林李泉 韋信賢 林國(guó)榮 譚紅連 黃婷 劉明珠 楊艷 童桂香

摘要：【目的】明確催乳素基因（PRL1和PRL2）在黑鯛不同組織及不同鹽度脅迫下的表達(dá)模式，為黑鯛養(yǎng)殖過(guò)程中最適鹽度范圍的確定提供參考依據(jù)?！痉椒ā客ㄟ^(guò)RT-PCR擴(kuò)增黑鯛PRL1和PRL2基因，以ExPASy、NetNGlyc及SWISS-MODEL等在線軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PRL1和PRL2基因在黑鯛不同組織及不同鹽度脅迫下的表達(dá)情況。【結(jié)果】黑鯛PRL1基因開(kāi)放閱讀框（ORF）全長(zhǎng)639 bp，共編碼212個(gè)氨基酸殘基，其編碼蛋白分子量為23.32 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為6.70;黑鯛PRL2基因ORF全長(zhǎng)750 bp，共編碼249個(gè)氨基酸殘基，其編碼蛋白分子量為28.31 kD，pI為8.37。黑鯛PRL1和PRL2蛋白均由1個(gè)為信號(hào)肽結(jié)構(gòu)域和1個(gè)為Hormone 1結(jié)構(gòu)域組成;黑鯛PRL1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占69.34%、無(wú)規(guī)則卷曲占30.66%，包含1個(gè)糖基化位點(diǎn)及37個(gè)磷酸化位點(diǎn);黑鯛PRL2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占67.07%、無(wú)規(guī)則卷曲占32.93%，包含1個(gè)糖基化位點(diǎn)及21個(gè)磷酸化位點(diǎn)。黑鯛PRL1和PRL2基因在12個(gè)待檢測(cè)組織中均有表達(dá)，且均以腦組織中的相對(duì)表達(dá)量最高，顯著高于其他組織中的相對(duì)表達(dá)量（P<0.05，下同）;在鹽度5‰處理組中，黑鯛PRL1基因在脅迫4 h開(kāi)始顯著上調(diào)，黑鯛PRL2基因在脅迫8 h開(kāi)始極顯著上調(diào)（P<0.01），二者均在脅迫24 h時(shí)達(dá)峰值，隨后開(kāi)始緩慢下降，至脅迫72 h時(shí)其相對(duì)表達(dá)量仍顯著高于對(duì)照組;在鹽度25‰和35‰處理組中，黑鯛PRL1和PRL2基因在脅迫72 h時(shí)其相對(duì)表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組?！窘Y(jié)論】低鹽脅迫能促進(jìn)黑鯛PRL1和PRL2基因的表達(dá)，高鹽脅迫則抑制黑鯛PRL1和PRL2基因的表達(dá)，即黑鯛PRL1和PRL2基因在其適應(yīng)淡水環(huán)境的過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。

關(guān)鍵詞： 黑鯛;催乳素（PRL）;PRL1基因;PRL2基因;鹽脅迫;組織表達(dá)

中圖分類(lèi)號(hào)： S917.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）12-3254-11

Expression analysis of Acanthopagrus schlegelii PRL1 and

PRL2 in response to acute salinity stress

LIN Li-quan1， WEI Xin-xian2， LIN Guo-rong1， TAN Hong-lian2， HUANG Ting2，

LIU Ming-zhu3， YANG Yan2， TONG Gui-xiang2*

（1Hengsheng Aquaculture Professional Cooperative of Yangxi， Yangjiang， Guangdong? 529500， China; 2Guangxi? Academy of Fishery Science/Guangxi Key Laboratory of Aquatic Genetic Breeding and Healthy Aquaculture， Nanning 530021， China; 3Guangxi Academy of Sciences/Guangxi Engineering Research Center for Fishery Major Diseases

Control and Efficient Healthy Breeding Industrial Technology （GERCFT）， Nanning? 530007， China）

Abstract：【Objective】To understand the expression patterns of prolactin genes （PRL1 and PRL2） in different tissues and under different salinity stresses， so as to provide a reference for the determination of the optimal salinity range in the breeding process of Acanthopagrus schlegelii. 【Method】PRL1 and PRL2 genes of A. schlegelii were amplified by RT-PCR， and bioinformatics analysis was performed by ExPASy， NetNGlyc， Swiss-Model and other online softwares. The expression of PRL1 and PRL2 genes in different tissues and under different salinity stresses was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. 【Result】The full length of PRL1 open reading frame （ORF） was 639 bp， encoding 212 amino acids with a molecular weight of 23.32 kD and an isoelectric point（pI） of 6.70; and the ORF of PRL2 gene was 750 bp， encoding 249 amino acids with a molecular weight of 28.31 kD and pI of 8.37. PRL1 and PRL2 proteins were both composed of a signal peptide domain and a Hormone 1 domain. In the secondary structure of PRL1 protein， 69.34% of α-helix and 30.66% of random curl were found， including 1 glycosylation site and 37 phosphorylation sites. In the secondary structure of PRL2 protein， α-helix accounted for 67.07% and random curl accounted for 32.93%， including 1 glycosyla-tion site and 21 phosphorylation sites. The results of tissue expression analysis showed that PRL1 and PRL2 genes were expressed in all 12 tested tissues. The highest expression levels of PRL1 and PRL2 were both detected in brain， significantly higher than the relative expression levels in other tissues （P<0.05， the same below）. In the 5‰ salinity treatment group， PRL1 gene was significantly up-regulated at 4 h under salt stress， PRL2 gene was extremely significantly up-regulated at 8 h under stress （P<0.01）. Both of them reached peak value at 24 h， then began to decline slowly， and their expression levels were still significantly higher than those of the control group at 72 h of stress. The expression levels of PRL1 and PRL2 genes in the 25‰ and 35‰ salinity treatment groups were significantly lower than those in the control group after 72 h stress. 【Conclusion】Low salinity stress can promote the expression of PRL1 and PRL2 genes， while high salinity stress can inhibit the expression of PRL1 and PRL2 genes. In other words， A. schlegelii PRL1 and PRL2 genes play important regulatory roles in the adaptation to fresh water.

Key words： Acanthopagrus schlegelii; prolactin（PRL）; PRL1 gene; PRL2 gene; salinity stress; tissue expression

Foundation item： Regional Project of National Natural Science Foundation of China（41966004）;Guangdong Science and Technology Development （Vertical Coordinated Management and Linkage Between Provinces and Cities） Special Project（2017B020246046）;Guangxi Innovation Team Project of National Modern Agricultural Industrial Technology System （nycytxgxcxtd-20-02）;Independent Research Project of Guangxi Key Laboratory of Aquatic Genetic Breeding and Healthy Breeding （2020-A-03-01）

0 引言

【研究意義】催乳素（Prolactin，PRL）是一種單鏈多肽類(lèi)激素，由動(dòng)物腦垂體合成及分泌，廣泛參與機(jī)體各種生物學(xué)功能，包括生長(zhǎng)發(fā)育、內(nèi)分泌代謝、繁殖泌乳、免疫調(diào)節(jié)及電解質(zhì)平衡等（Kelly et al.，2001;劉瑞鑫等，2013）。在魚(yú)類(lèi)研究中，同樣證實(shí)PRL是調(diào)節(jié)硬骨魚(yú)類(lèi)滲透壓和離子平衡的主要激素（Manzon，2002），在海水魚(yú)類(lèi)適應(yīng)淡水的過(guò)程中PRL在腦垂體和血漿中的合成與分泌顯著增加，認(rèn)為PRL是通過(guò)改變鰓、皮膚、腎臟及腸道等滲透壓調(diào)節(jié)器官的滲透性及離子運(yùn)輸途徑以減少水分吸收或增加離子吸收來(lái)實(shí)現(xiàn)水鹽平衡（左映平和曹勁松，2007）。因此，分析魚(yú)類(lèi)PRL基因在不同鹽度下的表達(dá)特征，了解其在鹽脅迫適應(yīng)方面的功能作用，對(duì)揭示海水魚(yú)類(lèi)滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制具有重要意義，同時(shí)能為海水魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖最適鹽度范圍的確定提供參考依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】PRL是廣鹽性硬骨魚(yú)類(lèi)適應(yīng)淡水的重要調(diào)節(jié)激素，通過(guò)降低魚(yú)類(lèi)鰓組織滲透率，并刺激鰓黏液細(xì)胞分泌黏液，減少Na+和Cl?的排出量，從而維持離子平衡（魏渲輝等，2001）。Yang等（1999）研究發(fā)現(xiàn)PRL基因在虹鱒胚胎形成和孵化過(guò)程中均有表達(dá)，即在魚(yú)體早期發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用;左映平和曹勁松（2007）在海水羅非魚(yú)中發(fā)現(xiàn)PRL能引起腎臟中的Na重吸收和水排泄量增加，并證實(shí)PRL是通過(guò)作用于腎小球而發(fā)揮作用;Breves等（2011）在莫桑比克羅非魚(yú)淡水馴化中發(fā)現(xiàn)PRL發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，并證實(shí)PRL信號(hào)通路與斑馬魚(yú)鰓組織中的Cl?攝取能力密切相關(guān)（Breves et al.，2013）;Cunha等（2019）在藍(lán)鰓太陽(yáng)魚(yú)中的研究發(fā)現(xiàn)PRL對(duì)魚(yú)體的養(yǎng)育行為和攻擊行為均有重要影響;Takashi等（2019）研究證實(shí)PRL參與日本鰻鱺洄游過(guò)程中的滲透壓調(diào)節(jié);Hu等（2020）研究發(fā)現(xiàn)草魚(yú)PRL基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)受表皮生長(zhǎng)因子（Epidermal growth factor，EGF）的影響;Villalba等（2020）研究表明PRL基因在虹鱒免疫反應(yīng)中也參與調(diào)控作用;Si等（2021）研究表明PRL在牙鲆變態(tài)發(fā)育尤其是眼睛的不平衡遷移過(guò)程中發(fā)揮重要作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】黑鯛（Acanthopagrus schlegelii）隸屬于硬骨魚(yú)綱（Osteichthyes）鱸形目（Perciformes）鯛科（Sparidae），是一種暖溫性底層海水魚(yú)類(lèi)（林李泉等，2021），廣泛分布在我國(guó)渤海、黃海、東海、南海沿海及臺(tái)灣海峽，因其具有生長(zhǎng)速度快和抗病力強(qiáng)等特點(diǎn)，且兼具廣溫性和廣鹽性及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)（鄧惠文等，2019），而深受廣大養(yǎng)殖戶(hù)和消費(fèi)者的喜愛(ài)。目前，有關(guān)鹽度對(duì)黑鯛影響的研究主要集中在生長(zhǎng)、生理生化及營(yíng)養(yǎng)成分分析等方面（Min et al.，2015;賈超峰，2020;王裕玉等，2020）;此外，熱休克蛋白和胰島素生長(zhǎng)因子I （鄧?yán)龋?003）、催乳激素及其受體（Chang et al.，2007;Tomy et al.，2009）、水通道蛋白和精氨酸催產(chǎn)素受體（An et al.，2008）及抗氧化基因（An et al.，2010）等對(duì)黑鯛的鹽度適應(yīng)機(jī)制也起到一定作用，但至今鮮見(jiàn)基于PRL基因表達(dá)水平探究黑鯛鹽度適應(yīng)機(jī)制的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增黑鯛PRL1和PRL2基因，以ExPASy、NetNGlyc及SWISS-MODEL等在線軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR探討PRL基因在黑鯛不同組織及不同鹽度脅迫下的表達(dá)模式，以期為黑鯛養(yǎng)殖過(guò)程中最適鹽度范圍的確定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

黑鯛幼魚(yú)（體質(zhì)量約30±3 g）由陽(yáng)西縣恒生水產(chǎn)養(yǎng)殖專(zhuān)業(yè)合作社提供，共500尾，試驗(yàn)前將其置于300 L的海水循環(huán)養(yǎng)殖缸中暫養(yǎng)1周，水溫（28±1）℃，溶氧量控制在6.5～7.0 mg/L。暫養(yǎng)期間隨機(jī)挑選3尾黑鯛幼魚(yú)，采集其肝臟、腎臟、心臟、腦、眼、鰓、鰭條、脾臟、皮膚、腸道、性腺及白肌等12個(gè)組織，液氮保存?zhèn)溆?。RNA提取試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司，PCR產(chǎn)物回收試劑盒及pMD18-T載體購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，SYBR Green染料及RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TOYOBO公司，熒光定量檢測(cè)試劑盒SYBR Green PCR Master Mix購(gòu)自TaKaRa公司，大腸桿菌DH5α感受態(tài)購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1. 2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

鹽脅迫試驗(yàn)設(shè)5‰、15‰（對(duì)照組）、25‰和35‰共4個(gè)處理組，每組50尾黑鯛幼魚(yú)。將暫養(yǎng)的黑鯛幼魚(yú)隨機(jī)分配到各處理組中，分別于鹽脅迫第0、4、8、12、24、48和72 h隨機(jī)挑選3尾黑鯛幼魚(yú)采集鰓組織，置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 總RNA提取及cDNA合成

按RNA提取試劑盒說(shuō)明提取黑鯛幼魚(yú)鰓組織總RNA，以1.0%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000微量紫外分光光度計(jì)分別檢測(cè)總RNA的質(zhì)量及其濃度。利用RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA樣品-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 黑鯛PRL1和PRL2基因克隆

從已構(gòu)建的黑鯛基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中調(diào)取PRL基因序列作為參考，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)PRL基因擴(kuò)增引物（表1），以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA或基因組DNA樣品為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系25.0 μL，包括上、下游引物各1.0 μL，cDNA模板1.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。純化回收陽(yáng)性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將其連接至pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)搖床培養(yǎng)后接入含Amp+抗性的LB培養(yǎng)基上，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定，陽(yáng)性樣品送至廣州擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1. 5 黑鯛PRL基因生物信息學(xué)分析

在Ensembl基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中，對(duì)比黑鯛PRL基因組序列與近緣物種的基因組序列;利用DNAMAN對(duì)測(cè)序獲得的序列進(jìn)行拼接，運(yùn)用ClustalX 2.1進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析，再以MEGA 6.0中的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap設(shè)為1000次;使用ExPASy（http：//smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode）預(yù)測(cè)黑鯛PRL蛋白的結(jié)構(gòu)域、分子量、理論等電點(diǎn)（pI）及信號(hào)肽;運(yùn)用NetNGlyc（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGylc/）預(yù)測(cè)黑鯛PRL蛋白的糖基化和磷酸化位點(diǎn);采用PSIPRED （http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）分別預(yù)測(cè)黑鯛PRL蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1. 6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增特異性引物（表1），以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，以暫養(yǎng)黑鯛幼魚(yú)肝臟、腎臟、心臟、腦、眼、鰓、鰭條、脾臟、皮膚、腸道、性腺和白肌等12個(gè)組織的cDNA為模板進(jìn)行PRL基因組織表達(dá)特征分析，在LightCycler 96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。在鹽脅迫試驗(yàn)中，選擇鹽脅迫第0、4、8、12、24、48和72 h的鰓組織cDNA進(jìn)行PRL基因表達(dá)水平分析。所有樣品cDNA稀釋至100 ng/μL作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR的模板，實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系12.5 μL：cDNA模板1.0 μL，ChamQ SYBR qPCR Master Mix 6.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至12.5 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。采用2–△△CT法換算黑鯛PRL基因相對(duì)表達(dá)量（Livak and Schmittgen，2001），并以SPSS 19.0的單因素方差分析（One-way AMOVA）檢測(cè)其差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2. 1 黑鯛PRL基因序列特征分析結(jié)果

黑鯛PRL1基因開(kāi)放閱讀框（ORF）全長(zhǎng)639 bp，共編碼212個(gè)氨基酸殘基，編碼蛋白分子量為23.32 kD，pI為6.70;黑鯛PRL2基因ORF全長(zhǎng)750 bp，共編碼249個(gè)氨基酸殘基，編碼蛋白分子量為28.31 kD，pI為8.37。ExPASy預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，黑鯛PRL1和PRL2蛋白均由2個(gè)結(jié)構(gòu)域（圖1）組成，即1個(gè)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)域和1個(gè)Hormone 1結(jié)構(gòu)域。

黑鯛PRL1基因在基因組上的全長(zhǎng)為2678 bp，含有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子。黑鯛PRL2基因在基因組上的全長(zhǎng)為3211 bp，含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子（圖2）。此外，PRL1基因中各物種的外顯子和內(nèi)含子數(shù)目較保守;在PRL2基因方面，黑鯛PRL2基因和青鳉PRL2基因均包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，而大黃魚(yú)（Larimichthys crocea）、河豚（Takifugu rubripes）和斑馬魚(yú)（Danio rerio）PRL2基因包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子（表2）。

2. 2 黑鯛PRL基因同源比對(duì)分析結(jié)果

利用ClustalX 2.1進(jìn)行PRL1和PRL2氨基酸序列比對(duì)分析，結(jié)果表明，黑鯛PRL1氨基酸序列與黃鰭鯛（A. latus）PRL1氨基酸序列的相似性最高，達(dá)99.1%;其次是與金頭鯛（Sparus aurata），二者的PRL1氨基酸序列相似性為93.4%;與小鼠（Mus musculus）及人類(lèi)（Homo sapiens）等外源物種的PRL氨基酸序列相似性較低，分別為33.2%和35.0%（表3）。同樣，黑鯛PRL2氨基酸序列與黃鰭鯛PRL2氨基酸序列的相似性也最高，為98.6%;與金頭鯛PRL2氨基酸序列的相似性為96.0%;與小鼠、雞（Gallus gallus）及人類(lèi)等外源物種的PRL氨基酸序列相似性較低，分別為32.9%、31.6%和28.9%（表4）。

基于PRL氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖3）顯示，黑鯛PRL1氨基酸序列與黃鰭鯛PRL1氨基酸序列先聚為一支，再與鄰近鱸形目的金頭鯛、平鯛（Rhabdosargus sarba）及真鯛（Pagrus major）等魚(yú)類(lèi)的PRL1氨基酸序列聚在一起，最后與斜帶石斑魚(yú)（Epinephelus coioides）、大黃魚(yú)、花鱸（Lateolabrax japonicus）等硬骨魚(yú)類(lèi)的PRL1氨基酸序列聚為一支;黑鯛PRL2氨基酸序列則與黃鰭鯛PRL2氨基酸序列先聚為一支，再與金頭鯛、高體鰤（Seriola dumerili）、海參斑（Cyclopterus lumpus）、蔭平鲉（Sebastes umbrosus）等魚(yú)類(lèi)的PRL2氨基酸序列聚在一起，最后與龍膽石斑魚(yú)（E. lanceolatus）PRL2氨基酸序列聚為一支;人類(lèi)和小鼠的PRL氨基酸序列先聚在一起，再與雞PRL氨基酸序列聚為一支。

2. 3 黑鯛PRL蛋白結(jié)構(gòu)及其糖基化和磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

在黑鯛PRL1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占69.34%、無(wú)規(guī)則卷曲占30.66%;NetNGlyc預(yù)測(cè)結(jié)果（圖4）表明，黑鯛PRL1氨基酸序列中包含1個(gè)糖基化位點(diǎn)及37個(gè)磷酸化位點(diǎn)，37個(gè)磷酸化位點(diǎn)中包括：13個(gè)細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶2（cdc2）位點(diǎn)、10個(gè)蛋白激酶C（PKC）位點(diǎn)、5個(gè)DNA依賴(lài)蛋白激酶（DNAPK）位點(diǎn)、4個(gè)蛋白激酶A（PKA）位點(diǎn)、1個(gè)酪蛋白激酶2（CKII）位點(diǎn)、1個(gè)核糖體蛋白激酶（RSK）位點(diǎn)、1個(gè)細(xì)胞周期依賴(lài)蛋白激酶5（cdk5）位點(diǎn)、1個(gè)絲氨酸/蘇氨酸激酶（ATM）位點(diǎn)和1個(gè)細(xì)胞分裂素活化蛋白激酶（p38MAPK）位點(diǎn)。在黑鯛PRL2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占67.07%、無(wú)規(guī)則卷曲占32.93%;NetNGlyc預(yù)測(cè)結(jié)果（圖5）表明，黑鯛PRL1氨基酸序列中包含1個(gè)糖基化位點(diǎn)及21個(gè)磷酸化位點(diǎn)，21個(gè)磷酸化位點(diǎn)中包括：6個(gè)蛋白激酶C（PKC）位點(diǎn)、6個(gè)蛋白激酶A（PKA）位點(diǎn)、2個(gè)酪蛋白激酶2（CKII）位點(diǎn)、2個(gè)核糖體蛋白激酶（RSK）位點(diǎn)、1個(gè)細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶2（cdc2）位點(diǎn)、1個(gè)DNA依賴(lài)蛋白激酶（DNAPK）位點(diǎn)、1個(gè)細(xì)胞周期依賴(lài)蛋白激酶5（cdk5）位點(diǎn)、1個(gè)絲氨酸/蘇氨酸激酶（ATM）位點(diǎn)和1個(gè)細(xì)胞分裂素活化蛋白激酶（p38MAPK）位點(diǎn)。黑鯛PRL1和PRL2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，二者均具有由4個(gè)長(zhǎng)α-螺旋組成的反式平行排列特征（圖6）。

2. 4 黑鯛PRL基因組織表達(dá)分析結(jié)果

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)黑鯛PRL1和PRL2基因在不同組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示黑鯛PRL1和PRL2基因在12個(gè)待檢測(cè)組織中均有表達(dá)。其中，黑鯛PRL1基因在腦組織中的相對(duì)表達(dá)量最高，顯著高于其他組織中的相對(duì)表達(dá)量（P<0.05，下同），其次是性腺和鰓組織，在心臟中的相對(duì)表達(dá)量最低（圖7-A）;黑鯛PRL2基因在不同中組織中的表達(dá)水平與黑鯛PRL1基因基本一致，以腦組織中的相對(duì)表達(dá)量最高，其次是性腺和鰓組織，而在鰭條中的相對(duì)表達(dá)量最低（圖7-B）。

在鹽脅迫試驗(yàn)中，選取不同鹽脅迫處理的黑鯛幼魚(yú)鰓組織探究PRL1和PRL2基因的表達(dá)情況。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果（圖8）表明，在對(duì)照組中，黑鯛PRL1和PRL2基因的相對(duì)表達(dá)量不會(huì)隨著時(shí)間推移而顯著變化。在鹽度5‰處理組中，黑鯛PRL1基因在脅迫4 h開(kāi)始顯著上調(diào)，至脅迫24 h是達(dá)峰值，隨后開(kāi)始緩慢下降，至脅迫72 h時(shí)其相對(duì)表達(dá)量仍顯著高于對(duì)照組;黑鯛PRL2基因則在脅迫8 h開(kāi)始極顯著上調(diào)（P<0.01），至脅迫24 h時(shí)達(dá)峰值，隨后開(kāi)始緩慢下降，至脅迫72 h時(shí)其相對(duì)表達(dá)量仍顯著高于對(duì)照組。在鹽度25‰處理組中，黑鯛PRL1基因在脅迫72 h時(shí)的相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)，黑鯛PRL2基因則在脅迫48 h時(shí)開(kāi)始顯著下調(diào)，至脅迫72 h時(shí)其相對(duì)表達(dá)量仍顯著低于對(duì)照組。在鹽度35‰處理組中，黑鯛PRL1基因在脅迫72 h時(shí)其相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)，黑鯛PRL2基因則在脅迫48 h時(shí)開(kāi)始顯著下調(diào)，至脅迫72 h時(shí)其相對(duì)表達(dá)量仍顯著低于對(duì)照組。

綜上所述，低鹽脅迫能顯著促進(jìn)黑鯛PRL1和PRL2基因的表達(dá)，且從早期脅迫即開(kāi)始產(chǎn)生顯著影響，一直持續(xù)到脅迫結(jié)束;高鹽脅迫則抑制黑鯛PRL1和PRL2基因的表達(dá)，但其抑制效果在脅迫后期才開(kāi)始體現(xiàn)?？梢?jiàn)，PRL1和PRL2基因在黑鯛調(diào)節(jié)滲透壓及離子平衡過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

3 討論

PRL是一種單鏈多肽類(lèi)激素，由動(dòng)物腦垂體合成及分泌，廣泛參與機(jī)體的各種生物學(xué)功能，在魚(yú)類(lèi)研究中認(rèn)為PRL是調(diào)節(jié)硬骨魚(yú)類(lèi)滲透壓和離子平衡的主要激素（陳松林等，1996;Manzon，2002）。本研究克隆獲得黑鯛PRL1和PRL2基因，其中，黑鯛PRL1基因編碼212個(gè)氨基酸殘基，黑鯛PRL2基因編碼249個(gè)氨基酸殘基。黑鯛PRL蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，PRL1和PRL2蛋白均由1個(gè)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)域和1個(gè)Hormone 1結(jié)構(gòu)域組成。目前，已知大多數(shù)物種的PRL蛋白均由200多個(gè)氨基酸組成，其信號(hào)肽約包含20個(gè)氨基酸，C端緊接鄰1個(gè)Hormone 1結(jié)構(gòu)域。其中，人類(lèi)PRL蛋白全長(zhǎng)包含227個(gè)氨基酸，其信號(hào)肽由28個(gè)氨基酸組成;鼠PRL蛋白全長(zhǎng)包含226個(gè)氨基酸，其信號(hào)肽由21個(gè)氨基酸組成;雞PRL蛋白全長(zhǎng)包含229個(gè)氨基酸，其信號(hào)肽由23個(gè)氨基酸。可見(jiàn)，黑鯛PRL1和PRL2蛋白氨基酸序列長(zhǎng)度及相關(guān)結(jié)構(gòu)域長(zhǎng)度與大多數(shù)物種相似。

黑鯛PRL1和PRL2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，在黑鯛PRL1和PRL2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)約有70.00%的氨基酸序列以α-螺旋形式結(jié)構(gòu)存在，剩氨基酸余序列則呈無(wú)規(guī)則卷曲。黑鯛PRL1和PRL2氨基酸序列中均只含有1個(gè)糖基化位點(diǎn)，但包含多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，在黑鯛PRL1氨基酸序列中以cdc2位點(diǎn)最多（13個(gè)），而黑鯛PRL2氨基酸序列中以PKC位點(diǎn)最多（6個(gè)），暗示二者在翻譯后修飾過(guò)程中受到的激酶調(diào)控模式存在差異。黑鯛PRL1和PRL2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)均具有由4個(gè)長(zhǎng)α-螺旋組成的反式平行排列特征，與在人類(lèi)中的研究結(jié)果（Maus et al.，1999）相似，提示PRL在低等脊椎動(dòng)物和高等脊椎動(dòng)物中均以相似的結(jié)構(gòu)域來(lái)發(fā)揮蛋白功能。

早期針對(duì)魚(yú)類(lèi)PRL基因的研究主要集中在垂體和性腺等組織中，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用RT-PCR在越來(lái)越多的魚(yú)類(lèi)垂體和性腺以外的其他組織中陸續(xù)檢測(cè)到PRL基因表達(dá)。Santos等（1999）在海鯛的垂體、鰓、腸道、肝臟、卵巢和精巢中均檢測(cè)到PRL基因表達(dá);Imaoka等（2000）研究發(fā)現(xiàn)PRL基因在金魚(yú)的腦、性腺、皮膚、肌肉、肝臟、脾臟和腎臟中均有表達(dá);Zhang等（2004）在斜帶石斑魚(yú)中同樣發(fā)現(xiàn)PRL基因在腦、垂體、性腺、鰓、肝臟、脾臟和腎臟中均有表達(dá)，但在腎臟和肝臟等組織中的相對(duì)表達(dá)量較低。本研究以實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析黑鯛PRL1和PRL2基因在不同組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，黑鯛PRL1和PRL2基因在12個(gè)待檢測(cè)的組織中均有表達(dá)。其中，黑鯛PRL1基因在腦組織中的相對(duì)表達(dá)量最高，其次是性腺和鰓組織，在心臟中的相對(duì)表達(dá)量最低;黑鯛PRL2基因在不同中組織的表達(dá)水平與黑鯛PRL1基因基本一致，同樣以腦組織中的相對(duì)表達(dá)量最高，其次是性腺和鰓組織，而在鰭條中的相對(duì)表達(dá)量最低。表明黑鯛PRL基因同其他魚(yú)類(lèi)一樣，具有廣泛表達(dá)性，且以腦組織、性腺及鰓組織中的表達(dá)量較高。

在鹽脅迫試驗(yàn)中，選取不同鹽脅迫處理的黑鯛幼魚(yú)鰓組織探究PRL1和PRL2基因的表達(dá)情況，結(jié)果表明，低鹽脅迫能顯著促進(jìn)黑鯛PRL1和PRL2基因的表達(dá)，且從早期脅迫即開(kāi)始產(chǎn)生顯著影響，并一直持續(xù)到脅迫結(jié)束;高鹽脅迫則抑制黑鯛PRL1和PRL2基因的表達(dá)，但其抑制效果在脅迫后期才開(kāi)始體現(xiàn)。前人的相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)，黑鯛在適應(yīng)淡水環(huán)境時(shí)其PRL基因參與調(diào)節(jié)體內(nèi)Na+、Cl?及Ca+等離子的平衡，從而提高魚(yú)體適應(yīng)淡水環(huán)境過(guò)程的滲透調(diào)節(jié)能力（Chang et al.，2007）。PRL基因在廣鹽性硬骨魚(yú)類(lèi)適應(yīng)淡水環(huán)境的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)水平在垂體和血清中均呈上調(diào)趨勢(shì)，導(dǎo)致鰓、腎臟、腸道、皮膚和膀胱等滲透調(diào)節(jié)器官的滲透性和離子運(yùn)輸機(jī)制發(fā)生改變，從而減少魚(yú)體對(duì)水分的攝入或增加對(duì)離子的吸收，最終起到調(diào)節(jié)滲透壓平衡的效果。

4 結(jié)論

低鹽脅迫能促進(jìn)黑鯛PRL1和PRL2基因的表達(dá)，高鹽脅迫則抑制黑鯛PRL1和PRL2基因的表達(dá)，即黑鯛PRL1和PRL2基因在其適應(yīng)淡水環(huán)境的過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）