袁令興 李秀峰 顧傳蘭 盧世軍 婁慶艷 劉源 林繁錄 徐英民

臨沂市中心醫(yī)院泌尿外科276400

0 引 言

腎癌在全球男性中的發(fā)病率位于第6 位，在全球女性中的發(fā)病率居于第8 位[1]，且在我國(guó)的發(fā)病率呈現(xiàn)一個(gè)逐年遞增的趨勢(shì)[2]。腎癌的死亡率位居全球前十位，是一類嚴(yán)重的惡性腫瘤疾病[3]。近年來(lái)，針對(duì)天然藥物中的抗癌活性成分在腫瘤治療中的研究越來(lái)越多，很多療效甚佳的天然藥物被發(fā)掘出來(lái)。補(bǔ)骨脂素為傳統(tǒng)中藥補(bǔ)骨脂的主要化學(xué)成分[4]，對(duì)眾多腫瘤細(xì)胞具有顯著的抑制作用，有望成為一種療效顯著的抗癌藥物[5-7]。然而，補(bǔ)骨脂素對(duì)腎癌細(xì)胞的影響尚不明確。本研究中，利用體外培養(yǎng)的腎癌細(xì)胞系HTB-47 和CRL-1932，觀察補(bǔ)骨脂素對(duì)腎癌細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響，探索細(xì)胞培養(yǎng)前期的最合適的補(bǔ)骨脂素濃度。此外，分析補(bǔ)骨脂素對(duì)細(xì)胞增殖抗原（marker of proliferation Ki-67，MKI67）和增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表達(dá)的影響，研究其抑制增殖的機(jī)制；分析補(bǔ)骨脂素對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase,MMP2）和MMP9 表達(dá)的影響，研究其抑制遷移、侵襲的內(nèi)在機(jī)制。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步尋找腎癌新的治療靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

HTB-47 與CRL-1932 腎癌細(xì)胞系（美國(guó)ATCC 細(xì)胞公司），Ki67/MKI67 抗體（ab156872）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）抗體（ab8245）、PCNA 抗體（ab29）、MMP2抗體（ab92536）、MMP9 抗體（ab76003）、β-acting 蛋白（英國(guó)Abcam 公司），補(bǔ)骨脂素（西亞化學(xué)科技有限公司），RPMI1640 培養(yǎng)液、胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司）。

CO2恒溫培養(yǎng)箱、Transwell 小室、細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶（美國(guó)Thermo Scientific 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及加藥處理

將5 mg 補(bǔ)骨脂素粉末溶于300 μl 二甲基亞砜中制成儲(chǔ)存液，保存在-80 ℃環(huán)境中。實(shí)驗(yàn)時(shí)根據(jù)需要用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）稀釋到指定濃度。

HTB-47 和CRL-1932 腎癌細(xì)胞系置于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清和1%青-鏈雙抗的RPMI1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，放入5%CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶后，用胰酶消化，然后將細(xì)胞離心吹打均勻鋪在6 孔板中。待6 孔板中的細(xì)胞密度達(dá)50%～70%時(shí)，對(duì)照組中加入二甲基亞砜，實(shí)驗(yàn)組中加入含補(bǔ)骨脂素為30 μg/ml 的二甲基亞砜溶液。加藥后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.2 蛋白印跡法（Western blot）檢測(cè)蛋白表達(dá)

HTB-47 和CRL-1932 細(xì)胞加補(bǔ)骨脂素處理24 h后，裂解細(xì)胞并萃取總蛋白。在測(cè)定蛋白濃度后，計(jì)算定量，然后用95 ℃變性處理5 min。進(jìn)行Western blot 檢測(cè)，根據(jù)步驟轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，之后將膜封閉，用1∶1000配 置 好 的MKI67、PCNA、MMP2、MMP9 和GAPDH一抗（1∶1000 稀釋）在4 ℃搖床孵育過(guò)夜。次日，二抗室溫孵育1 h），用電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）法進(jìn)行曝光。最后，用Image J 圖像處理軟件進(jìn)行灰度分析。

1.2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)

在鋪滿生長(zhǎng)HTB-47 和CRL-1932 細(xì)胞的培養(yǎng)板上用10 μL 移液槍的槍頭進(jìn)行細(xì)胞劃線，換新配制的含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基，在顯微鏡下拍照保存。然后加入補(bǔ)骨脂素，24 h 后，從細(xì)胞培養(yǎng)箱取出細(xì)胞培養(yǎng)板，換液后再次拍照。利用Image J 圖像處理軟件計(jì)算各組細(xì)胞的遷移距離，每組至少重復(fù)3 次。

1.2.4 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

在加入補(bǔ)骨脂素24 h 后，將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞以每室200 μL 細(xì)胞懸液（2×104/室） 接種于Transwell 小室的上室中，下室加入含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基。將Transwell 小室置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48 h 后取出。PBS 沖洗2 遍后，用4%多聚甲醛固定25 min，再次清洗后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的結(jié)晶紫在4 ℃染色30 min，染色結(jié)束后清洗晾干。在100 倍顯微鏡視野下，取4～5個(gè)視野進(jìn)行拍照計(jì)數(shù)，每組至少重復(fù)3 次。

1.2.5 增殖克隆形成實(shí)驗(yàn)

在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化并計(jì)數(shù)后，以每孔2000 個(gè)細(xì)胞的密度接種于6 孔板中，然后放于細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)5～7 天后，取出6孔板，用PBS 沖洗2 次，每次3 min。然后，每孔加入1 ml 質(zhì)量濃度為40 g/L 的多聚甲醛溶液，置于4 ℃固定30 min，再次用PBS 沖洗2 次，用配制好的結(jié)晶紫工作液在4 ℃條件下染色30 min。染色結(jié)束后，取出6 孔板，再次用PBS 清洗，風(fēng)干。用Image J 圖像處理軟件統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)，每組重復(fù)不少于3 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad 7.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 補(bǔ)骨脂素對(duì)HTB-47 和CRL-1932 細(xì)胞增殖能力的影響

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相對(duì)于二甲基亞砜處理的對(duì)照組，補(bǔ)骨脂素處理的HTB-47 和CRL-1932細(xì)胞的克隆形成能力明顯受到抑制（圖1A）。該結(jié)果說(shuō)明補(bǔ)骨脂素對(duì)HTB-47 和CRL-1932 細(xì)胞的增殖能力有影響。為了進(jìn)一步說(shuō)明補(bǔ)骨脂素的抑制作用，用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit 8，CCK8）進(jìn)行了細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組中HTB-47 和CRL-1932 細(xì)胞的增殖明顯受到抑制（圖1B）。上述結(jié)果證實(shí)補(bǔ)骨脂素對(duì)于腎癌細(xì)胞的增殖有抑制作用。

圖1 補(bǔ)骨脂素對(duì)HTB-47 和CRL-1932 腎癌細(xì)胞增殖的抑制作用

2.2 Western blot 結(jié)果

使用Western blot 法檢測(cè)HTB-47 和CRL-1932細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白（MKI67、PCNA）的表達(dá)情況。MKI67 是一種核抗原，是細(xì)胞增殖的標(biāo)記物，其指數(shù)高低與許多腫瘤的分化程度、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)；PCNA 是增殖細(xì)胞核抗原，僅存在于正常增殖細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中，在細(xì)胞增殖的啟動(dòng)方面起重要作用，是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)。Western blot 結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組HTB-47 和CRL-1932 細(xì)胞的MKI67 蛋白表達(dá)明顯受到抑制（圖2A），PCNA 的蛋白表達(dá)也明顯下調(diào)（圖2B）。該結(jié)果提示，補(bǔ)骨脂素可能是通過(guò)降低MKI67 和PCNA的表達(dá)從而抑制HTB-47 和CRL-1932 細(xì)胞的增殖。

圖2 補(bǔ)骨脂素對(duì)腎癌細(xì)胞中MKI67 和PCNA 的影響

2.3 補(bǔ)骨脂素對(duì)HTB-47 和CRL-1932 細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

Transwell 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組，即補(bǔ)骨脂素處理后的HTB-47 和CRL-1932 細(xì)胞的侵襲能力明顯受到抑制（圖3A）。說(shuō)明補(bǔ)骨脂素可明顯抑制HTB-47 和CRL-1932 腎癌細(xì)胞的侵襲能力。為了進(jìn)一步驗(yàn)證此結(jié)論，又進(jìn)行了劃痕實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組腎癌細(xì)胞的遷移距離明顯小于對(duì)照組細(xì)胞（圖3B）。該結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明補(bǔ)骨脂素對(duì)HTB-47 和CRL-1932 細(xì)胞的侵襲、遷移能力有抑制作用。上述結(jié)果提示，補(bǔ)骨脂素可能作為腎癌治療的一種潛在有效的治療藥物，有助于提高患者的治愈率和生存率。

圖3 補(bǔ)骨脂素對(duì)HTB-47 和CRL-1932 腎癌細(xì)胞侵襲和遷移的抑制作用

2.4 補(bǔ)骨脂素對(duì)腎癌細(xì)胞中MMP 蛋白的影響

MMP2 和MMP9 是MMP 基因家族的成員，二者主要功能在于降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白并參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其高水平表達(dá)常與腫瘤的侵襲和遷移相關(guān)聯(lián)。因此，測(cè)定對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組腎癌細(xì)胞中MMP2 和MMP9 的表達(dá)水平，以此分析補(bǔ)骨脂素對(duì)腎癌細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響機(jī)制。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組，即補(bǔ)骨脂素處理的HTB-47 和CRL-1932 細(xì)胞中的MMP2和MMP9 蛋白水平明顯低于對(duì)照組（圖4）。該結(jié)果提示，補(bǔ)骨脂素可能通過(guò)下調(diào)MMP2 和MMP9 的蛋白表達(dá)水平，從而抑制HTB-47 和CRL-1932 腎癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力。

圖4 補(bǔ)骨脂素對(duì)腎癌細(xì)胞中MMP2 和MMP9 蛋白表達(dá)水平的影響

3 討 論

腎癌高居不下的發(fā)病率和死亡率是其診治過(guò)程中的最大難題[8]。近年來(lái)，盡管腎癌的治療技術(shù)已經(jīng)得到了顯著的進(jìn)展，手術(shù)切除、新輔助放化療、內(nèi)分泌治療、免疫治療、靶向治療、中醫(yī)藥治療等多種治療方式的聯(lián)合，使腎癌患者的5年生存率得到了極大提高，預(yù)后也明顯得到改善[9-10]。但每年因腎癌死亡的患者數(shù)量仍然很大，改進(jìn)或創(chuàng)新腎癌的治療方案仍然是急需解決的問(wèn)題[11]。

補(bǔ)骨脂素是傳統(tǒng)中藥補(bǔ)骨脂種子中的主要有效成分，屬于呋喃豆素類化合物[12]。大量研究結(jié)果表明，補(bǔ)骨脂素具有廣泛的藥理作用和生物活性，涉及保護(hù)心血管、抗組胺作用、促進(jìn)粒細(xì)胞的生長(zhǎng)、抗生育雌激素樣等多方面作用[13-14]。近年來(lái)，補(bǔ)骨脂素的抗腫瘤作用得到廣泛研究，其在腫瘤治療中的作用也逐漸被重視。大量學(xué)者通過(guò)體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系及實(shí)體腫瘤有明顯的抑制作用，包括乳腺癌[5]、白血病、肝癌[6]、肺癌[15]、前列腺癌、黏液表皮樣癌等。然而，補(bǔ)骨脂素在腎癌中的作用效果還尚不明晰，缺少詳細(xì)的研究來(lái)分析補(bǔ)骨脂素對(duì)腎癌細(xì)胞的具體影響。本研究旨在初步研究補(bǔ)骨脂素對(duì)HTB-47 和CRL-1932 腎癌細(xì)胞系的影響，并探討其內(nèi)在影響機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，補(bǔ)骨脂素處理之后的HTB-47和CRL-1932 腎癌細(xì)胞的增殖克隆能力明顯減弱，腎癌細(xì)胞的增殖能力被顯著抑制。為了解釋這一抑制現(xiàn)象，檢測(cè)了對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組腎癌細(xì)胞中的重要增殖指標(biāo)，即MKI67 和PCNA 的蛋白表達(dá)量。結(jié)果顯示，補(bǔ)骨脂素處理的HTB-47 和CRL-1932 腎癌細(xì)胞中，MKI67 和PCNA 的表達(dá)明顯下調(diào)。這可能是補(bǔ)骨脂素抑制腎癌細(xì)胞增殖的內(nèi)在機(jī)制。此外，Transwell 和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，補(bǔ)骨脂素處理的HTB-47 和CRL-1932 腎癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力也明顯受到抑制。因此，通過(guò)免疫印跡法測(cè)定了對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中MMP2 和MMP9 的蛋白表達(dá)量，以探究補(bǔ)骨脂素對(duì)HTB-47 和CRL-1932 腎癌細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響機(jī)制。結(jié)果顯示，補(bǔ)骨脂素處理的HTB-47 和CRL-1932 腎癌細(xì)胞中的MMP2 和MMP9 表達(dá)量顯著下調(diào)。該結(jié)果提示，補(bǔ)骨脂素可能是通過(guò)介導(dǎo)MMP2 和MMP9 來(lái)抑制腎癌細(xì)胞的侵襲和遷移。但本研究中僅初步探討了補(bǔ)骨脂素抑制腎癌進(jìn)展的內(nèi)在機(jī)制，具體的內(nèi)在作用和詳細(xì)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

傳統(tǒng)中藥成分補(bǔ)骨脂素可顯著抑制HTB-47 和CRL-1932 腎癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，其機(jī)制可能涉及下調(diào)MKI67、PCNA、MMP2 和MMP9 的蛋白表達(dá)。補(bǔ)骨脂素有望作為一個(gè)治療腎癌的潛在而有效的藥物。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突