蘇焜儀，胡安娣娜，陳珠婷，連 玉，呂 林，胡 潔

（中山大學(xué)中山眼科中心//眼科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510060）

血管生成是指從現(xiàn)有的血管系統(tǒng)中形成新的血管［1］。血管閉塞、血管生長(zhǎng)不足和高血糖導(dǎo)致的視網(wǎng)膜缺氧被確定為病理性血管形成的主要誘因，表現(xiàn)為血-視網(wǎng)膜屏障（blood-retinal barrier，BRB）破壞、視網(wǎng)膜微血管滲漏等。如何保護(hù)BRB 成為研究的熱點(diǎn)。近來研究發(fā)現(xiàn)，血脂升高是糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）的危險(xiǎn)因素之一［2-3］。其中，高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）水平與DR 的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)［4］。HDL 及其主要成分載脂蛋白A1（Apolipoprotein A1，apoA1），病理狀態(tài)下具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、脂肪內(nèi)逆行轉(zhuǎn)運(yùn)、抗氧化、抗炎等作用［5-9］。我們前期實(shí)驗(yàn)顯示PDR 患者血清載脂蛋白A1（apoA1）水平降低；體內(nèi)外apoA1 均能促進(jìn)occludin的表達(dá)，提示apoA1具有保護(hù)視網(wǎng)膜屏障的作用，論文待發(fā)表。apoA1是否對(duì)視網(wǎng)膜血管生成有影響尚未有研究報(bào)道。視網(wǎng)膜成像系統(tǒng)是一種非侵入性的眼科學(xué)成像技術(shù)，它使視網(wǎng)膜血管可視化，可用于研究視網(wǎng)膜血管發(fā)育生長(zhǎng)和血管結(jié)構(gòu)的完整性［10］，評(píng)估血管滲漏和新生血管生成的情況，如對(duì)氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變（oxygen-induced retinopathy，OIR）模型以及健康的小鼠視網(wǎng)膜進(jìn)行無創(chuàng)體內(nèi)活體評(píng)估。本研究擬采用小鼠視網(wǎng)膜成像系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)視網(wǎng)膜血管的可視化，實(shí)時(shí)觀察apoA1是否會(huì)影響生理?xiàng)l件及缺氧環(huán)境下的小鼠視網(wǎng)膜血管，從而全面評(píng)估apoA1對(duì)小鼠視網(wǎng)膜血管的作用。

1 材料與方法

本實(shí)驗(yàn)所用SPF 級(jí)C57/BL6J 小鼠均從廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買，所用apoA1+/+鼠（品系名稱：C57BL/6 Tg（APOA1）1Rub/J）及apoA1-/-小鼠（品系名稱：B6.129P2-Apoa1tm1Unc/J）均從Jackson Lab購買，國(guó)內(nèi)上海南方模式生物科技有限公司凈化成SPF 級(jí)小鼠后，飼養(yǎng)于中山大學(xué)中山眼科中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)飼養(yǎng)間，飼養(yǎng)間內(nèi)濕度控制在40%～70%，溫度控制在（21 ± 1）°C，水及食物充足。本實(shí)驗(yàn)所用所有的動(dòng)物均遵守視覺與眼科學(xué)研究學(xué)會(huì)（ARVO）協(xié)定中動(dòng)物使用原則，并且經(jīng)過中山大學(xué)中山眼科中心動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，未檢測(cè)出微生物。

1.1 研究對(duì)象

常氧組研究對(duì)象分3 大組：①健康SPF 級(jí)C57BL/6 Tg（APOA1）1Rub/J 小鼠組（apoA1基因過表達(dá)小鼠，簡(jiǎn)稱：apoA1+/+）；②健康SPF 級(jí)B6.129P 2-Apoa1tm1Unc/J 小鼠組（apoA1基因敲除小鼠，簡(jiǎn)稱：apoA1-/-）；③對(duì)照組：健康SPF 級(jí)C57/BL6J 小鼠組（正常對(duì)照組，簡(jiǎn)稱：normal）。選擇時(shí)間點(diǎn)，分3組：①第17天末（幼年鼠）；②8周齡（成年鼠）；③20周齡（中老年鼠）。各組各時(shí)間點(diǎn)小鼠樣本量5 只，常氧組總樣本量為45只。

缺氧組研究對(duì)象分3 大組：①C57BL/6 Tg（APOA1）1Rub/J 小鼠OIR 模型組（apoA1轉(zhuǎn)基因小鼠OIR 模型，簡(jiǎn)稱：apoA1+/+OIR）；②B6.129P2-Apoa1tm1Unc/J 小鼠OIR模型組（apoA1基因敲除小鼠OIR 模型，簡(jiǎn)稱：apoA1-/-OIR）；③對(duì)照組：C57/BL6J小鼠OIR模型組（簡(jiǎn)稱：normal OIR）。

取P7 的C57BL/6 乳鼠、apoA1+/+乳鼠及apoA1-/-乳鼠進(jìn)行造模，即OIR 模型。具體做法：放入含氧體積分?jǐn)?shù)為75%的飼養(yǎng)箱中，P12 再將其放回正常室內(nèi)空氣中飼養(yǎng)5 d，所有動(dòng)物皆飼養(yǎng)于屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中。選擇時(shí)間點(diǎn)：小鼠出生后第17天末。各分組小鼠樣本量5只，缺氧組總樣本量為15只。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白質(zhì)免疫印跡 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot，WB）法首先剝出視網(wǎng)膜組織，用200 μL RIPA 緩 沖 液+1/100 PMSF，在4 ℃條 件 下 作 用30 min，提取蛋白。以轉(zhuǎn)速12 000×g在4 ℃條件低溫離心20 min，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。在10%的SDS-丙烯酰胺凝膠上樣30 μg 蛋白進(jìn)行電泳。電泳后，將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF 膜。常溫下用5%脫脂牛奶在TBST 緩沖液（5 mmol/L）中封閉1 h，阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)。用apoA1（鼠抗，1：1 000）和GAPDH（兔抗，1：1 000）于4 ℃過夜。用TBST 洗膜，每次10 min，需洗3 次。分別用對(duì)應(yīng)種屬的二抗（1：1 000）室溫下孵育二抗1 h。用TBST洗膜，每次10 min，需洗3 次。1：1 加入曝光液A 和B，在凝膠成像儀內(nèi)曝光。

1.2.2 小鼠體質(zhì)量記錄 在活體情況下進(jìn)行，記錄各組各時(shí)間點(diǎn)的小鼠的體質(zhì)量，取平均值后進(jìn)行比較。

1.2.3 活體眼底照相 應(yīng)用Micron Ⅳ攝像系統(tǒng)（Phoenix Research Laboratories，San Ramon，CA），取各組各時(shí)間點(diǎn)的小鼠，35%水合氯醛（注射劑量為0.1 mL/10 g）腹腔下注射進(jìn)行全身麻醉，麻醉后再固定小鼠，利用復(fù)方托吡卡胺滴眼液給小鼠眼睛散瞳，右旋糖酐羥丙甲纖維素滴眼液保護(hù)角膜，調(diào)整進(jìn)光角度，進(jìn)行小鼠活體眼底照相。

1.2.4 熒光眼底血管造影 小鼠活體眼底照相后，腹腔下注射10%熒光素鈉（注射劑量為0.1 mL/10 g）后，行熒光眼底血管造影（fundus fluorescein angiography，F(xiàn)FA），活體觀察視網(wǎng)膜血管的變化。在活體狀態(tài)下觀察到迂曲和擴(kuò)張的視網(wǎng)膜血管，同時(shí)留意無灌注區(qū)，對(duì)視網(wǎng)膜血管病變可進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)。采用AngioTool 軟件分析視網(wǎng)膜的血管密度、孔隙率、連接點(diǎn)個(gè)數(shù)。血管密度定義為血管面積與總體面積之比，它能夠反映視網(wǎng)膜微血管的改變，體現(xiàn)血-視網(wǎng)膜屏障破壞的嚴(yán)重程度?？紫堵识x為孔隙體積占總體體積的百分比，它反映血管的不均勻性，間接反映無灌注區(qū)的大小。連接點(diǎn)個(gè)數(shù)則指分析圖片范圍內(nèi)血管分支點(diǎn)的個(gè)數(shù)，間接反映視網(wǎng)膜血管的分支生成情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 6 及SPSS 24 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布且方差齊性的數(shù)據(jù)，對(duì)單因素變量資料采用One-way ANOVA 單因素方差分析，總的方差分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)采用Bonferroni法進(jìn)行兩兩比較。對(duì)雙因素變量資料采用Twoway ANOVA 雙因素方差分析法，總的方差分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)兩兩比較采用Bonferroni 法。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 提前驗(yàn)證性試驗(yàn)

為了驗(yàn)證動(dòng)物模型的有效性，我們通過Western Blot 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（單因素方差分析），組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=739.19，P＜0.000 1，n=3；圖1），采用Bonferroni 法作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)正常組與apoA1+/+組、正常組與apoA1-/-組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1）。驗(yàn)證apoA1+/+小鼠apoA1過表達(dá)，apoA1-/-小鼠已缺失apoA1，為后續(xù)研究結(jié)果的可信性奠定了基礎(chǔ)。

圖1 小鼠肌肉apoA1含量統(tǒng)計(jì)圖Fig.1 The relative expression of apoA1 in various mice muscle

2.2 各組各時(shí)間點(diǎn)的小鼠的平均體質(zhì)量

在正常生理?xiàng)l件下，各組小鼠在不同年齡段均符合正常小鼠正常曲線（表1），apoA1基因的過表達(dá)及敲除情況不影響小鼠的正常發(fā)育。

表1 各組各時(shí)間點(diǎn)的小鼠的平均體質(zhì)量Table 1 Average weight of mice at each time point in each group （，g，n=5）

表1 各組各時(shí)間點(diǎn)的小鼠的平均體質(zhì)量Table 1 Average weight of mice at each time point in each group （，g，n=5）

2.3 正常生理?xiàng)l件下小鼠視網(wǎng)膜成像系統(tǒng)對(duì)小鼠視網(wǎng)膜血管結(jié)構(gòu)評(píng)價(jià)

2.3.1 小鼠眼底照相 在正常生理?xiàng)l件下，3 種小鼠不同時(shí)期主要血管自視盤發(fā)出，呈放射狀分枝形態(tài)，血管徑直。中周部視網(wǎng)膜血管管徑逐漸均勻變細(xì)，大血管在走形過程中逐級(jí)發(fā)出分支血管，分支血管呈紋理狀銜接良好（圖2）。

圖2 生理?xiàng)l件下3種小鼠不同時(shí)期眼底照相情況Fig.2 Fundus photography of three kinds of mice in different periods under physiological condition

2.3.2 小鼠熒光造影 在正常生理?xiàng)l件下，3 種小鼠不同時(shí)期主要血管自視盤發(fā)出，呈放射狀分枝形態(tài)，血管徑直。周邊部視網(wǎng)膜內(nèi)層血管呈樹葉脈絡(luò)樣分支及均勻走形，灌注良好，細(xì)小血管分支直達(dá)周邊部。視網(wǎng)膜血管無明顯無灌注區(qū)及熒光滲漏等表現(xiàn)（圖3A）。血管密度（圖3B）經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（雙因素方差分析法），組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.72，P血管密度=0.59，P＞0.05，n=5）?？紫堵剩▓D3C）經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（雙因素方差分析法），組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.84，P孔隙率=0.52，P＞0.05，n=5）。采用Bonferroni 法作兩兩比較，各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。連接點(diǎn)個(gè)數(shù)（圖3D）經(jīng)單因素方差分析法，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.236，P連接點(diǎn)個(gè)數(shù)=0.797，P＞0.05，n=5）。

2.4 病理?xiàng)l件（缺氧）下小鼠視網(wǎng)膜成像系統(tǒng)對(duì)小鼠視網(wǎng)膜血管結(jié)構(gòu)評(píng)價(jià)

2.4.1 小鼠眼底照相 造OIR 模型后，3 種小鼠視網(wǎng)膜均出現(xiàn)主要血管明顯迂曲擴(kuò)張、串珠樣改變，部分區(qū)域可見片狀出血，提示造模成功。3 種小鼠OIR 模型中，主要?jiǎng)用}、靜脈迂曲擴(kuò)張程度無明顯差異（圖4）。

圖3 生理?xiàng)l件下3種小鼠不同時(shí)期熒光造影情況及統(tǒng)計(jì)圖Fig.3 Fundus fluorescein angiography of three kinds of mice in different periods under physiological condition and their statistical graphs

圖4 缺氧狀態(tài)下P17的小鼠OIR模型眼底照相情況Fig.4 Fundus photography of OIR model of P17 in the three kinds of mice under hypoxia state

2.4.2 小鼠熒光造影 缺氧狀態(tài)下，3 種小鼠視網(wǎng)膜均出現(xiàn)中央?yún)^(qū)域無灌注區(qū)形成，血管明顯迂曲擴(kuò)張、串珠樣改變，毛細(xì)血管分布不均（圖5A）。中央視盤呈高熒光狀態(tài)，腹腔下注射造影劑1 min后，部分區(qū)域可見不同程度的片狀熒光滲漏。其中，無灌注區(qū)面積比較：apoA1-/-OIR ＞正常小鼠OIR ＞apoA1+/+OIR。熒光滲漏出現(xiàn)時(shí)間，從早到晚排序：apoA1-/-OIR ＞正常小鼠OIR ＞apoA1+/+OIR。三組小鼠OIR 模型血管密度經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（One-Way ANOVA），組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=22.56，P血管密度=0.001 6，P＜0.01，n=5；圖5B）。采用Bonferroni 法進(jìn)一步作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)正常小鼠OIR 組與apoA1+/+OIR 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.008 6，P＜0.01），apoA1+/+OIR 組與apoA1-/-OIR 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001 8，P＜0.01），而正常小鼠OIR 組與apoA1-/-OIR 組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.42，P＞0.05）。3 組小鼠OIR 模型孔隙率經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（One-Way ANOVA），組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=21.08，P孔隙率=0.001 9，P＜0.01，n=5；圖5C）。采用Bonferroni 法進(jìn)一步作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)正常小鼠OIR 組與apoA1-/-OIR 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.011，P＜0.05），apoA1+/+OIR 組與apoA1-/-OIR組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002 0，P＜0.01），而正常小鼠OIR 組與apoA1+/+OIR 組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.41，P＞0.05）。同樣方法分析連接點(diǎn)個(gè)數(shù)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=27.64，P連接點(diǎn)個(gè)數(shù)=0.001 3，P＜0.01，n=5；圖5D）。采用Bonferroni 法進(jìn)一步作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)正常小鼠OIR 組與apoA1-/-OIR 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.007 2，P＜0.01），apoA1+/+OIR 組與apoA1-/-OIR 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001 2，P＜0.01），而正常小鼠OIR 組與apoA1+/+OIR 組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.24，P＞0.05）。

圖5 缺氧狀態(tài)下P17的3種小鼠OIR模型熒光造影情況Fig.5 Fundus fluorescein angiography of OIR model of P17 in the three kinds of mice under hypoxia state

3 討論

apoA1 是血清高密度脂蛋白顆粒中主要的蛋白質(zhì)成分，反映了血管組織中脂質(zhì)積累。它是一種相對(duì)較大的蛋白質(zhì)，含有243 個(gè)氨基酸殘基。它參與脂肪分子的逆行轉(zhuǎn)運(yùn)、血清膽甾醇酯的形成和抗凝血過程，具有顯著的抗氧化、抗炎和抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。本研究采用動(dòng)物視網(wǎng)膜成像系統(tǒng)在活體情況下對(duì)小鼠視網(wǎng)膜血管進(jìn)行觀察，并用血管密度、孔隙率、連接點(diǎn)個(gè)數(shù)等指標(biāo)反映視網(wǎng)膜微血管的改變。我們運(yùn)用的小鼠眼底照相及眼底熒光造影，具有視網(wǎng)膜實(shí)時(shí)成像的特點(diǎn)［10］，在不需要犧牲小鼠的情況下，監(jiān)測(cè)生理及病理?xiàng)l件下的視網(wǎng)膜血管變化。通過上述指標(biāo)同樣可以評(píng)價(jià)視網(wǎng)膜血管生長(zhǎng)及破壞情況。并用C57BL/6 小鼠的三大關(guān)鍵時(shí)期（幼年期、成年期、中老年期）模擬小鼠的生長(zhǎng)周期，以此首次探討在正常生理?xiàng)l件下，apoA1基因表達(dá)量的多少對(duì)小鼠視網(wǎng)膜血管生長(zhǎng)發(fā)育的影響。

Rubin等［11］最早于1990年構(gòu)建apoA1過表達(dá)小鼠模型，用于研究apoA1轉(zhuǎn)基因表達(dá)改變后，涉及小鼠apoA1血漿水平的機(jī)制。過表達(dá)模型構(gòu)建后，其血清HDL 水平大約是正常水平的兩倍。apoA1在決定高密度脂蛋白顆粒大小分布方面起主導(dǎo)作用。隨后，有研究利用apoA1過表達(dá)小鼠證明它可以降低飲食誘導(dǎo)發(fā)生的大動(dòng)脈粥樣硬化病變的風(fēng)險(xiǎn)［12］。為確定實(shí)驗(yàn)性降低血漿高密度脂蛋白水平是否會(huì)增加動(dòng)脈粥樣硬化易感性，Williamson 等［13］于1992 年利用基因靶向技術(shù)來產(chǎn)生apoA1基因敲除小鼠模型。盡管與正常小鼠相比，apoA1基因敲除純合子小鼠缺乏apoA1蛋白，它們?cè)? 月齡時(shí)仍健康生長(zhǎng)。這一事實(shí)證明了apoA1對(duì)小鼠的正常發(fā)育并不是至關(guān)重要的。該模型的有效存活為更好地研究apoA1缺失在脂質(zhì)代謝和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生的影響提供了可能。

我們研究發(fā)現(xiàn)，正常情況下apoA1過表達(dá)對(duì)視網(wǎng)膜血管生成無影響。我們可見3 種小鼠在幼年、成年、中老年時(shí)期中觀察到視網(wǎng)膜血管的生長(zhǎng)發(fā)育上未見明顯異常，其表現(xiàn)為主要血管自視盤發(fā)出，呈放射狀分枝形態(tài)，血管徑直，毛細(xì)血管分布均勻，無明顯無灌注區(qū)，無新生血管形成。我們可知，HDL 除了參與膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)外，HDL 有血管保護(hù)作用，包括內(nèi)皮細(xì)胞功能保護(hù)作用、抗炎作用、抗血栓作用、抑制血管平滑肌細(xì)胞（smooth muscle cell，SMC）增殖［14］等作用。ApoA1是高密度脂蛋白中含量最豐富的成分，它有著與HDL 相似的作用。我們猜測(cè)，在正常生理情況下，無顯著刺激因素，未能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生氧化還原應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等，apoA1高表達(dá)情況下，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞、調(diào)節(jié)血管生成、調(diào)節(jié)內(nèi)外膜功能等血管保護(hù)作用未能凸顯，血管依舊正常生成，呈正常血管分布形態(tài)。因此，apoA1過表達(dá)小鼠模型，其血管正常發(fā)育與正常小鼠相比無明顯改變。

我們的研究也顯示在正常情況下，apoA1缺失對(duì)視網(wǎng)膜血管生成無影響，分析原因如下：首先，本研究模擬小鼠正常條件下，觀察apoA1對(duì)視網(wǎng)膜血管生成的影響，而apoA1與脂質(zhì)代謝息息相關(guān)，下一步研究將對(duì)各組小鼠的血脂狀況進(jìn)行測(cè)量，做組織切片對(duì)小鼠的大血管壁進(jìn)行病理觀察，以進(jìn)一步驗(yàn)證。其次，組織脂質(zhì)堆積在病變晚期時(shí)癥狀才凸顯。apoA1-/-小鼠模型，可模擬臨床上的丹吉爾?。╰angier disease，TD），這是一種罕見的遺傳病，其臨床特征是血漿高密度脂蛋白水平嚴(yán)重降低，外周組織脂質(zhì)積累，心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)增加［15］。而在眼科中曾有報(bào)道，患者年輕時(shí)雙眼無明顯病變，其重要臨床表現(xiàn)為成年后逐漸出現(xiàn)角膜混濁，活檢標(biāo)本中顯示結(jié)膜血管周細(xì)胞變性，細(xì)胞見雙折射脂質(zhì)顆粒［16］，對(duì)全身血管系統(tǒng)的發(fā)育無影響。而本研究中小鼠研究至中老年期，可能未能誘導(dǎo)出相應(yīng)血管改變。

我們的研究結(jié)果還顯示：缺氧狀態(tài)下，3 組小鼠的OIR 模型在眼底照相中均可發(fā)現(xiàn)主要血管明顯迂曲擴(kuò)張、串珠樣改變，部分區(qū)域可見片狀出血。主要?jiǎng)用}、靜脈迂曲擴(kuò)張程度無明顯差異。說明對(duì)于主要血管，抵抗氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的迂曲擴(kuò)張的作用不顯著。3 組小鼠造OIR 模型后，在熒光造影中均可見大量的無灌注區(qū)，熒光滲漏，血管的擴(kuò)張、扭曲和閉塞。血-視網(wǎng)膜屏障均有不同程度的破壞，視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接屏障發(fā)育不完善，并且更重要的是，apoA1表達(dá)量增高，可見視網(wǎng)膜血管的熒光滲漏減少，視網(wǎng)膜無灌注區(qū)面積減少。血管密度的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明apoA1能抵抗缺氧對(duì)視網(wǎng)膜血管屏障的破壞，維持血管網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定；孔隙率的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異提示apoA1對(duì)視網(wǎng)膜血管的無灌注區(qū)生成有一定的抑制作用，使無灌注區(qū)減少，連接點(diǎn)個(gè)數(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異說明apoA1對(duì)視網(wǎng)膜血管的生長(zhǎng)發(fā)育、分支生成毛細(xì)血管網(wǎng)有一定的保護(hù)作用，綜上證據(jù)提示apoA1對(duì)視網(wǎng)膜血管屏障有保護(hù)作用。

我們推測(cè)apoA1保護(hù)視網(wǎng)膜血管無灌注區(qū)、減少滲漏的可能機(jī)制為［17］：脂質(zhì)內(nèi)逆向轉(zhuǎn)運(yùn)作用。apoA1是脂質(zhì)在視網(wǎng)膜內(nèi)逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵因素［18］，它促進(jìn)膽固醇從外周組織轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟，從而防止脂質(zhì)在視網(wǎng)膜內(nèi)積聚?？寡趸饔谩DL 的氧化可導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞毒性和血管內(nèi)皮功能障礙，apoA1可以促進(jìn)血管保護(hù)機(jī)制［19］，具有抗氧化作用，抑制LDL 的氧化，通過清除有害的氧化脂質(zhì)，抵抗視網(wǎng)膜受到氧化應(yīng)激的損害。保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞作用。已有研究表明，較高水平的apoA1可改善冠狀動(dòng)脈的血管內(nèi)皮功能［20］，對(duì)于微血管病變，其作用亦然，它可以調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞。重組HDL（reconstituted HDL，rHDL）可以刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）的分化，并增強(qiáng)EPCs 介導(dǎo)小鼠的內(nèi)皮修復(fù)。一氧化氮（NO）可使血管擴(kuò)張，apoA1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞NO 依賴性血管舒張和血流調(diào)節(jié)具有生理作用，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞減少損害。調(diào)節(jié)內(nèi)外膜功能。一方面，HDL調(diào)節(jié)內(nèi)膜內(nèi)皮功能、血小板活化和血栓形成、炎性細(xì)胞因子分泌、泡沫細(xì)胞形成和SMC 增殖，抑制內(nèi)膜增生。另一方面，HDL具有調(diào)節(jié)外膜成纖維細(xì)胞分化和血管周圍脂肪細(xì)胞功能的潛能，它可能與膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)相結(jié)合，減少血管重構(gòu)［21］。

視網(wǎng)膜成像系統(tǒng)具有無創(chuàng)、實(shí)時(shí)、血管可視化的特點(diǎn)，本文通過視網(wǎng)膜成像系統(tǒng)，活體觀察apoA1正常生理狀態(tài)下及缺氧狀態(tài)下對(duì)視網(wǎng)膜血管生長(zhǎng)情況的影響，發(fā)現(xiàn)在生理?xiàng)l件下，apoA1基因表達(dá)量的多少對(duì)視網(wǎng)膜血管生長(zhǎng)無影響；而缺氧狀態(tài)下，apoA1表達(dá)量增高可使視網(wǎng)膜無灌注區(qū)面積減少，熒光滲漏減少，提示apoA1對(duì)視網(wǎng)膜血管屏障有保護(hù)作用，為視網(wǎng)膜新生血管疾病提供新思路，而且對(duì)其他微血管疾病及大血管疾病的發(fā)生發(fā)展也有提示作用。