毛宏凱，楊 梅，吳 軍

（新疆醫(yī)科大學(xué)1公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化教研室，烏魯木齊830011）

關(guān)健詞：甲狀腺癌;乳頭狀癌;BRAF;基因突變

甲狀腺癌（thyroid carcinoma,TC）是最一種常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率位于所有腫瘤第七位，在全球范圍內(nèi)增長(zhǎng)較快[1]，在我國(guó)甲狀腺癌是增長(zhǎng)速度最快的惡性腫瘤[2]，2018年全球新增甲狀腺癌死亡4.1萬(wàn)例，占所有癌癥死亡的0.4%，其死亡率位居全球第6位[3]，2005-2014年中國(guó)甲狀腺癌死亡率及疾病負(fù)擔(dān)均在增長(zhǎng)，且以女性為主[4]，對(duì)人群健康構(gòu)成較大威脅。根據(jù)腫瘤起源及分化特點(diǎn)，TC可分為甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）、甲狀腺濾泡癌（follicular thyroid carcinoma，F(xiàn)TC）、甲狀腺髓樣癌（medullary thyroid carcinoma，MTC）以及甲狀腺未分化癌（anaplastic thyroid cancer，ATC），其中PTC最常見，占全部甲狀腺癌的85%～90%，而PTC和FTC合稱分化型甲狀腺癌（differentiated thyroid carcinoma，DTC）[5]。BRAF基因突變是PTC最常見的遺傳學(xué)改變[6]，與PTC發(fā)生及更高的TNM分期呈正相關(guān)[7]。其中單因素分析提示BRAFV600E突變與甲狀腺被膜外侵犯相關(guān)(χ2=5.227,P=0.022)[8]。此外，BRAF基因突變已經(jīng)成為高效的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)分子標(biāo)記物，同時(shí)也是潛在的藥物治療靶點(diǎn)[9]，對(duì)于PTC的早期診斷、預(yù)防控制、臨床治療及預(yù)后評(píng)估具有十分重要的作用[10]。如何開發(fā)出更多的鑒別診斷的標(biāo)志物可能更依賴于對(duì)BRAF基因分子機(jī)制的了解[11]。本研究在相對(duì)大PTC樣本中，分析BRAF基因的突變率、突變特點(diǎn)，同時(shí)分析BRAF基因突變陽(yáng)性患者中顯著上調(diào)基因的表達(dá)特點(diǎn)、PPI及其所參與的生物學(xué)功能和分子過(guò)程等，分析潛在的關(guān)鍵基因，為闡明PTC發(fā)病機(jī)制及其預(yù)防和控制提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 BRAF基因在PTC中的突變頻率及突變位點(diǎn)分析 本研究通過(guò)腫瘤基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）的子數(shù)據(jù)庫(kù)cBioPortal中“快速搜索（quick search）”功能搜索關(guān)鍵詞“BRAF”，選擇BRAF基因在各類癌癥中的變異情況，分析BRAF基因在各類癌癥中的突變頻率，操作方法可見使用說(shuō)明[12]。然后在cBioPortal中選擇“Thyroid”并勾選“Thyroid Carcinoma(TCGA,PanCancer Atlas)500samples”數(shù)據(jù)集，點(diǎn)擊按基因查詢后勾選“mRNA expression z-scores relative to diploid samples(RNA Seq V2 RSEM)”即量化基因表達(dá)指標(biāo)為相對(duì)于二倍體樣品的mRNA表達(dá)z得分，數(shù)據(jù)自動(dòng)篩選為具有突變、拷貝數(shù)畸變(copy number alteration,CNA)和表達(dá)數(shù)據(jù)的完整樣本（480例），最終獲取TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中480例完整樣本的PTC患者生物學(xué)資料及基因測(cè)序結(jié)果，分析PTC中BRAF基因的突變位點(diǎn)。

1.2 在PTC中篩選與BRAF基因突變共發(fā)生或互斥的基因 將患者分為改變組（存在BRAF基因突變，300/480）和非改變組（無(wú)BRAF基因突變，180/480），利用“突變Mutations”功能對(duì)改變和非改變組患者進(jìn)行BRAF基因所有突變位點(diǎn)分析，再利用“互斥Mutual exclusivity”功能對(duì)上一步找出有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的基因兩兩進(jìn)行分析，按照有無(wú)突變構(gòu)建2×2列聯(lián)表，通過(guò)單側(cè)Fisher精確檢驗(yàn)計(jì)算顯著性，Log2OR為量化所選樣本中A存在或不存在與B存在或不存在關(guān)聯(lián)強(qiáng)烈程度指標(biāo)，OR=(Neither*Both)/(ANot B*BNot A)。

1.3 PTC患者中腫瘤惡性表型相關(guān)功能基因表達(dá)情況 選擇“Enter Genes”列表中的不同癌相關(guān)基因集分析了細(xì)胞增殖（growth or proliferation）、侵襲和遷移(invasion and metastasis)、細(xì)胞周期(cell cycle)、生存凋亡(survival/cell death)相關(guān)基因，及在480例生物學(xué)資料完整的PTC患者中的mRNA表達(dá)情況。

1.4 改變組與非改變組患者中顯著變化的基因及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 對(duì)兩組患者組織中表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的基因進(jìn)行篩選，共得到12 699個(gè)基因，兩組中各取變化前50的基因，共計(jì)100個(gè)。隨后，分別把該50個(gè)基因?qū)隨tring中在線分析，將最低互作分值(minimum required interactionscore)設(shè)置成中度可信(medium confidence:0.4)，同時(shí)隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開連接的節(jié)點(diǎn)（hide disconnected nodes in the network）進(jìn)行分析，最終獲得蛋白與蛋白之間相互作用網(wǎng)絡(luò)(Protein-protein interaction,PPI)。

1.5 改變組中異常表達(dá)基因參與的生物學(xué)過(guò)程分析為進(jìn)一步分析改變組中顯著變化的前50個(gè)基因的生物學(xué)功能，在PPI分析基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)互作基因執(zhí)行了GO分析，其中包括生物學(xué)過(guò)程(biological process,BP)和分子功能(molecular function,MF)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 按照PTC患者數(shù)據(jù)信息的特點(diǎn)分別采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)及Fisher精確檢驗(yàn)等方法，以P＜0.01或FDR(false discovery rate)＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Q值=被拒絕但卻是正確的概率=假陽(yáng)性/推測(cè)為陽(yáng)性的個(gè)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 BRAF基因在PTC中的突變頻率及突變位點(diǎn)分析 BRAF基因突變頻率在PTC中最高，以點(diǎn)突變?yōu)橹?，突變率達(dá)60%左右；480例生物學(xué)資料完全的PTC癌患者BRAF基因突變情況（圖1）。480例PTC者中有300例患者存在BRAF基因突變，頻率為62.5%；其中錯(cuò)義突變285例，移碼突變1例，均位于Pkinase_Tyr區(qū)域，突變位點(diǎn)分別為V600E（283/480）、K601E（2/480）及P490_Q494del（1/480），見圖2。

圖1 BRAF基因在各類癌癥中的突變頻率

圖2 BRAF基因在PTC中的突變位點(diǎn)

2.2 在PTC中篩選與BRAF基因突變共發(fā)生或互斥的基因 在非改變組，HRAS和NRAS基因表達(dá)，而改變組無(wú)HRAS和NRAS基因表達(dá)，上述HRAS和NRAS基因的表達(dá)與BRAF基因突變發(fā)生存在互斥性（P＜0.001），同時(shí)HRAS和NRAS基因的表達(dá)存在共現(xiàn)性（P=0.568），但未發(fā)現(xiàn)與BRAF共發(fā)生的基因。HRAS和NRAS基因表達(dá)和HRAS、NRAS和BRAF基因的互斥性及共現(xiàn)性見表1～2、圖3～4。

表1 HRAS和NRAS基因在改變組與非改變組中的表達(dá)情況

表2 HRAS、NRAS和BRAF基因的互斥性及共現(xiàn)性情況

圖3 PTC中改變組與非改變組中基因突變的火山圖

圖4 BRAF與NRAS和HRAS表達(dá)情況

2.3 腫瘤惡性表型相關(guān)基因在PTC患者中的表達(dá)頻率 腫瘤惡性表型相關(guān)基因中影響PTC侵襲和遷移的基因主要是MMP相關(guān)基因，影響其生存凋亡的基因主要是CASP、NFKB、TGFB等基因，影響其細(xì)胞周期的基因主要是E2F、STAT、CDK等基因。

2.4 改變組與非改變組中顯著上調(diào)的基因 改變與非改變組中基因差異表達(dá)水平顯著上調(diào)的前50個(gè)基因（P均＜0.01），結(jié)果見圖5。其中，與非改變組比較，改 變 組 中FN1、SLC34A2、ITGA3、MET、TACSTD2、PPL、ARMCX3、PROS1、RAD23B、CD55等基因表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。與改變組比較，非改變 組 中TPO、C16ORF89、MLEC、FHL1、SORBS2、MT1G、ALDH2、MT1F、FAM167A、ITPR1、NUCB2等基因表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。

2.5 改變組與非改變組中顯著表達(dá)基因的PPI分析進(jìn)一步分析改變組與非改變組中顯著表達(dá)基因間PPI，獲得關(guān)鍵的互作基因，分別將非改變組和改變組中表達(dá)變化的前50個(gè)基因進(jìn)行了PPI分析，這些關(guān)鍵基因的交互作用分析結(jié)果，見圖6，圖中的圈代表基因，圈與圈連線代表基因控制的蛋白間存在相互作用，連線越多表示相互作用關(guān)系越密切。PPI分析結(jié)果顯示，非改變組中前50個(gè)基因調(diào)控的蛋白間相互作用聯(lián)系不緊密表明基因間交互作用較少，而改變組中表達(dá)上調(diào)的前50個(gè)基因中FN1、MET、TGFBR1及ERBB3等調(diào)控的蛋白間聯(lián)系較為緊密，且交互作用較多。

圖6 在非改變組和改變組中上調(diào)基因間的蛋白質(zhì)相互作用

2.6 改變組中顯著表達(dá)基因的生物學(xué)功能推測(cè) GO分析結(jié)果表明，上述基因主要參與血管生成、阿米巴型細(xì)胞遷移、胚胎形成和發(fā)育、多細(xì)胞生物發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控、程序性細(xì)胞死亡、細(xì)胞遷移、細(xì)胞粘附等生物學(xué)過(guò)程；上述基因主要的分子功能與I型轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體活性、跨膜受體蛋白激酶活性、激活素結(jié)合有關(guān)。見表3。

表3在改變組中顯著上調(diào)的互作基因可能參與的BP及MF（部分）

3 討論

本研究中BRAF基因在PTC患者中突變頻率最高，其中又主要是PTC，BRAF基因的突變位點(diǎn)集中在Pkinase_Tyr區(qū)域，又以V600E為主。有研究指出，BRAF基因可以激活ERK信號(hào)通路導(dǎo)致下游轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生磷酸化，進(jìn)而通過(guò)一系列調(diào)控，最終導(dǎo)致PTC的發(fā)生[13]，而BRAF V600E突變可以引起絲氨酸/蘇氨酸激酶激活，經(jīng)過(guò)調(diào)控表達(dá)后促使甲狀腺濾泡細(xì)胞轉(zhuǎn)化成PTC細(xì)胞[14]。本研究中PTC患者中BRAF基因與HRAS、NRAS基因表達(dá)具有互斥性，且HRAS與NRAS基因表達(dá)具有共現(xiàn)性，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這方面的發(fā)現(xiàn)為無(wú)BRAF突變的PTC的診斷提供了新的方向，可以從另一方面提高對(duì)PTC的診斷能力。同時(shí)可以為PTCBRAF基因反饋和負(fù)反饋調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及基因交互作用的深入研究提供線索，如BRAF基因也可能通過(guò)驅(qū)動(dòng)其他基因過(guò)表達(dá)或發(fā)生甲基化參與PTC發(fā)生與發(fā)展[15]。本研究發(fā)現(xiàn)腫瘤惡性表型相關(guān)基因在一定程度上會(huì)影響PTC的發(fā)生發(fā)展，如PTC組織中自噬相關(guān)基因Beclin-1的表達(dá)[16]及CD56基因表達(dá)對(duì)PTC的侵襲性和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有一定意義等[17]。PPI網(wǎng)絡(luò)中改變組比非改變組中基因調(diào)控蛋白間相互作用聯(lián)系更加密切，這可能與是否發(fā)生BRAF基因突變會(huì)引發(fā)不同的基因調(diào)控機(jī)制有關(guān)，改變組中FN1、MET、TGFBR1及ERBB3等為相互作用較強(qiáng)的基因，其中有研究提出的FN1是與散發(fā)MTC的病理生理變化有關(guān)的新型預(yù)后生物標(biāo)志物[18]，MET蛋白能夠作為預(yù)測(cè)PTC中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標(biāo)記[19]，抑制TGFBR1可能對(duì)治療ATC和其他侵襲性腫瘤具有潛力[20]，ERBB3可能參與了PTC的增殖、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā),有望成為PTC治療的新靶點(diǎn)[21]。但這些基因的相互作用關(guān)系還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)論證?；騁O分析中，這些基因可能通過(guò)上述生物學(xué)過(guò)程及分子功能參與PTC的發(fā)生與發(fā)展。本研究中PTC在BRAF基因突變陽(yáng)性情況下，其PPI分析中的關(guān)鍵基因相互作用，以及在無(wú)BRAF基因突變的情況下，HRAS和NRAS的高表達(dá)對(duì)PTC的診斷、治療及預(yù)后評(píng)估中具有重要的意義，為今后多個(gè)特異性分子標(biāo)記物的聯(lián)合應(yīng)用提供了一些線索。本研究從生物信息學(xué)角度對(duì)PTC患者BRAF基因進(jìn)行分析，但缺少相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)學(xué)驗(yàn)證，且該TCGA樣本數(shù)據(jù)并不能很好的控制混雜因素，此為本研究的局限性。

綜上所述，本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)PTC的BRAF基因的突變特點(diǎn),影響PTC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因和交互作用網(wǎng)絡(luò)、生物學(xué)功能等生物學(xué)特征進(jìn)行了探討，為多個(gè)特異性分子標(biāo)記物的聯(lián)合應(yīng)用提供線索,為闡明PTC分子發(fā)病機(jī)制、預(yù)防、診斷和治療的研究提供了理論基礎(chǔ)。