揭英桃，林震嘉，張 珺，談 智，許雅南，熊 媖，唐 源，周利君

（中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院生理教研室//中山大學(xué)疼痛研究中心，廣東廣州 510080）

銀屑?。ㄋ追Q牛皮癬），是一種常見的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病，影響全球約1%～3%的人口［1］。約60%～90%銀屑病患者常感皮膚不適，如皮膚疼痛和慢性瘙癢［2］。其中瘙癢不僅是患者最常見的主觀感覺，也是最麻煩的癥狀之一，與牛皮癬的嚴重程度密切相關(guān)，影響患者的生活質(zhì)量和睡眠［3］。銀屑病瘙癢的病理生理機制尚不完全清楚，主要與精神壓力及神經(jīng)源性炎癥緊密相關(guān)。研究表明表皮感覺瘙癢相關(guān)的神經(jīng)纖維、表皮角質(zhì)形成細胞及真皮其他細胞釋放的神經(jīng)肽（如降鈣素基因相關(guān)肽CGRP）、促炎細胞因子（如TNF-α，IL-17）及瘙癢相關(guān)因子（如瞬時受體電位通道TRPV1）等均在銀屑病伴瘙癢的患者皮膚組織中明顯增加，為銀屑病瘙癢發(fā)生發(fā)展的重要因素［2，4］。傳統(tǒng)止癢療法（如抗組胺）對銀屑病瘙癢治療有限；臨床治療銀屑病的傳統(tǒng)藥物對瘙癢治療效果甚微，甚至加重［5］；而近年許可的生物制劑治療，如TNF-α 抑制劑、IL-17 抑制劑可快速有效地緩解瘙癢，但價格昂貴［6-7］。這使得銀屑病瘙癢的治療仍然具有挑戰(zhàn)，因此，需要進一步探討并研發(fā)專門針對銀屑病瘙癢等感覺不適的防治策略和藥物。L-茶氨酸（L-theanine）是茶葉（特別是綠茶）及部分菌菇所特有的一種非蛋白質(zhì)游離氨基酸［8］。已有不少研究證實L-茶氨酸具有多種生物學(xué)活性，如抗氧化、抗炎，能促進睡眠、抗焦慮、抗抑郁、改善認知、情緒和腦損傷等神經(jīng)保護以及促進術(shù)后恢復(fù)等作用［9-10］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)局部給藥L-茶氨酸可通過抑制內(nèi)皮細胞中性粒細胞的活化來改善急性皮炎［11］。但L-茶氨酸是否具有抑制銀屑病瘙癢的作用還沒有報道。因此，本研究將初步探討L-茶氨酸對小鼠銀屑病瘙癢的防治效果及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8～10 周齡雌性SPF 級C57BL/6J 小鼠（18～20 g）56只，3～5周齡小鼠25只，購于中山大學(xué)實驗動物中心（廣州）。生產(chǎn)許可證：SCXK（粵）2016-0029；使用許可證：SYXK（粵）2017-0081。動物飼養(yǎng)于安靜無噪音、人工晝夜節(jié)律環(huán)境中，相對濕度為40%～70%，溫度為20～26 ℃。動物分籠飼養(yǎng)，自由飲水、進食，每籠5～6 只，并用耳標標識。所有籠具、飼料、飲水、墊料均嚴格消毒。動物的使用協(xié)議和動物處理程序獲得了中山大學(xué)實驗動物管理與使用委員會（IACUC）的批準。

1.2 主要試劑

本實驗用到的試劑和抗體如下：用作銀屑病模型制作的咪喹莫特乳膏（艾達樂，美國3M 公司）；L-茶氨酸（T9280，索萊寶）；細胞培養(yǎng)用的咪喹莫特（1338313，美國藥典委員會USP）；異氟烷（瑞沃德）；rabbit anti-β3-tubulin（D71G9，CST 公司）；rabbit anti-TRPV1（ab10296，abcam 公司）；mouse antiβ-actin（3700s，CST 公 司）；mouse anti-TNF-α（ab1793 for IF；ab8248 for WB；abcam 公司）；goat anti-CGRP（ab36001，abcam 公司）。免疫熒光實驗的二抗：Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555（A31570），Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 647（A31573），Donkey anti-Goat Alexa Fluor 555（A21432），Donkey anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488（A21206），均來自Life Technologies 公司。免疫印跡實驗的二抗：Donkey Anti-Mouse IgG H&L（HRP）（ab6820），Donkey Anti-Rabbit IgG H&L（HRP）（ab6802），均來自abcam公司。

1.3 小鼠銀屑病模型制作及L-茶氨酸溶液配制與給藥

按文獻所述，使用咪喹莫特軟膏（IMQ）制作小鼠銀屑病瘙癢模型［12-13］。提前3 d用剃毛刀將小鼠背部毛發(fā)剃除，實驗開始時（0 d）于每只小鼠背部2.0 cm×3.0 cm 皮膚涂抹62.5 mg IMQ，每間隔24 h涂抹1次，連續(xù)涂抹至取材當天，共涂抹5次。

L-茶氨酸皮膚局部給藥濃度參照我們前期局部給予不同濃度L-茶氨酸緩解急性皮炎的研究［11］。首先將L-茶氨酸溶于50%丙酮水溶液，分別配成0、50、125、250 mmol/L 的溶液。溶劑對照（Vehi）為單純的50%丙酮水溶液。L-茶氨酸溶液或溶劑對照組每天2 次，第1 次是IMQ 涂藥前30 min皮損局部先給L-茶氨酸溶液100μL，12 h 后再在皮損局部給藥1次，連續(xù)給藥至取材當天。

參考以前小鼠口服L-茶氨酸的研究給藥濃度（4～200 mg/kg?d）［14-15］，選擇中間劑量為每天給藥量為10 mg/kg。具體按照小鼠每天飲水量（約6 mL），16.7 mg L-茶氨酸加入500 mL 水中配成小鼠飲用水（濃度為3.33%）。

1.4 自發(fā)性行為學(xué)分析

實驗前，在異氟烷短暫麻醉下用電動剃毛機將動物背部的毛提前剃除，暴露出背部皮膚，讓動物適應(yīng)無毛狀態(tài)。再將動物每天放入單獨、透明的亞克力測試盒（14 cm×18 cm×12 cm）中2 h 用以適應(yīng)測試的環(huán)境（相對濕度為40%～70%，溫度為20～26 ℃），適應(yīng)時間至少3 d。給藥處理4 h后，采用攝像機正對著亞克力測試盒上方拍攝觀察小鼠30 min。參照文獻［16］，小鼠自發(fā)性行為學(xué)可分為：①后肢抓撓（hind paw scratching）：當小鼠后爪伸向給藥的背部搔抓至放回地面或者嘴里算1 次事件；②舔或咬（biting/licking）：當小鼠嘴和鼻子接觸到給藥的背部直至回頭或者執(zhí)行其他行為算1 次事件；③畏縮（flinching）：當小鼠旋轉(zhuǎn)或者抖動給藥背部算1次事件。3種不同小鼠自發(fā)性行為學(xué)數(shù)據(jù)均由兩位不清楚實驗分組的測試者分開分析后取均值所得。

1.5 免疫熒光實驗

造模4.5 d 后，10%烏拉坦溶液腹腔注射麻醉小鼠后，先后用0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS）和40 g/L 多聚甲醛溶液灌注后取材給藥處理的背部皮膚，經(jīng)過PFA 后固定和30%蔗糖脫水沉底后，冰凍切片（16μm）。加入5%驢血清封閉1 h，吸走封閉液，加入一抗（TNF-α，β3-tublin，CGRP，比例為1：500），放入4 ℃搖床慢搖過夜。吸走一抗，用PBS清洗3次，每次10 min，然后加入二抗搖床孵育1 h，PBS清洗3次，每次10 min。封片，拍攝。

1.6 免疫印跡法

取材藥物處理的皮膚，液氮低溫下研磨提取蛋白后定量并且加入上樣緩沖液沸水煮5 min，電泳條件為濃縮膠60 V 跑30 min，分離膠120 V 跑60 min。使用甲醇活化過的0.22 μm PVDF 膜進行轉(zhuǎn)膜，電轉(zhuǎn)條件為300 mA，90 min。轉(zhuǎn)膜期間注意保持轉(zhuǎn)膜裝置低溫。蛋白膜經(jīng)5%脫脂牛奶室溫封閉1 h 后再在4 ℃環(huán)境下與一抗輕搖孵育過夜；然后經(jīng)二抗抗體孵育1 h 后，用超敏ECL（Millipore 公司）化學(xué)發(fā)光液顯色。Tanon-5200 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Tanon 科技公司）曝光，再經(jīng)CCD 攝像頭拍攝顯影條帶，ImageJ對圖像進行光密度分析。

1.7 背根神經(jīng)節(jié)細胞培養(yǎng)

參考本實驗室背根神經(jīng)節(jié)（DRG）培養(yǎng)技術(shù)［17］，二氧化碳麻醉安樂死C57BL/6小鼠（3～5 周），取雙側(cè)背根神經(jīng)節(jié)解剖轉(zhuǎn)移至DMEM/F12（GIBCO）。剪碎后，加入5 mL 膠原酶（3 mg，C9891 sigma）和胰蛋白酶（2 mg，T9201，sigma）混合溶液消化（37 ℃，約25 min），然后加入相同體積的完全培養(yǎng)基（DMED/F12+100 mL/L 胎牛血清+1%青霉素和鏈霉素，GIBCO）結(jié)束消化，離心，棄上清，重懸后接種在0.01%多聚-L-賴氨酸（PLL，P4832，sigma）包被的48 孔板中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)液為：DMEM/F12 +100 mL/L 胎牛血清+1%青霉素和鏈霉素+1%谷氨酰胺（200 mmol/L，G7513，sigma）。接種24 h 后，加入阿糖胞苷（濃度為5μmol/L，指培養(yǎng)液終濃度，下面藥物相同）。48 h 后更換細胞培養(yǎng)液，2 h 后加入50 或500μmol/L L-THN 和IMQ（0.2μg/mL）。THN和IMQ 每天加1 次，共加2 d。培養(yǎng)第4 d 后，40 g/L多聚甲醛固定細胞進行免疫熒光染色。

1.8 實驗分組及設(shè)計

1.8.1 觀察小鼠自發(fā)性行為實驗 56 只C57BL/6小鼠分為7 組，分別為溶劑軟膏對照組（Vehi）、250 mmol/L L-茶氨酸局部給藥對照組（250 mmol/L TTHN）；模型組（Vehi+IMQ）、10 mg/kg?d L-茶氨酸口服治療組（10 mg/kg O-THN+IMQ）、以及50、125、250 mmol/L L-茶氨酸局部給藥治療組（50、125、250 mmol/L T-THN+IMQ），每組各8 只。各組在每次IMQ給藥4 h后進行30 min自發(fā)性行為學(xué)視頻拍照。造模4.5 d 取材，一部分動物取材用作免疫熒光實驗（IF），一部分動物用作免疫印跡實驗（WB）。

1.8.2 背根神經(jīng)節(jié)（DRG）細胞培養(yǎng)實驗 25 只C57BL/6 小鼠（3～5 周齡）用于原代DRG 神經(jīng)元培養(yǎng)。細胞實驗為5 組：對照組（CON）、單純L-茶氨酸對照（500 μmol/L THN）、模型組（Vehi+IMQ）、50 μmol/L 給藥組（50 μmol/L THN+IMQ）、500μmol/L給藥組（500μmol/L THN+IMQ）；重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

免疫熒光（IF）和免疫印跡（WB）結(jié)果采用image J軟件測量熒光灰度值，其中神經(jīng)纖維的長度通過Neuron J 插件測量。所有數(shù)據(jù)為正態(tài)分布的計量結(jié)果，以均值± 標準誤（Mean ± SEM）表示。采用SPSS 20 軟件進行多組數(shù)據(jù)比較，圖2-4 數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊時one-way ANOVA，事后用Tukey HSD 法進行兩兩比較；若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布但方差不齊時采用Welch's ANOVA，事后用Tamhane's T2 進行兩兩比較。圖1 行為學(xué)結(jié)果的統(tǒng)計采用two-way ANOVA，事后采用Least Significance Difference（LSD）法進行兩兩比較每個時間點的各組數(shù)據(jù)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 茶氨酸局部應(yīng)用緩解咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病瘙癢自發(fā)性行為

我們前期研究發(fā)現(xiàn)L-茶氨酸局部應(yīng)用能明顯緩解佛波酯（TPA）誘導(dǎo)的急性皮炎［11］，但L-茶氨酸是否具有抗銀屑病瘙癢作用還不清楚。以前的研究顯示在IMQ誘導(dǎo)小鼠銀屑病模型中，可通過觀察后爪抓撓（hind paw scratching）［13］或咬/舔（biting/licking）、畏縮（flinching）［16］等自發(fā)性行為次數(shù)來體現(xiàn)皮膚瘙癢等感覺不適癥狀的變化。因此，本研究首先采用這些自發(fā)性行為學(xué)來觀察口服或皮膚局部L-茶氨酸處理對小鼠銀屑病瘙癢的防治效果。與2019 年Kodji 等觀察結(jié)果一致［16］，我們發(fā)現(xiàn)IMQ誘導(dǎo)的銀屑病模型組中小鼠后爪抓撓沒有明顯變化，但咬/舔和畏縮兩種行為學(xué)在IMQ 給藥第2 d 4 h 后明顯增加，并時程性遞增至4 d 4 h 實驗結(jié)束（圖1，紅色）。L-茶氨酸口服給藥組（10 mg/kg OTHN+IMQ，黃綠色）不能明顯降低IMQ 誘導(dǎo)的小鼠自發(fā)性行為，表明這個劑量的口服L-茶氨酸對銀屑病瘙癢無明顯治療效果。驚奇的是，局部給予L-茶氨酸處理從2 d 4 h 起能明顯抑制IMQ 引起的咬/舔和畏縮兩種行為學(xué)的增加，并呈現(xiàn)濃度依賴性抑制（50 mmol/L T-THN +IMQ，淺綠色；125 mmol/L T-THN+IMQ，綠色；250 mmol/L T-THN +IMQ，深綠色）。250 mmol/L L-茶氨酸改善IMQ 誘導(dǎo)小鼠銀屑病瘙癢行為效果最明顯（深綠色），但對正常小鼠搔抓行為無影響（250 mmol/L T-THN Contr，藍色）。這些結(jié)果表明L-茶氨酸局部應(yīng)用具有濃度依賴性抗銀屑病瘙癢作用。在后續(xù)實驗中，我們將選擇10 mg/kg 口服L-茶氨酸治療組（OTHN+IMQ）和250 mmol/L L-茶氨酸局部治療組（T-THN+IMQ）進行機制探討。

2.2 茶氨酸局部應(yīng)用明顯抑制咪喹莫特誘導(dǎo)的TNF-α表達上調(diào)

鑒于致炎細胞因子TNF-α 在銀屑病炎癥發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵地位［18-20］，我們接著從是否影響TNF-α 表達來探討L-茶氨酸抗瘙癢作用是由抗炎作用所致。與臨床銀屑病皮膚和IMQ 誘導(dǎo)小鼠銀屑病皮膚中TNF-α 局部高表達一致［21］，我們小鼠銀屑病模型4.5 d 的皮膚TNF-α 表達顯著上調(diào)：表皮層中也有明顯增加，但主要彌漫表達在真皮層（圖2A、B）?？诜o藥L-茶氨酸能輕微抑制真皮層乳頭部高表達的TNF-α，但對表皮層及真皮層結(jié)締組織層的TNF-α 無明顯作用。而皮損皮膚局部給予250 mmol/L L-茶氨酸能廣泛抑制表皮和真皮層上調(diào)的TNF-α（圖2A、B）。這一結(jié)果也被免疫印跡法（WB）證實（圖2C、D）：口服L-茶氨酸對IMQ誘導(dǎo)的皮膚TNF-α 三聚體和單體的表達上調(diào)無明顯影響，但局部應(yīng)用能顯著降低兩種形式的TNF-α表達。這些結(jié)果表明L-茶氨酸局部應(yīng)用能顯著抑制IMQ 受損皮膚TNF-α 上調(diào)，具有局部慢性抗炎作用。

2.3 局部應(yīng)用茶氨酸顯著抑制咪喹莫特誘導(dǎo)的神經(jīng)末梢異常生長

圖1 L-茶氨酸預(yù)處理對IMQ誘導(dǎo)小鼠銀屑病模型自發(fā)性行為時程變化的影響Fig.1 The time course for the changes in spontaneous behaviors in imiquimod-induced mouse psoriasis model with or without L-theanine pretreatment

從臨床和小鼠銀屑病模型獲得的證據(jù)表明，表皮神經(jīng)纖維的過度生長是銀屑病瘙癢的重要原因之一［16，22-23］，因此，抑制感覺神經(jīng)以及瞬時受體電位（TRP）通道（TRPV1、TRPA1）—神經(jīng)肽（CGRP，P物質(zhì)）通路就能緩解銀屑病瘙癢等皮膚不適的自發(fā)性行為［16］。我們發(fā)現(xiàn)IMQ 誘導(dǎo)銀屑病模型4.5 d 的小鼠皮膚中β3-tubulin 陽性神經(jīng)纖維長度顯著增加，尤其在表皮以及表皮真皮交界處（圖3A、B）。皮膚局部單純給予L-茶氨酸（T-THN）對神經(jīng)末梢的生長無明顯影響。與IMQ 組相比，L-茶氨酸口服（O-THN+IMQ）能輕微抑制神經(jīng)纖維的長度，但局部給藥組（T-THN+IMQ）對神經(jīng)纖維異常生長的抑制效果顯著，明顯強于口服給藥組。不過，其神經(jīng)纖維長度也并未恢復(fù)到對照水平。以上結(jié)果表明L-茶氨酸局部應(yīng)用顯著抑制IMQ 誘導(dǎo)的神經(jīng)末梢異常生長，而口服L-茶氨酸有輕度抑制作用。

此外，我們檢測皮膚中TRPV1 表達來進一步驗證L-茶氨酸對瘙癢的調(diào)控作用。Western blot 結(jié)果顯示與對照皮膚相比，IMQ 模型皮膚中TRPV1表達顯著上調(diào)，而L-茶氨酸口服（O-THN）或局部給藥（T-THN）都能明顯抑制TRPV1 的上調(diào)（圖3C、D）。

2.4 茶氨酸抑制咪喹莫特誘導(dǎo)的體外背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)纖維異常生長

由于L-茶氨酸抑制皮膚TRPV1的上調(diào)與改善銀屑病瘙癢自發(fā)行為學(xué)并無相關(guān)性，因此，我們采用小鼠原代DRG 神經(jīng)元細胞培養(yǎng)來進一步驗證L-茶氨酸對神經(jīng)纖維異常生長是否具有直接抑制作用。在DRG 培養(yǎng)2 d 的培養(yǎng)液中加入0.2 μg/mL IMQ（Vehi+IMQ）再培養(yǎng)2 d 后能明顯誘導(dǎo)DRG CGRP 陽性（圖4A）和β3-tubulin 陽性（圖4B）神經(jīng)纖維的過度生長。單純500μmol/L L-茶氨酸（500μmol/L THN）對正常神經(jīng)元纖維的生長沒有影響，但與IMQ 同時給予的50、500 μmol/L L-茶氨酸能明顯抑制IMQ 引起的CGRP+，β3-tubulin+DRG 神經(jīng)突起的異常生長，并呈現(xiàn)濃度依賴性（圖4A～C）。因此，L-茶氨酸可通過抑制外周感覺神經(jīng)纖維的異常生長緩解銀屑病瘙癢。

圖2 L-茶氨酸局部預(yù)處理抑制IMQ誘導(dǎo)的皮膚TNF-α高表達Fig.2 Topical pretreatment of L-theanine inhibits IMQ-induced TNF-α over-expression in the lesional skin

3 討論

銀屑病是一種常見的慢性自身炎癥性皮膚病，患者常感覺皮膚瘙癢等不適［2］。目前，大量藥物都針對銀屑病的炎癥反應(yīng)，很少有藥物專門用于治療銀屑病引發(fā)瘙癢等不舒適感覺。

3.1 咪喹莫特誘導(dǎo)瘙癢行為學(xué)評判方法的選擇

瘙癢是一種主觀感覺，動物的瘙癢只能通過觀察實驗動物自主行為來獲得。2016年Sakai等［13］首次在小鼠銀屑病模型上報道自發(fā)后爪抓撓（hind paw scratching）和觸誘發(fā)抓撓的癢覺異化（alloknesis）。小鼠背部給予62.5 mg IMQ 1 d后就出現(xiàn)后爪抓撓行為次數(shù)明顯增多，第2 天出現(xiàn)癢覺異化，均可持續(xù)至7 d 實驗結(jié)束。2019 年Kodji 等［16］發(fā)現(xiàn)只有部分小鼠背部給予75 mg IMQ 第3、4天后出現(xiàn)自發(fā)爪抓撓行為增多，而咬/舔和畏縮兩種行為卻能穩(wěn)定在IMQ 第2 天4 h 顯著增多，并隨著造模時間延長而呈遞增趨勢。本研究觀察IMQ 小鼠銀屑病模型3 種自發(fā)性行為變化結(jié)果與Kodji 等報道基本一致（圖1），無明顯自發(fā)性后爪抓撓瘙癢行為可能是因為IMQ涂抹在背部皮膚，小鼠后爪抓撓不到所致。這與臨床銀屑患者瘙癢癥狀類似：因皮損范圍較大，患者并不表現(xiàn)過多的抓撓等瘙癢行為，而感到皮膚疼痛和不適，主訴有燒灼和刺痛感［2］。因此，采用咬/舔和畏縮兩種自發(fā)性行為更適合用來檢測小鼠銀屑病模型的皮膚不適表現(xiàn)。

3.2 L-茶氨酸抑制銀屑病瘙癢的作用機制

圖3 L-茶氨酸對IMQ所致皮膚損傷神經(jīng)纖維末梢異常生長及TRPV1過表達的抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of L-theanine on the abnormal growth of nerve endings and TRPV1 over-expression in the lesional skin induced by IMQ

銀屑病瘙癢發(fā)生率較高，但其發(fā)病機制尚不完全清楚。已知皮膚局部的炎癥反應(yīng)和傳遞癢覺的神經(jīng)通路的異常變化共同介導(dǎo)銀屑病瘙癢的發(fā)病過程［2］。銀屑病患者皮膚中各種細胞（如T細胞、角質(zhì)形成細胞、樹突狀細胞，肥大細胞、巨噬細胞等）高表達的促炎細胞因子TNF-α 觸發(fā)IL-23/Th17 通路在銀屑病的發(fā)病機制中起著至關(guān)重要的作用［5，24］。故此，3種TNF-α抑制劑英夫利昔單抗、阿達單抗和依那西普已成為臨床治療銀屑病炎癥及其瘙癢的有效手段［5］。此外，瘙癢感覺在受損皮膚產(chǎn)生后需通過癢覺神經(jīng)通路傳遞至大腦。臨床銀屑病瘙癢表皮和真皮乳頭處感覺神經(jīng)纖維增多［16，23］，在受到刺激（內(nèi)源性或外源性）后神經(jīng)末梢分泌的各種神經(jīng)肽（CGRP），直接或間接作用于神經(jīng)，引起或加重銀屑病的瘙癢程度。銀屑病瘙癢患者血漿CGRP 水平較高，與瘙癢的嚴重程度相關(guān)［3，25］；CGRP 受體也在銀屑病皮膚中存在，并與瘙癢的嚴重程度相關(guān)［26］?；蚯贸杏X神經(jīng)元中的CGRP 可改善小鼠的瘙癢［27］，表明CGRP 可能參與增強瘙癢。臨床和小鼠銀屑病模型中化學(xué)或手術(shù)切除小直徑的感覺神經(jīng)/痛覺感受器有利于緩解銀屑病患者的感覺不適［28-29］。Kodji 等［16］用化學(xué)方法選擇性消耗小直徑的痛覺感受器不僅能緩解銀屑病樣紅斑和皮膚炎癥，還能改善瘙癢等自發(fā)性行為。但通過遺傳學(xué)和藥理學(xué)方法阻斷TRPV1、TRPA1 和神經(jīng)肽（P 物質(zhì)和CGRP）的共同感覺神經(jīng)源性機制可抑制瘙癢行為，但不能抑制炎癥。這提示TRP-神經(jīng)肽通路在引起皮膚不適方面的關(guān)鍵作用，而銀屑病的持續(xù)炎癥相對更為復(fù)雜。因而，神經(jīng)末梢的異常生長以及CGRP 的表達可用作瘙癢的形態(tài)學(xué)指標和機制探討。

圖4 L-茶氨酸抑制IMQ誘導(dǎo)的原代DRG神經(jīng)元軸突的異常生長Fig.4 L-theanine suppresses the abnormal neurite outgrowth induced by IMQ in primary cultured DRG neurons

與以往研究一致［16，23］，我們的結(jié)果不僅顯示IMQ 誘導(dǎo)的小鼠銀屑病模型瘙癢行為增加（圖1），而且皮損皮膚中TNF-α 廣泛性表達、TRPV1 以及神經(jīng)元特異性標志物β3-tublin 陽性感覺神經(jīng)纖維長度都顯著增多（圖2，3），表明IMQ 誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣瘙癢模型成功，其發(fā)病機制與局部炎癥和感覺神經(jīng)纖維密度增加有關(guān)。皮膚局部給予L-茶氨酸能濃度依賴性減少IMQ 誘導(dǎo)的咬/舔和畏縮兩種自發(fā)性行為，尤以250 mmol/L L-茶氨酸效果最明顯（圖1）。機制上，我們發(fā)現(xiàn)皮膚局部給予L-茶氨酸不僅能顯著抑制IMQ 引起的TNF-α 表達上調(diào)（圖2），也能明顯阻斷感覺神經(jīng)纖維異常生長（圖3）。與L-茶氨酸局部給藥相比，口服茶氨酸不能顯著抑制銀屑病瘙癢行為、局部皮損皮膚TNF-α的高表達以及神經(jīng)纖維的異常生長（圖1～3）。綜合這些結(jié)果提示：①皮損局部TNF-α 的高表達和神經(jīng)纖維的異常生長是銀屑病瘙癢的重要原因；②茶氨酸局部給藥可通過抑制皮損皮膚TNF-α 表達以及感覺神經(jīng)纖維異常生長兩個方面的機制來緩解銀屑病瘙癢；③10 mg/kg?d L-茶氨酸劑量明顯達不到受損皮膚局部高濃度狀態(tài)，因而對銀屑病瘙癢無明顯效果。這也間接證實L-茶氨酸對銀屑病瘙癢的治療呈明顯劑量依賴性效應(yīng)。我們采用成年小鼠原代DRG 神經(jīng)元培養(yǎng)進一步證實L-茶氨酸對感覺神經(jīng)軸突異常生長的濃度依賴性抑制作用（圖4）。

L-茶氨酸抑制瘙癢行為現(xiàn)象與皮膚TRPV1 蛋白表達并無相關(guān)性。這可能與皮損部位表達TRPV1蛋白的細胞很雜所致［30］。因此，我們認為皮膚TRPV1表達不適合用作瘙癢的機制探討。

綜上所述，我們率先證明L-茶氨酸不僅能抑制IMQ 誘導(dǎo)小鼠銀屑病模型炎性因子TNF-α 的表達上調(diào)，還能通過抑制C 纖維神經(jīng)末梢異常增長來抑制銀屑病瘙癢癥狀。因此，L-茶氨酸有望成為治療銀屑病瘙癢的潛在小分子藥物，具有良好的臨床轉(zhuǎn)化前景。L-茶氨酸緩解銀屑病炎癥和瘙癢的具體機制還有待進一步深入探討。