魏 琴，買買艾力·玉山，張繼秀，吳 碩，馬 創(chuàng)

（1新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，2新疆醫(yī)學(xué)動物模型研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830011；3新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科中心，烏魯木齊830054；4新疆昌吉職業(yè)技術(shù)學(xué)院，昌吉831100）

由創(chuàng)傷、感染、惡性腫瘤等引起的骨缺損，臨床上處理比較困難，一般選用自體移植和異體移植的方法[1-2]，較小的骨缺損一般選用自體或同種異體骨移植的方法進(jìn)行治療，而自體移植存在來源少、生長慢等的限制[3]，異體移植存在免疫排斥、植骨存活率低等問題[4]。目前采用牽張成骨（DO）的技術(shù)取得了良好的療效[5-7]。牽張成骨技術(shù)作為一種內(nèi)源性組織工程技術(shù)，又被稱為“自體骨組織工程技術(shù)”。但也存在新骨鈣化慢，治療周期長的問題[8]。為了加快新骨形成速度，研究人員引入干細(xì)胞[9]、生長因子[10]、激素[11]等促進(jìn)新骨及其周圍組織生成。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）可以作為種子細(xì)胞應(yīng)用于DO骨的再生[12-13]，BMSCs具有很強(qiáng)的增殖和分化能力，作為多能造血干細(xì)胞可以在不同誘導(dǎo)因子的作用下向成骨細(xì)胞[14]、血管細(xì)胞[15]、神經(jīng)細(xì)胞[16]、骨骼肌細(xì)胞[17]等方面分化，這些細(xì)胞對于新骨的生成、牽張區(qū)結(jié)締組織的構(gòu)建、周圍軟組織的恢復(fù)以及DO新生骨痂的形成都具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)擬采用血小板衍生生長因子BB(platelet-derived growth factor-BB，PDGF-BB)誘導(dǎo)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化，為后期PDGFBB誘導(dǎo)后的細(xì)胞移植到牽張成骨區(qū)域是否能夠加速動物模型骨折的愈合速度提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 普通級健康新西蘭大白兔5只，雄性，4周齡，體重(2.0±0.2)kg，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物使用許可證號：SYXK(新)2018-0003。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物使用和管理委員會審核，倫理審批號：IACUC20180925-01。所有實(shí)驗(yàn)動物均在新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心按照國際AAALAC標(biāo)準(zhǔn)，遵循3R原則統(tǒng)一管理。

1.1.2 主要試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司,美國)；澳洲胎牛血清(1099141,Gibco公司,美國)；1%青鏈霉素(Hyclone公司,美國);0.25%trypsin-0.02%EDTA消化液(Hyclone公司,美國);PBS(Hyclone公司,美國);CCK-8(日本同仁化學(xué)研究所)；骨鈣蛋白(osteocalcin，OCN)(Abcam，ab13418,英國)；Ⅰ型膠原(COLIA1)(Novus Biologicals NB600-450，美國)；Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx-2)(博奧森bs-1134R,中國);一抗人PDGF-BB(Catalog#100-14B;R&D,美國)；C02恒溫培養(yǎng)箱(Thermo公司,美國)；酶標(biāo)儀(Thermo公司,美國)；流式細(xì)胞儀(BD公司,孟加拉國)；熒光倒置顯微鏡(Zeiss公司，德國)。

1.2 方法

1.2.1 兔骨髓的提取 碘伏棉球消毒新西蘭大白兔雙耳，沿耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)用于麻醉，采取正常體位由課題組成員將兔固定于手術(shù)臺上，用骨髓穿刺針行髂前上棘穿刺骨髓，有落空感后抽出針芯，用20 mL注射器抽取5 mL骨髓液，注射器內(nèi)預(yù)先含5 g/L肝素用于抗凝。

1.2.2 兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 將抽出的骨髓懸液迅速拿到超凈工作臺，注入到等體積的DMEM培養(yǎng)基中，DMEM培養(yǎng)基中含有200 U/mL青鏈霉素，用新的20 mL注射器，更換為小號針頭，反復(fù)吸吹骨髓懸液3遍，將骨髓小粒盡可能沖散，吸取細(xì)胞懸液于50 mL離心管中，1 000 r/min，5 min，棄上清，再用DMEM洗2遍，加入完全培養(yǎng)基（10%FBS+100 U/mL P/S+1%谷氨酰胺+DMEM），重懸細(xì)胞接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，3 d換液1次。待原代細(xì)胞長至90%左右時，細(xì)胞進(jìn)行傳代。吸棄培養(yǎng)基，加入2 mL PBS清洗細(xì)胞2次，用消化液消化細(xì)胞約2 min，細(xì)胞呈細(xì)沙狀從瓶底脫落，以1∶3傳代，每瓶接種于3個培養(yǎng)瓶中，并標(biāo)記第1代和日期。接種后每3天換液1次，在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況，并拍照記錄，當(dāng)細(xì)胞融合至90%左右時如上傳代，余類推。

1.2.3 CCK-8法篩選PDGF-BB的最佳干預(yù)時間和最佳干預(yù)濃度 選取第3代對數(shù)生長期的細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)基，用PBS洗1遍，加入胰酶消化，所得細(xì)胞用完全培養(yǎng)基制成5×104個/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔細(xì)胞懸液5×103個/mL，每組設(shè)5個復(fù)孔，接種完畢移至CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后鏡下觀察，待細(xì)胞長至50%，即可加入PDGF-BB干預(yù)。實(shí)驗(yàn)分為空白組(BLANK組）：加DMEM完全培養(yǎng)基;對照組(CONTROL組)：BMSCs+DMEM完全培養(yǎng)基;其余各組采用PDGF-BB干預(yù)，濃度分別為10、25、50、100ng/mL，用完全培養(yǎng)基配置不同濃度的PDGF-BB，按每孔100 μL加入到96孔板中，于干預(yù)后的24、72、120、168 h各取出一塊板用于CCK-8檢測。取出96孔板，避光下每孔加入10μL CCK-8試劑，于普通恒溫培養(yǎng)箱中避光37℃孵育3 h，用酶標(biāo)儀在450 nm檢測吸光度值，取5個孔平均值。以吸光度值的平均值為縱坐標(biāo)，檢測時間為橫坐標(biāo)，繪制不同濃度PDGF-BB吸光度值趨勢圖，即骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的吸光度值在不同時間隨著PDGF-BB藥物濃度改變的折線圖。

1.2.4 細(xì)胞免疫化學(xué)染色 取第3代兔BMSCs細(xì)胞，按1×105個/mL接種于含有蓋玻片的24孔板內(nèi)，24 h后細(xì)胞貼壁，鏡下觀察待細(xì)胞融合率達(dá)到50%左右，加入上述確定濃度的PDGF-BB誘導(dǎo)，待誘導(dǎo)時間到時，棄培養(yǎng)基，PBS清洗2遍，4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3遍，分別加入一抗Runx-2（1∶400），Ⅰ型膠原（1∶300），骨鈣素(1∶1 000)，4℃冰箱過夜，PBS清洗3遍，5 min/遍，滴加通用型二抗，37℃孵育1 h，PBS清洗3遍，5 min/遍，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復(fù)染30 s，PBS清洗3遍，5 min/遍，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 細(xì)胞免疫熒光染色 取第3代兔BMSCs細(xì)胞，按1×105個/mL接種于共聚焦小皿中，24 h后細(xì)胞貼壁，鏡下觀察待細(xì)胞融合率達(dá)到50%左右，更換為PDGF-BB誘導(dǎo)培養(yǎng)基，待誘導(dǎo)時間到時，棄培養(yǎng)基，PBS清洗2遍，4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3遍，加入骨鈣素(1∶1 000),4℃冰箱過夜，PBS清洗3遍，5 min/遍，滴加FITC-IgG二抗，37℃孵育1 h，PBS清洗3遍，5 min/遍，加入DAPI，室溫5 min，激光共聚焦顯微鏡拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 23．0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用（-x±s）表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，各組數(shù)據(jù)經(jīng)K-S檢驗(yàn)符合正態(tài)分布（P＞0.05）,經(jīng)Leven檢驗(yàn)各組數(shù)據(jù)方差齊。數(shù)據(jù)分析主體效應(yīng)檢驗(yàn)采用重復(fù)測量方差分析，首先進(jìn)行球形檢驗(yàn)，其結(jié)果決定我們是看多變量檢驗(yàn)還是主體內(nèi)效應(yīng)的檢驗(yàn)。如果球形檢驗(yàn)P＞0.05，說明服從球形假設(shè)，各組間數(shù)據(jù)比較采用one-way AVONA檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 兔BMSCs形態(tài)學(xué)變化 細(xì)胞接種第3天，鏡下可見大量漂浮細(xì)胞，緊貼瓶底低倍鏡下即可見到細(xì)胞主要呈雙極生長，有的呈集落生長，細(xì)胞由中心向四周發(fā)散生長，形態(tài)均一，雙極的長梭形，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，并可見正在分化的細(xì)胞核，換液死細(xì)胞可直接換掉，鏡下細(xì)胞更加清晰，如圖1A。到第5天，細(xì)胞生長迅速，集落慢慢匯聚逐漸融合在一起，生長呈魚群樣，呈漩渦轉(zhuǎn)生長。到第7天，已經(jīng)看不到漂浮細(xì)胞，細(xì)胞基本鋪滿瓶底，可進(jìn)行傳代，如圖1B。隨著第1次傳代后細(xì)胞進(jìn)入快速生長期，當(dāng)細(xì)胞融合至90%左右時如上傳代，余類推，基本3 d即可傳代1次。并且隨著傳代的次數(shù)增加，細(xì)胞形態(tài)越來越均一，生長排列整齊，折光性好，低倍鏡下呈魚群樣、旋渦狀生長，如圖1C。

圖1原代培養(yǎng)的兔BMSCs（X50）

2.2 PDGF-BB誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)的改變骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)不同濃度PDGF-BB干預(yù)后24 h，不同濃度對細(xì)胞影響不大，＞25 ng/mL時可見培養(yǎng)瓶中出現(xiàn)部分漂浮的死細(xì)胞，100 ng/mL漂浮細(xì)胞較多。干預(yù)后72 h時，細(xì)胞數(shù)量穩(wěn)步增長，尤其是25 ng/mL時已經(jīng)全部長滿，且很少有死細(xì)胞，低倍鏡下，細(xì)胞仍是集落樣生長，偶見幾個細(xì)胞圍城的小管腔樣結(jié)構(gòu)，可見梭形細(xì)胞伸出細(xì)絲，如圖2A；高倍鏡下可見細(xì)胞之間伸出細(xì)長的絲，類似芽生結(jié)構(gòu)，相互交錯在一起。余下在瓶中散落的細(xì)胞形態(tài)上也發(fā)生很大改變，由原來的梭形生長有的變成了鋪路石樣生長，并且偽足變成了細(xì)長的絲，如圖2B；＜25 ng/mL時的細(xì)胞形態(tài)均為細(xì)胞形態(tài)改變不是特別明顯，細(xì)胞仍是平鋪密集生長。隨著培養(yǎng)時間的延長，每個濃度的細(xì)胞都是越來越密集，＞50 ng/mL時的細(xì)胞仍有不同程度的細(xì)胞死亡,尤其是100 ng/mL時第7天瓶底細(xì)胞仍然沒有長滿，且可見懸浮的死細(xì)胞。

圖2 PDGF-BB誘導(dǎo)72 h的細(xì)胞形態(tài)

2.3 不同濃度PDGF-BB對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響在不同的時間點(diǎn)間PDGF-BB干預(yù)BMSCs的吸光度值改變不同，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=441.351，P＜0.001）。在不同濃度PDGF-BB干預(yù)BMSCs的組間比較吸光度值改變不同，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=70.685，P＜0.001）。25 ng/mL PDGF-BB組與其他5組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.005）；50 ng/mL、25 ng/mL、100 ng/mL PDGF-BB組與其他4組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；對照組與10 ng/mL、50 ng/mL PDGF-BB組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與其他4組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見表1和圖3。25 ng/mL PDGF-BB組在72 h吸光度值明顯高于其他各組，隨后又呈下降趨勢，提示25 ng/mL PDGFBB組干預(yù)BMSCs在72 h對細(xì)胞有增殖作用。細(xì)胞隨著PDGF-BB干預(yù)時間延長，細(xì)胞一直在增殖，但是100 ng/mL對細(xì)胞抑制作用較明顯，會促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

表1不同濃度PDGF-BB對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖影響s，n=5)

表1不同濃度PDGF-BB對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖影響s，n=5)

注：在同一時間點(diǎn)，與對照組比，*P＜0.01；在相同濃度下，與第1天比較，#P＜0.01。

組別對照組10 ng/mL組25 ng/mL組50 ng/mL組100 ng/mL組D1 1.125±0.105 1.047±0.191 0.954±0.083 0.932±0.156 0.675±0.106*#D3 1.877±0.143 2.192±0.343 3.609±0.166*#2.452±0.210 1.323±0.107*#D5 2.588±0.176 2.522±0.116 3.225±0.218*#2.097±0.081 1.814±0.069 D7 2.015±0.241#2.567±0.131#3.013±0.080*#2.523±0.053#1.919±0.220#

圖3不同濃度PDGF-BB干預(yù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的吸光度變化圖

2.4 誘導(dǎo)后細(xì)胞的免疫化學(xué)染色結(jié)果 誘導(dǎo)后的細(xì)胞免疫化學(xué)成骨相關(guān)蛋白染色結(jié)果顯示，3種抗體染色，OCN和Runx-2陽性細(xì)胞胞漿均著棕色，陽性率＞90%,而COL-I可見許多胞漿為棕色的陽性細(xì)胞。見圖4。

2.5 誘導(dǎo)后細(xì)胞的免疫熒光染色結(jié)果 成骨相關(guān)蛋白OCN顯示經(jīng)PDGF-BB誘導(dǎo)72 h的BMSCs都有綠色熒光的表達(dá)，綠色熒光表達(dá)率＞90%,經(jīng)DAPI染色后核著藍(lán)色，說明BMSCs經(jīng)PDGF-BB誘導(dǎo)72 h成骨細(xì)胞陽性率較高。見圖5。

圖4 PDGF-BB誘導(dǎo)后細(xì)胞免疫化學(xué)染色

圖5 PDGF-BB誘導(dǎo)后免疫熒光染色

3 討論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是具有多向分化潛能的干細(xì)胞，目前組織工程骨研究多趨向于使用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞[18-19]。與骨髓中其他種類的細(xì)胞比較，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞含量很少，豐度也不高[20]，但是在骨折、骨缺損時卻需要大量的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為所需要的靶細(xì)胞，并依靠細(xì)胞的歸巢功能[21]，遷移到損傷區(qū)域，進(jìn)行組織修復(fù)。因此在損傷時需要大量的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外條件下進(jìn)行分離純化擴(kuò)增，并在相應(yīng)的誘導(dǎo)因子作用下誘導(dǎo)為靶細(xì)胞就顯得尤為重要[22]。

本研究首先進(jìn)行了新西蘭大白兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)純化，采用全骨髓培養(yǎng)法，其優(yōu)點(diǎn)是可以快速的獲得細(xì)胞，減少分離過程中細(xì)胞的死亡率，同時減少了污染幾率，缺點(diǎn)是細(xì)胞沒有密度梯度離心法的純度高，但是可以通過傳代及流式分選的方法獲得純度較高的種子細(xì)胞。全骨髓培養(yǎng)法細(xì)胞生長很快，本實(shí)驗(yàn)中第7天細(xì)胞已經(jīng)長滿，即可傳代，按1∶3傳代，細(xì)胞只需要3 d就可以長滿，可能原因一方面是兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞體積較大，很快就能鋪滿瓶底；另一方面是選用的兔子為1月齡的動物，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的原始細(xì)胞較多，再生能力較強(qiáng)，增殖分化能力較強(qiáng)。因此2周左右細(xì)胞就進(jìn)入了P3對數(shù)生長期，可用于進(jìn)行藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)。

血小板衍生生長因子(PDGF)最初從血小板中分離出來，是間充質(zhì)干細(xì)胞遷移和增殖的關(guān)鍵生長因子，PDGF-BB在骨折愈合的早期就出現(xiàn)，作用貫穿全程，各階段均能夠有效誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞增生，同時可提高破骨細(xì)胞活性、加速骨吸收，促進(jìn)骨重塑[23]。PDGF-BB促進(jìn)骨細(xì)胞形成的同時也可促進(jìn)骨組織中血管的形成[24]。聯(lián)合應(yīng)用PDGF-BB和BMP-2在不同濃度梯度作用下可以促進(jìn)脂肪干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞[25]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用PDGF-BB誘導(dǎo)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化，采用不同的干預(yù)濃度及干預(yù)時間，以探討最佳干預(yù)時間和濃度。

本實(shí)驗(yàn)選用了最低濃度為10 ng/mL，最高濃度為100 ng/mL。研究表明PDGF-BB在50 ng/mL作用于脂肪干細(xì)胞是抑制膠原蛋白的形成[26]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PDGF-BB＞50 ng/mL,細(xì)胞生長就會受到抑制，尤其是100 ng/mL的細(xì)胞鏡下死亡細(xì)胞較多，在25 ng/mL誘導(dǎo)第1天可見有視野中有漂浮細(xì)胞，第3天可見皿底細(xì)胞已經(jīng)全部長滿，10 ng/mL同樣可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，但是作用沒有25 ng/mL強(qiáng)，最終選擇25 ng/mL誘導(dǎo)BMSCs第三天進(jìn)行下一步細(xì)胞鑒定實(shí)驗(yàn)。

本實(shí)驗(yàn)選擇OCN、Runx-2、COL-I作為細(xì)胞鑒定指標(biāo)。Ⅰ型膠原蛋白（COL-I）是骨細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，在成骨細(xì)胞的增殖分化中起重要作用，也是成骨細(xì)胞重要的特異性基因[25]，是成骨細(xì)胞成熟的重要標(biāo)志[27]。Runx-2又稱核心結(jié)合因子Cbfal，在成骨細(xì)胞分化中被認(rèn)為是重要的特異轉(zhuǎn)錄因子，在成骨分化的早期比較活躍[28-29]。OCN主要表達(dá)于成骨細(xì)胞分化的晚期，其表達(dá)升高說明成骨細(xì)胞開始進(jìn)入礦化期[30-31]。從本研究結(jié)果可以看出，經(jīng)PDGFBB誘導(dǎo)后的BMSCs的細(xì)胞免疫化學(xué)OCN和Runx-2陽性表達(dá)率均較高，COL-I陽性表達(dá)略低于OCN和Runx-2，但也是陽性表達(dá)，說明誘導(dǎo)后的細(xì)胞已經(jīng)形成了成熟的成骨細(xì)胞，同時細(xì)胞免疫熒光OCN為陽性表達(dá)，也證實(shí)了誘導(dǎo)后的細(xì)胞發(fā)育為成熟的成骨細(xì)胞。

綜上所述，本研究驗(yàn)證了兔BMSCs經(jīng)25 ng/mL PDGF-BB誘導(dǎo)第3天時細(xì)胞增殖能力較強(qiáng)，且誘導(dǎo)后的細(xì)胞經(jīng)過鑒定均發(fā)育為成熟的成骨細(xì)胞，為下一步組織工程骨移植實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。