劉賓 劉輝 李寶玉

天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院胃腸外科300211

0 引 言

胰腺癌被稱為“癌中之王”，是一類主要起源于胰腺導(dǎo)管上皮細胞的惡性腫瘤[1]。胰腺癌的惡性程度高，早期診斷困難，起病迅速，是預(yù)后最差的一種惡性腫瘤，其發(fā)病率與死亡率在全球均高居惡性腫瘤前10 位[2]。中國國家癌癥中心的數(shù)據(jù)表明，2019年我國胰腺癌的發(fā)病率居惡性腫瘤第10 位，死亡率高居第6 位。按照病理類型，胰腺癌主要分為胰腺導(dǎo)管腺癌（約占80%）、腺鱗癌、腺泡細胞癌等[3]。手術(shù)結(jié)合放射治療、化學治療是胰腺癌的主要治療手段，但臨床效果欠佳[4]。胰腺癌缺乏顯著的早期癥狀，因此其早期診斷至關(guān)重要[5]。

胰腺癌的早期診斷常用標記物包括CEA、CA199、CA242 等，盡管其在一定程度上能預(yù)測胰腺癌的發(fā)生，具有一定的早期診斷價值，但特異性均有待提高，并需結(jié)合影像學手段加以進一步判斷[6]。為了提高胰腺癌患者的早期診斷率，降低死亡率，仍需發(fā)現(xiàn)更為有效的胰腺癌生物標記物。

微小染色體維持蛋白（minchromosome maintenance proteins，MCM）主要負責染色體功能維持及DNA 復(fù)制起始[7]。MCM 蛋白家族高度保守，具有保守的MCM 盒結(jié)構(gòu)域，是一種依賴DNA 的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）酶[8]。MCM 家族主要包括8 個成員，這些成員能夠形成多聚體而發(fā)揮功能[9]。MCM4 是MCM 家族的一個重要成員，與MCM4 突變相關(guān)的疾病主要包括免疫缺陷和家族糖皮質(zhì)激素缺乏等[10]。近年來，MCM4 對腫瘤的影響已得到廣泛的揭示[11]。MCM4 可作為一種可靠的腫瘤標記物[12]。在多種腫瘤組織中（如膀胱癌及胃癌中），MCM4 均異常表達，并與患者的不良預(yù)后及臨床病理特征密切相關(guān)[13]。在胃癌中，MCM4 蛋白與腫瘤的分化程度及淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，低分化癌組織中的MCM4表達高于高分化癌，且淋巴轉(zhuǎn)移組的MCM4 表達高于未轉(zhuǎn)移組[14]。然而截至目前，MCM4 與胰腺癌這一高惡性程度腫瘤的潛在關(guān)聯(lián)仍不明確。

本文中，通過生物信息學分析與免疫組化分析，探索胰腺癌中MCM4 的表達情況，以及其表達量與臨床病理特征的關(guān)系，以便進一步了解MCM4在胰腺癌中的作用，為胰腺癌的發(fā)現(xiàn)、監(jiān)測及治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2015年3月至2019年3月，天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院胃腸外科收治的經(jīng)手術(shù)治療的胰腺癌患者76例。其中，男性44例，女性32例，年齡（54.5±5.8）歲。全部病例均經(jīng)過病理證實，術(shù)前未經(jīng)化療或放療，且具有完整的病例資料。收集患者的一般臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤分級和腫瘤大小等。76例病例中，腫瘤為低級別者35例，高級別者41例；腫瘤大小<4 cm 者28例，≥3.5 cm 者48例。

1.2 主要材料與儀器

MCM4 兔抗人單克隆抗體（ab124836，英國Abcam公司），PV-6001 免疫組化檢測試劑盒、ZLI-9018 二氨聯(lián)苯胺（diamio benzidine，DAB）顯色試劑盒（北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。

RM2235 型石蠟切片機（德國Leica 公司），BX51型顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.3 免疫組織化學檢測方法

胰腺導(dǎo)管腺癌腫瘤及癌旁組織通過福爾馬林固定，石蠟包埋。包埋后蠟塊標本進行3 μm 切片，進一步進行MCM4 免疫組化染色。切片于75 ℃孵育30 min，隨后用二甲苯脫蠟，并用梯度乙醇溶液（100%，100%，95%，85%，80%，75%）水合。水合完畢后使用檸檬酸緩沖液孵育20 min 提取抗原，并阻斷內(nèi)源性過氧化物酶5 min，使反應(yīng)充分進行。隨后用質(zhì)量濃度為50 g/L 的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 封閉液封閉30 min。封閉后使用MCM4 抗體孵育2 h，抗體采用1∶100 稀釋。然后切片用生物素化的二抗孵育1.5 h，通過DAB 法顯色，蘇木素染色細胞核。免疫組化切片于顯微鏡下觀察并拍照采集圖像，根據(jù)腫瘤細胞陽性染色面積和染色強度綜合評價免疫組化結(jié)果。

通過染色證實，MCM4 蛋白在腫瘤組織中呈胞漿定位。隨機選取5 個不同的視野，依照陽性細胞在總細胞數(shù)中的比例進行評定。陽性細胞比例評分標準：腫瘤細胞陽性百分數(shù)<20%時，記0分；20%～50%時，記1分；50%～70%時，記2分；>70%時，記3分。陽性染色強度評分標準：陰性染色記0分；弱陽性染色記1分；中陽性染色記2分；強陽性染色記3分。以陽性細胞百分比評分和染色強度評分的和判斷表達情況，總分范圍為0～6分?？偡譃?～2分為MCM4 低表達，3～6分為MCM4 高表達。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用Graphpad 5.0 統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)。通過基因表達譜交互分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）數(shù)據(jù)庫分析MCM4 的mRNA 在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中的表達情況。通過ProteinAtlas數(shù)據(jù)庫（https://www.proteinatlas.org/ENSG00000104738-MCM4/tissue）分析不同腫瘤組織中MCM4 的表達與患者預(yù)后的相關(guān)性，并通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫比較胰腺導(dǎo)管腺癌患者MCM4 不同表達組的總生存及無病生存率差異（http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php?gene=MCM4）。符合正態(tài)分布的計量資料采用均值±標準差（Mean±SD）表示，通過卡方檢驗比較臨床病理特征與患者胰腺導(dǎo)管腺癌組織MCM4 表達之間的相關(guān)性，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 MCM4 的生物信息學分析結(jié)果

有研究結(jié)果證實，MCM4 在多種腫瘤中異常表達并提示不良預(yù)后。因此，通過ProteinAtlas 數(shù)據(jù)庫分析MCM4 的mRNA 在不同腫瘤中與患者生存期之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，MCM4 的mRNA 水平與多種腫瘤患者的生存期之間具有顯著相關(guān)性，包括子宮內(nèi)膜癌、黑色素瘤、肝癌、結(jié)腸癌、胰腺癌及腎癌，提示MCM4 可作為相關(guān)腫瘤預(yù)后的預(yù)測因子（圖1）。

圖1 微小染色體維持蛋白4（MCM4）在不同腫瘤組織中與患者預(yù)后間的關(guān)聯(lián)

通過GPEIA 數(shù)據(jù)庫分析MCM4 的mRNA 水平在胰腺導(dǎo)管腺癌組織和正常組織中的表達情況，共分析人胰腺導(dǎo)管腺癌組織179例及對應(yīng)的癌旁正常組織171例。如圖2 所示，MCM4 的mRNA 在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中呈顯著高表達（P<0.05）。

圖2 胰腺導(dǎo)管腺癌中微小染色體維持蛋白4（MCM4）的mRNA 表達

進一步通過GPEIA 數(shù)據(jù)庫分析MCM4 的表達與胰腺導(dǎo)管腺癌患者的預(yù)后的潛在關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明，MCM4 的表達與胰腺導(dǎo)管腺癌患者的總生存率及無病生存率均密切相關(guān)（圖3）。該結(jié)果提示，MCM4 的表達與患者的預(yù)后密切相關(guān)。

2.2 MCM4 在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中的表達

通過免疫組織化學染色方法檢測MCM4 在76例行手術(shù)切除的胰腺導(dǎo)管腺癌患者的腫瘤組織及其對應(yīng)的癌旁組織中MCM4 蛋白表達情況。結(jié)果顯示，MCM4 定位于胞漿，其表達量在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中明顯高于癌旁正常組織（圖4A）。根據(jù)染色的強度，將胰腺導(dǎo)管腺癌患者分為MCM4 高表達組和MCM4 低表達組。分組后發(fā)現(xiàn)，MCM4 在癌旁正常組織中的表達量顯著降低（圖4B）。

2.3 MCM4 蛋白表達與胰腺導(dǎo)管腺癌患者的臨床病理特征相關(guān)

為了進一步明確MCM4 對胰腺導(dǎo)管腺癌的臨床意義，分析比較了MCM4 表達情況與胰腺導(dǎo)管腺癌患者的臨床病理特征之間的關(guān)聯(lián)。比較了MCM4高表達組與MCM4 低表達組的臨床病理特征差異，包括年齡、性別、腫瘤分級及腫瘤大小。結(jié)果表明，MCM4 的表達水平與胰腺導(dǎo)管腺癌患者的腫瘤大小顯著相關(guān)（P=0.038），而與其他的臨床特征，如年齡（P=0.818）、性別（P=0.845）、腫瘤分級（P=0.632）無關(guān)（表1）。

3 討論與結(jié)論

胰腺癌患者的預(yù)后極差，5年總生存率不足5%。行根治性切除術(shù)的患者，往往由于腫瘤的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)，5年總生存率不到20%[15]。胰腺癌的主要死亡原因包括腫瘤直接導(dǎo)致的并發(fā)癥或胰腺癌術(shù)后的并發(fā)癥[16]。如果能對胰腺癌進行早期診斷與治療，患者術(shù)后2年的存活率可達40%[2]。早期診斷和早期治療是提高和改善胰腺癌預(yù)后的關(guān)鍵，而新興的靶向治療與免疫治療已經(jīng)初見曙光，多種靶向治療藥物開始用于臨床[17]。胰腺癌的早期診斷需要高效且靈敏的生物標記物。作為傳統(tǒng)的胰腺癌標記物，CA199、CEA 等已取得了一定的效果，但其靈敏度與特異性均有待提高[18]。近期研究結(jié)果表明，白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中顯著高表達，且比CA199 的各項指標更加突出，而進一步的臨床實驗仍待進行。本研究中，MCM4 蛋白在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中呈現(xiàn)顯著高表達，并與患者的臨床病理特征及不良預(yù)后密切相關(guān)，相關(guān)結(jié)果證實MCM4 可作為胰腺導(dǎo)管腺癌的預(yù)后預(yù)測因子和潛在的生物標記物。

圖3 微小染色體維持蛋白4（MCM4）表達與胰腺導(dǎo)管腺癌患者生存率的相關(guān)性

圖4 胰腺導(dǎo)管腺癌組織和癌旁正常組織中微小染色體維持蛋白4（MCM4）的免疫組化結(jié)果

表1 微小染色體維持蛋白4（MCM4）蛋白表達與胰腺導(dǎo)管腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析

本研究中，通過生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)179例胰腺導(dǎo)管腺癌樣本中MCM4 的mRNA 呈顯著高表達，且MCM4 的mRNA 水平與胰腺導(dǎo)管腺癌患者的總生存率及無病生存率密切相關(guān)。該結(jié)果證實了MCM4 與胰腺導(dǎo)管腺癌患者的預(yù)后存在相關(guān)性，暗示其可作為胰腺導(dǎo)管腺癌的預(yù)后預(yù)測因子。此外，免疫組化分析結(jié)果顯示，MCM4 在76例胰腺導(dǎo)管腺癌組織樣本中顯著高表達。因此，綜合生物信息學分析和免疫組化分析結(jié)果?？梢缘贸鯩CM4 在胰腺導(dǎo)管腺癌中呈現(xiàn)高表達，并暗示MCM4 可作為一個潛在的胰腺導(dǎo)管腺癌生物標記物。

進一步，通過分析免疫組化結(jié)果與患者的臨床病理特征之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)MCM4 與胰腺導(dǎo)管腺癌的腫瘤大小顯著相關(guān)。這暗示MCM4 在胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。腫瘤的生長包括多個重要階段，如腫瘤細胞的增殖、遷移及新生血管形成等，而失控的細胞增殖是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。MCM4 的表達與腫瘤大小相關(guān)，提示MCM4 可能會對胰腺導(dǎo)管腺癌細胞增殖有影響。下一步需要通過體外實驗加以證實，以便為探索胰腺導(dǎo)管腺癌的有效治療靶點提供新的線索。

MCM4 對于腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響已有廣泛的報道[19]。作為一個和細胞周期相關(guān)的調(diào)控基因，MCM4可通過多種手段調(diào)控腫瘤的進展。MCM4 的過表達是喉部鱗狀細胞癌的一個潛在的預(yù)后標志物[19]。另外，在卵巢癌中，E2F2 可誘導(dǎo)MCM4 的表達上調(diào)，并與患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)[13]。在食管腺癌、鱗狀細 胞 癌 和 癌 前 病 變 中，MCM4 與Ki-67、Bmi1 和cyclin E 的表達顯著相關(guān)[19-20]。上述這些結(jié)果和本研究結(jié)果證實了MCM4 可作為多種腫瘤的預(yù)后預(yù)測因子及潛在的生物標記物。

MCM4 本身對于細胞周期、細胞分裂及DNA復(fù)制具有重要的調(diào)控作用[10,21-23]。有研究者證實了MCM4、SLD3 和DBF4 在控制DNA 復(fù)制進程中具有協(xié)同作用[24-25]。MCM4 是啟動DNA 復(fù)制所必須的關(guān)鍵基因，是前復(fù)制復(fù)合體的關(guān)鍵組成部分[20,26]。MCM4經(jīng)檢查點激酶ATR 及CDK2 磷酸化后可抑制相關(guān)解旋酶活性，進而抑制DNA 復(fù)制過程[27]。這暗示MCM4 在腫瘤組織中的異常表達會影響DNA 復(fù)制，進一步影響相關(guān)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后。同時，MCM4 在全身多處組織中均廣泛表達，而其對于胰腺導(dǎo)管腺癌的影響是否由于對DNA 復(fù)制的調(diào)控仍然值得進一步的體內(nèi)外研究加以證實。

綜上，胰腺導(dǎo)管腺癌是一種惡性程度極高且預(yù)后極差的腫瘤。MCM4 在人胰腺導(dǎo)管腺癌組織中呈現(xiàn)異常高表達且與胰腺導(dǎo)管腺癌患者的腫瘤大小顯著相關(guān)；MCM4 的表達與胰腺導(dǎo)管腺癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。以上結(jié)果表明，MCM4 可能是胰腺導(dǎo)管腺癌的潛在生物標記物。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突