祁月，張葉，郭乃鳳，張光第，戴厚永

（南通大學(xué)附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，江蘇226001）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病常見(jiàn)的慢性微血管并發(fā)癥之一。在西方國(guó)家DN是終末期腎衰竭（ESRD）的首要病因，在我國(guó)糖尿病相關(guān)慢性腎臟病患者逐年增多，2016年已達(dá)2 430萬(wàn)人，預(yù)計(jì)未來(lái)幾年DN也將是我國(guó)ESRD的首要病因[1]。DN嚴(yán)重影響患者預(yù)后，積極研究DN發(fā)病機(jī)制對(duì)防治DN具有重要意義。DN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，仍未完全闡明，目前認(rèn)為足細(xì)胞損傷在DN發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是研究的重點(diǎn)內(nèi)容[2-3]。

Klotho是一種與衰老有關(guān)的蛋白，目前發(fā)現(xiàn)Klotho蛋白有α、β和γ三種類(lèi)型，常說(shuō)的Klotho蛋白即指α型。除抗衰老作用外，Klotho蛋白還有抑制胰島素/類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子1（IGF-1）信號(hào)傳導(dǎo)途徑和Wnt信號(hào)，調(diào)節(jié)鈣和磷穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)甲狀旁腺激素（PTH）分泌，抗氧化應(yīng)激，抑制細(xì)胞炎癥和凋亡，促進(jìn)自噬，抑制纖維化等作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)腎臟不僅是全身Klotho的主要來(lái)源，而且是清除循環(huán)中Klotho的主要器官[5-6]。Klotho主要表達(dá)于遠(yuǎn)曲小管[5]，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)在足細(xì)胞也有Klotho表達(dá)[7]。研究發(fā)現(xiàn)，外源性Klotho通過(guò)抑制足細(xì)胞TRPC6通道Ca2+內(nèi)流而減輕蛋白尿，有關(guān)Klotho對(duì)足細(xì)胞的保護(hù)作用逐漸引起學(xué)者們的重視[7]。既往我們研究發(fā)現(xiàn)抑制足細(xì)胞β-catenin能減輕高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化[8]，本實(shí)驗(yàn)擬探討Klotho是否能通過(guò)抑制足細(xì)胞β-catenin表達(dá)而減輕足細(xì)胞損傷，為臨床防治DN提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 足細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)從液氮罐中取出凍存的小鼠永生系足細(xì)胞（美國(guó)Mundel教授惠贈(zèng)），復(fù)蘇后加入新鮮培養(yǎng)液吹散細(xì)胞，接種至涂有Ⅰ型膠原的25 cm2培養(yǎng)瓶，用含10%胎牛血清（美國(guó)Gibco）的RPMI 1640培養(yǎng)基，添加小鼠重組γ-IFN 10 U/mL（美國(guó)PeproTech），在33℃許可條件下培養(yǎng)，隔天換液。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至85%左右融合時(shí)，予以0.25%胰蛋白酶消化傳代。誘導(dǎo)分化時(shí)，將未分化足細(xì)胞置于37℃非許可條件下（不含γ-IFN）繼續(xù)培養(yǎng)10天至分化成熟，然后無(wú)血清繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化。然后分為正常對(duì)照組（含5 mmol/L葡萄糖）、高糖組（含30 mmol/L葡萄糖）、滲透壓對(duì)照組（含5 mmol/L葡萄糖+25 mmol/L甘露醇）及干預(yù)組（Klotho 100 pmol/L+30 mmol/L葡萄糖），繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2 RNA提取及基因檢測(cè)應(yīng)用RNAiso plus試劑（寶生物工程大連有限公司），按說(shuō)明書(shū)操作提取足細(xì)胞總RNA，后者采用SYBR ExScript TM RT-PCR試劑盒（寶生物工程大連有限公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取2μL cDNA產(chǎn)物，加相應(yīng)引物及SYBR預(yù)混液等組成20μL體系，在ABI PRISM 7300 PCR儀（美國(guó)Applied Biosystems）進(jìn)行擴(kuò)增。目的基因引物desmin：上游5’-TGCAGCCACTCTAGCTCGTA-3’，下游5’-GACATGTCCATCTCCACCTG-3’。β-catenin：上游5’-GCAGCAACAGTCTTACCT-3’，下游5’-ACAGGACTTGGGAGGTAT-3’。β-actin：上游5’-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3’，下游5’-GTACTCCTGCTTGCTGATCC-3’。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA的含量，以β-actin作為內(nèi)參。

1.3 蛋白提取及Western Blot法檢測(cè)將足細(xì)胞用PBS洗滌2遍，加適量裂解液后用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，離心，取上清液檢測(cè)蛋白濃度。取20μg蛋白，SDSPAGE凝膠電泳分離，濕法轉(zhuǎn)入PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，0.3%TBST洗膜3次，分別加入相應(yīng)一抗（desmin和β-catenin均為1∶200稀釋?zhuān)绹?guó)Santa Cruz），4℃過(guò)夜。TBST洗膜，分別加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗（1∶1 000），室溫孵育1 h，PBS洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光法曝光。以目的蛋白與βactin蛋白的灰度比值進(jìn)行半定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷與正常對(duì)照組相比，高糖組足細(xì)胞損傷標(biāo)志物desmin基因和蛋白表達(dá)均上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷，而滲透壓對(duì)照組與正常對(duì)照組的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 高糖對(duì)足細(xì)胞desmin表達(dá)的影響

2.2 高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞β-catenin表達(dá)上調(diào)與正常對(duì)照組相比，高糖培養(yǎng)足細(xì)胞48 h后，β-catenin基因和蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而滲透壓對(duì)照組β-catenin水平與正常對(duì)照組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3 Klotho減輕高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷正常糖培養(yǎng)條件下，足細(xì)胞desmin表達(dá)很少，高糖刺激足細(xì)胞損傷后，desmin基因和蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），予Klotho干預(yù)后，高糖誘導(dǎo)的desmin基因和蛋白過(guò)表達(dá)明顯受抑制，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖2 高糖對(duì)足細(xì)胞β-catenin表達(dá)的影響

圖3 Klotho對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷的影響

2.4 Klotho抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞β-catenin表達(dá)上調(diào)與正常對(duì)照組相比，高糖刺激導(dǎo)致足細(xì)胞損傷后，β-catenin基因和蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），予Klotho干預(yù)后，能抑制高糖誘導(dǎo)的β-catenin基因和蛋白過(guò)表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），從而減輕足細(xì)胞損傷。見(jiàn)圖4。

圖4 Klotho對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞β-catenin表達(dá)的影響

3 討 論

足細(xì)胞損傷在DN發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用[2-3]。糖尿病時(shí)，各種損傷因子導(dǎo)致足細(xì)胞肥大、自噬、凋亡、細(xì)胞脫落以及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等多種病理改變[9]。目前desmin是公認(rèn)的足細(xì)胞損傷重要生物標(biāo)志物[10]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高糖能誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷，表現(xiàn)為desmin基因和蛋白水平均上調(diào)，同時(shí)β-catenin表達(dá)也上調(diào)。Klotho能抑制β-catenin表達(dá)上調(diào)，減輕足細(xì)胞損傷，使desmin表達(dá)下調(diào)。

國(guó)內(nèi)臺(tái)灣學(xué)者發(fā)現(xiàn)鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎組織Klotho表達(dá)減少[11]，敲除Klotho基因可加劇糖尿病小鼠早期腎臟病變[12]，相反，Klotho過(guò)表達(dá)通過(guò)減輕氧化應(yīng)激而減少糖尿病小鼠蛋白尿[13]。在早期DN患者腎組織也發(fā)現(xiàn)Klotho表達(dá)減少[14]。此外，DN患者血Klotho水平低于正常人，且Klotho水平與腎小球?yàn)V過(guò)率成正相關(guān)，與尿白蛋白肌酐比成負(fù)相關(guān)[15]，以上研究均表明Klotho與DN關(guān)系密切。實(shí)驗(yàn)證明，補(bǔ)充外源性或增加內(nèi)源性Klotho生成能延緩慢性腎臟病進(jìn)展[16]。

LIU等[17]發(fā)現(xiàn)Klotho是Wnt信號(hào)內(nèi)源性抑制劑。隨后ZHOU等[18]發(fā)現(xiàn)Klotho可通過(guò)抑制Wnt信號(hào)下游的β-catenin而改善腎臟纖維。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Klotho在減輕足細(xì)胞損傷的同時(shí)，抑制β-catenin表達(dá)。結(jié)合既往研究，我們認(rèn)為足細(xì)胞可能存在Klotho/β-catenin信號(hào)途徑，糖尿病時(shí)足細(xì)胞Klotho表達(dá)減少，導(dǎo)致β-catenin激活，外源性Klotho通過(guò)抑制β-catenin活化而減輕足細(xì)胞損傷。有關(guān)糖尿病時(shí)Klotho減輕足細(xì)胞損傷的作用機(jī)制尚需體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。