謝毓峰，祁方昉，王清波，王 飛

（1.中山大學醫(yī)學院，廣東廣州 510080；2.中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院外科教研室，廣東廣州 510120；3.中山大學中山醫(yī)學院解剖教研室，廣東廣州 510080；4.中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院麻醉科，廣東廣州 510120）

在傳統(tǒng)觀念上，中樞神經(jīng)系統(tǒng)是一個免疫豁免區(qū)域，由于血腦屏障這一天然的物理屏障存在，使得中樞與外周相隔。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，在硬腦膜內(nèi)存在著淋巴管樣結(jié)構(gòu)［1］，并發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)與外周淋巴結(jié)相聯(lián)通［2］。隨著研究的深入，證明了該結(jié)構(gòu)具有典型的淋巴管道的特征，并且具備引流至頸部淋巴結(jié)的能力［3］。因此，腦膜淋巴管與腦內(nèi)疾病的關(guān)系備受關(guān)注。小鼠腦內(nèi)的代謝產(chǎn)物或有害物質(zhì)積聚在腦內(nèi)引起神經(jīng)炎癥，影響腦脊液循環(huán)，引起神經(jīng)元的損害等，這些可能導致阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）發(fā)病率增加［4］。淋巴管系統(tǒng)不僅負責清除碎屑，而且負責組織免疫監(jiān)視的調(diào)節(jié)。在腦膜淋巴管研究中就發(fā)現(xiàn)其中含有大量的T 細胞，通過消融了淋巴管后，會引起腦實質(zhì)的灌注受損和腦脊液引流受損，使得腦內(nèi)大分子擴散速率減慢，從而影響了空間學習和記憶障礙［5］。腦膜淋巴管發(fā)育相關(guān)方面的研究發(fā)現(xiàn)，腦膜淋巴管的發(fā)育依賴于細胞因子，其中包括血管內(nèi)皮生長因子C（vascular endothelial growth factor C，VEGF-C）等與內(nèi)皮細胞相關(guān)的細胞因子［6-7］。但外周免疫是如何影響腦膜淋巴管的發(fā)育及淋巴管引流等功能，目前尚未有明確的研究報道。因此，本實驗研究外周免疫缺失下，腦膜淋巴管形態(tài)及功能的變化，為外周免疫系統(tǒng)與中樞系統(tǒng)之間的聯(lián)系提供一定的基礎(chǔ)研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和飼養(yǎng)

8 周齡雌性裸鼠，8 周齡雌性BALB/c 小鼠，均購自廣東省實驗動物中心［實驗動物為SPF 級，許可證號：SYXK（粵）2019-0209］。實驗動物飼養(yǎng)于SPF 環(huán)境：溫度（22±2）℃，濕度（55±5）%，12 h 光照和12 h黑暗條件，食物和水自由獲取。本研究所采取的尾靜脈注射均在SPF 環(huán)境內(nèi)進行。本研究所有動物實驗操作程序獲得中山大學實驗動物倫理委員會機構(gòu)審批并通過。

1.2 T細胞采集及回輸

給BALB/c 小鼠頸背部皮下注射卡介苗，7 日后，取供體小鼠的脾臟，使用RPMI 培養(yǎng)基1640 basic（Life Technologies，北京，中國）加入10 g/L 胎牛血清和抗生素，用注射器栓塞研磨成均質(zhì)單細胞懸液。用ACK 裂解緩沖液裂解紅細胞（1X，555899，Biolegend）。脾細胞洗滌后，用濃度為1×108個細胞/mL 的分離緩沖液重懸。對CD3+的淋巴細胞，采用專門為CD3+T 淋巴細胞設(shè)計的EasySep T 細胞分離試劑盒（Stem Cell Technologies），通過陰性選擇進一步分離T 淋巴細胞。本研究中，通過尾靜脈注射用1×107個單核T 淋巴細胞重建每只裸鼠，總體積為200μL。

1.3 免疫熒光染色法

小鼠按10 mL/kg 經(jīng)腹腔注射40 g/L 水合氯醛過量麻醉。剪開頸部皮膚，用眼科鑷分離出頸部淋巴結(jié)，放 入40 g/L 多 聚 甲 醛（paraformaldehyde，PFA）的固定液4 ℃固定24 h，梯度脫水后行連續(xù)冰凍切片（厚度20μm）。取完頸部淋巴結(jié)后，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer，PBS）心臟灌注，去除小鼠外周血，剪去頸后肌肉，將顱骨從枕骨大孔剪至上顎，用手術(shù)剪去除顱骨周圍多余的骨組織，用眼科鑷將腦組織從顱骨內(nèi)剝離，將顱骨連帶硬腦膜一起放入20 g/L 多聚甲醛4 ℃固定，不超過24 h［8］，PBS 漂洗一遍后在體視顯微鏡下，用眼科鑷將硬腦膜從顱骨內(nèi)輕輕剝離。

CD11b+/Lyve-1+雙標染色：將硬腦膜經(jīng)PBS 洗后，用含2 g/L Triton X-100 牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）于37 ℃孵育30 min，加入一抗：大鼠抗-CD11b（1：500）、羊抗-Lyve-1（1：500）于37 ℃孵育2 h后4 ℃過夜，次日用PBS漂洗3次后加入二抗：Alexa Flour 594 驢抗大鼠-IgG（1：500）、Alexa Flour 488 驢抗羊-IgG（1：500），于37 ℃孵育2 h，PBS 漂洗3 次后，用熒光封片劑（0.01 mmol/L PBS和甘油1：1配比）封片。

封片完畢后于激光共聚焦顯微鏡（ZEISS780）下掃描拍照。應(yīng)用Image J圖像分析軟件對CD11b+的細胞進行計數(shù)，應(yīng)用Image J 圖像分析計算出腦膜內(nèi)淋巴管上皮細胞lyve-1+熒光強度（AU）；并以BALB/C 組為基準，比較各組腦膜內(nèi)淋巴管上皮細胞lyve-1+熒光強度。應(yīng)用Image J 計算淋巴結(jié)內(nèi)lyve-1+細胞占圖中整個面積的百分比（ROI）。

1.4 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)以均值±標準差或中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示。裸鼠和BALB/c 小鼠背側(cè)淋巴管內(nèi)CD11b+的細胞數(shù)量，采用Student’sttest 雙側(cè)t檢驗或秩和檢驗的檢測方法分析數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學差異，以P＜0.05 為顯著性水準。其余數(shù)據(jù)僅作定性分析。

2 結(jié)果

2.1 外周免疫缺失促進CD11b+細胞進入腦膜淋巴管

在8 周齡的裸鼠和BALB/c 小鼠的腦膜淋巴管中發(fā)現(xiàn)，在背側(cè)矢狀竇處淋巴管中，裸鼠CD11b+細胞的數(shù)量少于BALB/c 小鼠，差異具有統(tǒng)計學意義［53.2（39.9～66.5）vs.29.0（22.2～35.8），n=3，t=3.598，P=0.007；圖1A、B、E］；但在乙狀竇處的淋巴管內(nèi)觀察到裸鼠CD11b+細胞的數(shù)量多于BALB/c小鼠（圖1C、D）；其原因可能是BALB/c 小鼠腦膜淋巴管的引流功能正常，在背側(cè)擔任傳遞功能的細胞多，在乙狀竇部，淋巴管的結(jié)構(gòu)正常，細胞遷入較少，而裸鼠因為淋巴管發(fā)育異常，淋巴管結(jié)構(gòu)不全，導致淋巴管引流功能降低，細胞較易穿過管壁進入淋巴管。

2.2 回輸BCG誘導的T淋巴細胞有助于腦膜淋巴管發(fā)育

過繼轉(zhuǎn)移T 淋巴細胞14 d 后，在背側(cè)處的硬腦膜，與未處理的裸鼠（圖2B，91.56 AU）相比，回輸T淋巴細胞的裸鼠腦內(nèi)的淋巴管上皮細胞lyve-1 的表達量增加，促進腦膜淋巴管的結(jié)構(gòu)發(fā)育完整，對腦膜淋巴管有正向促進作用（圖2D，121.71 AU），與正常小鼠（圖2A，255.00 AU）比較，腦膜淋巴管結(jié)構(gòu)仍有欠缺，但結(jié)果好于注射PBS（圖2C，87.08 AU）的小鼠。結(jié)果顯示，外周免疫細胞或其所分泌的細胞因子可能對中樞內(nèi)的淋巴樣管道的發(fā)育起到一定的影響。在乙狀竇處的硬腦膜，可得到相同的結(jié)果。（圖2E，255.00 AU；F，76.73 AU；G，58.04 AU；H，89.09 AU）。定性比較，我們認為回輸BCG誘導的T淋巴細胞有助于腦膜淋巴管的發(fā)育。

圖1 裸鼠淋巴管內(nèi)呈遞細胞分布異常Fig.1 Abnormal distribution of CD11b+cells in meningeal lymphatic vessels in nude mice

圖2 回輸激活T細胞促進裸鼠腦膜淋巴管增殖Fig.2 Retransfusion activated T cells promoted proliferation of meningeal lymphatic vessels in nude mice

2.3 裸鼠頸淺淋巴結(jié)內(nèi)淋巴小結(jié)增生

對裸鼠和BALB/c 小鼠的頸部淺淋巴結(jié)進行l(wèi)yve-1 淋巴管特異染色發(fā)現(xiàn)，裸鼠的淋巴結(jié)皮質(zhì)部分的淋巴管結(jié)構(gòu)（圖3C，ROI=14.11%）與BALB/c 小鼠（圖3A，ROI=13.05%）無明顯差異。在副皮質(zhì)區(qū)，裸鼠淋巴結(jié)內(nèi)淋巴管（圖3D，ROI=16.36%）與BALB/c 小鼠（圖3B，ROI=16.04%）也無明顯差異，但在裸鼠了淋巴結(jié)內(nèi)可以見到較多被淋巴管劃分的類似淋巴結(jié)的區(qū)域。

3 討論

在正常的腦膜淋巴管內(nèi)，不同部位的腦膜淋巴管擔當著不同的功能，基底部淋巴管呈紐扣狀閉合，易于細胞遷入和物質(zhì)交換；背側(cè)淋巴管呈鏈狀連續(xù)閉合，起到引流的作用［7］。包括阿爾茨海默癥［4］，多發(fā)性脊髓硬化癥［9］在內(nèi)的神經(jīng)炎癥與腦膜淋巴管引流功能異常相關(guān)。腦膜淋巴管的引流功能以及與引流功能相關(guān)的因素，如年齡［10］、淋巴管的位置［5］等都已被前人研究，并且對引流途徑有了較為詳細的論述。文獻報道，正常腦膜淋巴管同腦動靜脈一起發(fā)育，且與細胞因子相關(guān)［11］。我們既往研究［12］表明，向裸鼠過繼卡介苗激活的T 淋巴細胞后，促進小鼠海馬細胞的增殖和行為改變。發(fā)現(xiàn)卡介苗誘導外周免疫激活后，對硬腦膜和腦膜巨噬細胞的極化和募集增加［13］。根據(jù)我們既往研究［14］發(fā)現(xiàn)，注射卡介苗后，小鼠體內(nèi)的抗炎細胞因子IL-10表達量會增加，尤其是腦膜內(nèi)的CD11b+細胞表達量為著，同時，還發(fā)現(xiàn)，被卡介苗所誘導的單核細胞所衍生的巨噬細胞，其募集部位多位于脈絡(luò)叢和血管周圍間隙，并且腦膜內(nèi)的巨噬細胞激活需要相應(yīng)的T 細胞募集至脈絡(luò)叢內(nèi)，在卡介苗的誘導下，我們發(fā)現(xiàn)了T細胞在腦膜內(nèi)的浸潤［15］。

在此基礎(chǔ)上，推測此次實驗的裸鼠可能由于缺乏T 細胞，導致其腦膜內(nèi)的巨噬細胞的激活缺乏相應(yīng)的T 細胞的誘導，從而表現(xiàn)在橫竇和乙狀竇內(nèi)的CD11b+細胞數(shù)量明顯減少。由此信息，進一步推測外周免疫與中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在聯(lián)系；但目前尚未有明確的研究表明中樞神經(jīng)系統(tǒng)與外周免疫系統(tǒng)之間的媒介是循環(huán)系統(tǒng)或者是腦膜淋巴管。研究［8］報道，腦脊液是從腦膜淋巴管引流至頸部淋巴結(jié)，從而對腦脊液內(nèi)的物質(zhì)進行清理。因此，該區(qū)域增生的淋巴結(jié)，也可能是位于擔任細胞免疫的副皮質(zhì)區(qū)，且增生數(shù)量較野生型組的淋巴結(jié)多。也可能是由于胸腺的缺失導致T 細胞的發(fā)育缺失，引起數(shù)量上的增加來補償細胞功能上的不足。本實驗結(jié)果顯示：外周免疫缺陷的小鼠腦內(nèi)淋巴管的發(fā)育情況較正常小鼠降低，淋巴管的引流功能可能存在差異，且淋巴管的功能可能與頸部淋巴結(jié)相關(guān)聯(lián)。再次激活外周免疫，可促進腦膜淋巴管的發(fā)育。本研究的發(fā)現(xiàn)揭示了外周免疫影響腦膜淋巴管的發(fā)育，提示外周免疫調(diào)節(jié)可能對改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥有一定的作用。

圖3 免疫缺陷導致頸部淋巴結(jié)副皮質(zhì)區(qū)淋巴管增殖抑制Fig.3 Immunodeficiency leads to inhibition of lymphatic vessels proliferation in the paracortical area of cervical lymph node

近年來，隨著腦膜淋巴管的發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)與外周免疫的聯(lián)系受到廣泛的關(guān)注。外周的免疫調(diào)節(jié)參與改善大腦的功能和行為［12］，在炎癥狀態(tài)下，篩板內(nèi)的CD11b+細胞表達VEGFC，可促進VEGFR3 依賴性淋巴管的生成，該淋巴管生成在功能上增加了腦源性抗原進入引流淋巴管的通道，促進引流多余的液體。同時，淋巴管也表達CCL21，與樹突狀細胞的遷移有相關(guān)性［16］。也有研究表明，CCL21-CCR7 途徑與淋巴系統(tǒng)內(nèi)T 細胞的引流相關(guān)，而腦膜淋巴管內(nèi)皮細胞和頸部淋巴結(jié)內(nèi)皮細胞都表達CCR7 相關(guān)的配體CCL21，相關(guān)實驗證實了免疫細胞在淋巴管內(nèi)運輸與該途徑有密切聯(lián)系［17］。同時，也有研究報道，外周淋巴結(jié)與外周的神經(jīng)系統(tǒng)存在相互作用，巨噬細胞在小鼠淋巴結(jié)旁皮質(zhì)和延髓內(nèi)表現(xiàn)出與神經(jīng)纖維緊密并列的位置，可與神經(jīng)纖維產(chǎn)生雙向相互作用［18］，淋巴管存在神經(jīng)支配。我們推測，中樞神經(jīng)系統(tǒng)與腦膜淋巴管及其相鄰的頸部淋巴結(jié)也可能存在這類相互作用。

也有研究［7］表明，隨著年齡的增長，腦膜淋巴管的水腫和淋巴管內(nèi)瓣膜的消失使腦脊液清除率減低，可能導致AD 的發(fā)生。我們也進行相關(guān)的實驗發(fā)現(xiàn)，同月齡AD 小鼠的腦膜內(nèi)，CD11b+的細胞數(shù)量顯著低于對照組，因此，推測淋巴管內(nèi)的免疫相關(guān)細胞的減少可能也是其功能減退的原因之一。誠然，這一推斷仍需進一步地實驗加以證實。

綜上所述，本文通過對不同外周免疫情況的小鼠進行對比，證明了外周免疫缺失影響腦膜淋巴管的發(fā)育，除了觀察到淋巴管特征性表達降低，還可觀察到淋巴管內(nèi)免疫細胞數(shù)量在背側(cè)矢狀竇的數(shù)量降低和乙狀竇內(nèi)存在細胞遷入的可能。本研究初次探討了頸部淋巴結(jié)的功能異常可能影響腦膜淋巴管的功能，提示外周免疫調(diào)節(jié)可能通過改善腦膜淋巴管的結(jié)構(gòu)和功能來影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)。