guān)，結(jié)果顯示近期治療禽霍亂可首選恩諾沙星、利福平、頭孢唑林等藥物。劉道泉等[10]的試驗結(jié)果表明，禽源多殺性巴氏桿菌質(zhì)粒的耐藥性可能與多黏菌素、利福平和左氧氟沙星的耐藥有關(guān)。于成接等[11]對分離出的一株A型巴氏桿菌進(jìn)行藥敏實驗，結(jié)果表明該菌株對痢特靈、氧氟沙星等藥物敏感，選用此種藥物治療效果較好。但多殺性巴氏桿菌的耐藥性受菌株的血清型、所攜帶的質(zhì)粒、環(huán)境等多種因素影響，所以當(dāng)發(fā)生巴氏桿菌病時，有必要進(jìn)行耐藥性分析，更合理、有效、安全的控制疫情。

表1 分離菌株的生化實驗結(jié)果

表2 藥敏試驗結(jié)果 mm

根據(jù)流行病調(diào)查、臨床癥狀、剖檢病理變化、實驗室檢查，確診該廠爆發(fā)鴿巴氏桿菌病(鴿霍亂)。為更好防控該病的發(fā)生，對分離出的菌株進(jìn)行了藥敏試驗，分析比較該菌株對各種常用藥物的敏感性，篩選出對該菌株所引起的鴿巴氏桿菌病最有治療效果的藥物。藥敏結(jié)果顯示證明：阿米卡星、慶大霉素等藥物對該菌株具有較強(qiáng)的抑制作用。鴿場選用上述藥物治療該次鴿群的巴氏桿菌病，取得了良好的臨床治療效果。

多殺性巴氏桿菌為條件性傳染病，一般不引起疾病，飼養(yǎng)管理不當(dāng)、應(yīng)激因素過多等因素導(dǎo)致鴿子抵抗力下降，會引起鴿巴氏桿菌病的爆發(fā)[12]。因此防治該類病害要采用綜合防控措施：平時要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，提高飼料營養(yǎng)質(zhì)量，改善鴿舍飼養(yǎng)環(huán)境；其次，每天定時檢查鴿群，及時發(fā)現(xiàn)病鴿，立即采取隔離措施，清除舍內(nèi)糞便及剩余飼料，保持鴿舍干燥、清潔衛(wèi)生。每日可使用滅菌凈、百毒殺等消毒劑，對鴿舍、鴿群及日常用具進(jìn)行噴霧消毒。最后要嚴(yán)格控制人員進(jìn)出，引進(jìn)新鴿時應(yīng)先隔離觀察再行正常飼喂。