侯祥文，徐詩濤，王德立，梁靖雯，司更花

（1.海南大學 林學院，海口 570228; 2.海南大學 園藝學院，海口 570228;3.中國醫(yī)學科學院 藥用植物研究所 海南分所，海口 570311）

鳥巢蕨(Asplenium nidus)是鐵角蕨科Aspleniaceae 巢蕨屬的一個種，又名山蘇花，是熱帶雨林大型附生植物[1]。原生于亞洲東南部、澳大利亞東部、印度尼西亞、印度和非洲東部等地[2?3]?！吨袊参镏尽酚涊d我國有鳥巢蕨分布于臺灣、福建、香港、廣東、廣西、海南、湖南、四川、貴州、云南和西藏等省份和地區(qū)。鳥巢蕨植物不僅可以豐富森林生物多樣性，還可調節(jié)森林生態(tài)系統(tǒng)的水分與養(yǎng)分循環(huán)，且具有藥用、食用與園林綠化價值。近年來，由于人為活動干擾，野生鳥巢蕨被大量采集，生境縮小且破碎化嚴重，導致其遺傳多樣性降低。加上種間雜交嚴重，導致遺傳背景錯綜復雜，已影響到其品種改良、新品種培育、保護和開發(fā)利用。因此，加強對鳥巢蕨遺傳多樣性與進化研究對鳥巢蕨種質資源保護和利用以及育種和遺傳改良具有重要意義。SRAP(sequence-related amplified polymorphism)是相關序列擴增多態(tài)性的簡稱，利用雙引物設計對基因的ORFS(Open Reading Frames，開放閱讀框)進行區(qū)域擴增是該技術特點，因不同物種內含子、啟動子與間隔區(qū)的長度不同而產(chǎn)生多態(tài)性[4?6]。SRAP 技術具有操作方便、多態(tài)性豐富、重復性好、易于測序、速度快和成本低等特性，被廣泛運用于動物、植物、微生物的品種鑒定、遺傳圖譜構建、遺傳多樣性檢測、基因定位和比較基因組學等研究[7?8]。SRAP 標記通過直接分析遺傳物質多態(tài)性作為不同種群劃分依據(jù)更為可行和客觀，能夠較好地開展遺傳多樣性分析，可避免因季節(jié)性生理生化差異和不同發(fā)育階段而影響指標的準確性[9?10]。因此，可通過分子標記技術分析鳥巢蕨親緣關系，得到更加科學和穩(wěn)定的分析結果。海南島是鳥巢蕨分布中心之一[11?12]，野生種群集中分布于霸王嶺、俄賢嶺、黎母山和五指山等熱帶雨林區(qū)域。不同種群間的鳥巢蕨在葉形、株高、孢子量、巢基大小方面存在一定差異[13?14]。為揭示鳥巢蕨自然種群狀況，促進野生鳥巢蕨資源有效保護和利用，本研究采用SRAP 標記技術，對海南島霸王嶺、俄賢嶺、黎母山和五指山6 個鳥巢蕨自然種群進行遺傳多樣性分析，旨在探明海南島鳥巢蕨種群之間遺傳關系、親緣關系，進而揭示海南島不同地理環(huán)境對鳥巢蕨遺傳多樣性及種群分化的影響，為鳥巢蕨保育和遺傳資源利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料于2011 年5 月?8 月及2019 年3 月?4 月，在海南島霸王嶺、俄賢嶺、黎母山及五指山6 個自然種群進行采樣，每個種群范圍均>2 km2，6 個自然種群相互間地理距離>10 km。每個采集種群內采樣個體間間隔距離>1 m。共采集96 份植株葉片樣本，硅膠干燥后，帶回實驗室，提取DNA。各種群地理位置、生境及采樣個體數(shù)詳見表1。

表1 海南島鳥巢蕨6 個研究種群的地理位置與生境Tab.1 Location, habitat, and sample size of the 6 populations of Asplenium nidus in Hainan Island

1.2 DNA 提取采用北京天根生物有限公司生產(chǎn)的新型植物基因組DNA 提取試劑盒（DP305）提取鳥巢蕨葉片DNA，用w=1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，圖1 為鳥巢蕨種群基因組DNA 電泳圖。提取樣品基因組DNA 用核酸微量測定儀稀釋至一致的質量濃度（50 mg·L?1），置于?20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SRAP 擴增與檢測分析根據(jù)LI 等[15]的方法，設計正向引物17 個，反向引物20 個，由北京三博生物技術有限公司合成。PCR 擴增反應使用TC-512PCR 儀（Techne，Ltd.）。PCR 擴增體系：1U 的TaqDNA 酶，1.5 mmol·L?1的Mg2+，0.20 mmol·L?1的dNTP(Fermentas Biotec.)和25 ng 的DNA，0.5 μmol·L?1的引物。PCR 擴增程序：94 ℃預變性5 min, 94 ℃變性30 sec，52 ℃退火30 sec，72 ℃延伸1 min，共35 個循環(huán)；最后72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存[16]。擴增產(chǎn)物在w=6%變性聚丙烯酰胺凝膠上（65 w 恒定功率）電泳2～2.5 h。電泳完畢后，進行銀染，通過成像儀拍照并保存。

圖1 海南島6 個鳥巢蕨種群基因組 DNA 電泳圖Fig.1 The electrophoretogram of genomic DNA of 6 populations of Asplenium nidus in Hainan Island

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析將SRAP 記錄的電泳圖進行人工讀帶，由圖1 可得，以同一位點有帶記作“1”，無帶記作“0”，僅記錄清晰、穩(wěn)定且長度在300～2 500 bp 的擴增條帶，形成0-1 矩陣二元數(shù)據(jù)輸入電腦。

采用POPGENE32 軟件衡量SRAP 水平上遺傳變異程度，對全部種群和各個種群分別進行遺傳參數(shù)分析，分別對有效等位基因數(shù)(Ne, effective number of allele)、等位基因觀察值(Na，number of allele)、多態(tài)位點百分率(PPB，percentage of polymorphic bands)、Nei’s 基因多樣性(He，Nei’s genetic diversity)、Shannon 信息指數(shù)(Ho，Shannon’s information index)[16?17]、種群總基因多樣度(Ht，total gene diversity)、種群內基因多樣度(Hs，gene diversity within populations)、種群間的基因流(N，geneflow)，種群間遺傳分化系數(shù)(Gst，coefficient of population differentiation)、Nei’s 無偏差遺傳距離(D，Nei’s genetic distance)和遺傳一致度(I，genetic identity)等參數(shù)進行計算[18]。

應用GenAlEx v.6(Genetic Analysis in Excel)軟件[19]對種群內遺傳變異和種群間遺傳變異進行分子變異分析(AMOVA)，計算遺傳變異在種群內和種群間分布。Shannon 信息指數(shù)HO由如下公式計算：

式中，HO為Shannon 信息指數(shù)，Pi為第i條帶的表型頻率。

遺傳分化系數(shù)（coefficient of genetic differentiation，Gst）用來估算種群間的遺傳分化程度，即種群間遺傳多樣性占總遺傳多樣性的比例。

式中，Gst為遺傳分化系數(shù)，Ht為種群的遺傳多樣度，Hs為各種群內的基因多樣度，m為該位點上的等位基因，n為居群總數(shù)，rj為該位點上第j個等位基因在總種群中的平均頻率，qij為第i個種群在該位點上第j個等位基因頻率，mi為第i個種群在該位點上的等位基因數(shù)。

基因流（gene flow）用來估算種群間基因交流程度，為每個世代在種群間遷移的個體數(shù)，是通過遺傳分化系數(shù)來估算的：

式中，Nm為基因流，N為有效種群大??；m為種群每代遷移率；Gst為遺傳分化系數(shù)。

根據(jù) Nei’s 遺傳距離,使用NTSYS-pc 2.1 軟件對種群進行UPGMA 聚類分析，樣本數(shù)為85。

2 結果與分析

2.1 海南島鳥巢蕨自然種群的遺傳多樣性利用17 個正向引物與20 個反向引物共340 對引物組合進行擴增，篩選出10 對條帶清晰、穩(wěn)定性高、特異性好且多態(tài)性豐富的PCR 擴增產(chǎn)物用于鳥巢蕨的遺傳多樣性分析[15]。其中，正向和反向引物序列見表2，10 對引物組合為：ME3-EM3、ME4-EM10、ME5-EM8、ME6-EM16、ME5-EM7、ME10-EM10、ME14-EM6、ME16-EM14、ME16-EM10、ME3-EM4。

引物用于對海南島鳥巢蕨6 個野生種群共96 個個體進行PCR 擴增，由擴增結果（圖2）可看出，一共擴增出184 個清晰穩(wěn)定的條帶，篩選6 條清晰條帶進行分析，其中174 條具有多態(tài)性，多態(tài)位點百分率為94.57%。從圖1 可看出，每個引物擴增出的條帶為5～9 條，平均條帶數(shù)為6.9。條帶分子量在250～2 000 bp之間，而表3 里的各種群間多態(tài)位點百分率存在較大的差異?；赟RAP 分子標記的鳥巢蕨物種水平多態(tài)位點百分比(PPB)為94.57%，SRAP 檢測到的種群多態(tài)位點百分比例(PPB)在76.09%(LMS2 種群)～94.57%(LMS3 種群)之間，平均為85.15%，鳥巢蕨種群間遺傳變異程度較大(76.09%～94.57%)，說明各種群均具有較高的遺傳多樣性水平。

表2 SRAP 分析中使用的正向和反向引物序列Tab.2 Forward and Reverse Primer sequences used in SRAP analysis

圖2 6 個鳥巢蕨鳥巢蕨種群的PCR 擴增Fig.2 PCR amplification of six populations of Asplenium nidus

表3 鳥巢蕨6 個自然種群SRAP 標記遺傳多樣性(平均值±標準差)Tab.3 Genetic diversity (Mean±SE) of 6 natural populations of Asplenium nidus based on SRAP markers

2.2 鳥巢蕨的遺傳分化POPGENE 軟件分析結果表明，種群間和種群內均存在一定遺傳變異，但主要發(fā)生在種群內部。種群總基因多樣度(Ht)為0.346 2±0.018 3，其中，種群內基因多樣度(Hs)為0.301 0±0.014 2，即86.94%的遺傳分化發(fā)生在種群內部；種群間遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.130 6，即種群間遺傳分化為13.06%，說明鳥巢蕨種群間遺傳分化水平較高，且遺傳變異主要發(fā)生在種群內部。種群間基因流Nm=1.664 2，表明鳥巢蕨之間基因流動暢通。

AMOVA 分析表明，遺傳變異以居群內變異為主，此分析結果與POPGENE 的分析結果基本一致，由表4 可看出，顯著的遺傳分化(P= 0.010)于種群內部和種群間均存在，遺傳變異在種群間占總遺傳變異的10.62%，在種群內占89.53%。

2.3 鳥巢蕨種群間的遺傳距離與相似系數(shù)從表5可知，鳥巢蕨6 個種群的平均遺傳相似度為0.922 4，平均遺傳距離為0.080 9。其中，BW 和EXL 的遺傳距離最近，為0.050 8，LMS2 和LMS3 遺傳距離最遠，為 0.116 6。

表4 鳥巢蕨自然種群遺傳變異的AMOVA 分析Tab.4 Analysis of molecular variance (AMOVA) of natural populations of Asplenium nidus

表5 基于SRAP 6 個鳥巢蕨種群間的遺傳相似度和遺傳距離Tab.5 Genetic similarity and genetic distance among the 6 populations of Asplenium nidus based on SRAP

SRAP 標記對6 個種群鳥巢蕨野外種群遺傳距離的UPGMA 聚類分析結果表明，海南島6 個鳥巢蕨種群可分為三大類：由圖3 可得，地理位置較近的BW 和EXL 為第I 類；同一地區(qū)的LMS1 和LMS3聚類在了一起為第II 類；而LMS2 與其余種群為第Ⅲ類，其遺傳距離最大，遺傳分化也最顯著。

圖3 海南島鳥巢蕨6 個種群Nei’s 遺傳距離UPGMA 聚類圖Fig.3 Dendrogram of the six natural populations of Asplenium nidus in Hainan Island based on Nei ’s makers using UPGMA cluster analysis

3 討 論

3.1 鳥巢蕨自然種群遺傳多樣性遺傳多樣性是生物多樣性重要組成部分，是生態(tài)系統(tǒng)多樣性和物種多樣性的基礎[16?17]，也是分析物種進化潛力和未來命運重要方向[18]。遺傳多樣性大小是物種長期進化的產(chǎn)物，是其生存適應和發(fā)展進化的前提[20]。遺傳多樣性越高的物種對環(huán)境變化適應能力就越強，越容易在其分布范圍內擴展和開拓新生境[20?21]。

本研究結果表明，海南島野生鳥巢蕨種群具有較高遺傳多樣性，多態(tài)位點百分比(PPB)在76.09%(LMS2 種群)～94.57%(LMS3 種群)之間，平均為85.15%。該結果與潘麗芹等[22]的荷葉鐵線蕨自然居群的遺傳多樣性研究和董元火等[23]的水蕨的生境及其遺傳多樣性分析結果相似，但與黃慶陽等[24]對香鱗毛蕨種質資源遺傳多樣性的AFLP 分析研究結果存在一定差異。原因可能是研究材料地理分布差異較大，或使用的分子標記技術不同所導致。本研究中，野生鳥巢蕨種群間生境差異不大，但隨著海拔增加，氣候、土壤、植被等也隨之發(fā)生了明顯變化，因而造成6 個種群較高遺傳多樣性。其中，LMS3 地區(qū)遺傳多樣性最高（Ne、He、Ho分別為1.533 2、0.322 5、0.488 1），可能黎母山（LMS）作為海南三大江河（南渡江、萬泉河、昌化江）的發(fā)源地，石灰?guī)r溝谷較多，符合鳥巢蕨對生境要求。加上黎母山林區(qū)屬熱帶季風氣候，季風帶來長期潮濕更有利于鳥巢蕨孢子傳播和更新，而霸王嶺樣地鳥巢蕨種群遺傳多樣性最?。∟e、He、Ho分別為1.479 9、0.282 2、0.422 7）；有兩個方面的原因：一是所采集個體的海拔分布較低，受人為干擾較重；另一原因可能是鳥巢蕨分布地受季風影響較小，不利于孢子傳播和附著。本研究結果表明，在海南島6 個鳥巢蕨種群中LMS3 鳥巢蕨種群內部遺傳變異最多，而BWL 鳥巢蕨種群內部遺傳變異則相對較少。

3.2 種群的遺傳變異和遺傳結構遺傳結構指種群中遺傳變異分布的時空格局，其在基因流、基因突變和自然選擇的共同作用下形成，也與物種進化史和生物學特性有關[25?26]。

鳥巢蕨雖然在種群和物種水平均具有較高的遺傳多樣性，但相比較而言，種群水平遺傳多樣性要低于物種水平，與種群間具有較高基因流（Nm=1.664 2，Nm>1）有關，使漂變成為劃分種群遺傳結構主導因素，表明鳥巢蕨距離較遠種群間也存在一定程度基因交流[27?28]。遺傳分化程度Gst為0.130 6，在0.05～0.15 之間，屬于中等程度遺傳分化。

基于SRAP 標記得出6 個鳥巢蕨野生種群多態(tài)位點百分率、Shannon 信息指數(shù)(Ho)、Nei’s 基因多樣性(He)、種群內遺傳多樣性指數(shù)和總遺傳多樣性指數(shù)，通過AMOVA 分析結果顯示總的種群間變異為11%，說明鳥巢蕨種群內存在豐富的遺傳變異，6 個鳥巢蕨野生分布種群間均有較高遺傳變異，黎母山種群與其他5 個種群遺傳變異最明顯。蔣速飛等[29]發(fā)現(xiàn)，豐富的遺傳變異可能是物種具有較高遺傳多樣性的原因之一 。由于鳥巢蕨是孢子繁殖，孢子不易于長距離遷徙，易造成地理隔離，推測地理隔離可能是造成鳥巢蕨種群間遺傳分化較大原因，而較高遺傳變異可能是本研究中各鳥巢蕨種群間遺傳多樣性較高的原因之一[30]。

3.3 鳥巢蕨自然種群保護物種遺傳多樣性水平能反映其適應能力和進化潛力，還有助于物種稀有或瀕危原因及過程的探討[31]。對珍稀瀕危物種保護方針和措施的制定，如采樣策略遷地或就地保護選樣等都有賴于人們對物種遺傳多樣性認識[32?33]。鳥巢蕨靠孢子繁殖，而孢子適宜在潮濕的環(huán)境生長，海南島氣候十分適宜鳥巢蕨繁殖生長，本研究也證實海南島鳥巢蕨具較高遺傳多樣性，說明在本研究所選區(qū)域現(xiàn)階段人為活動對鳥巢蕨的數(shù)量和遺傳多樣性影響較小，各區(qū)域還有一定數(shù)量鳥巢蕨種群分布。

值得注意的是，一旦生境遭到破壞會直接導致孢子不能傳播和存活，鳥巢蕨原生基因就會喪失，其遺傳多樣性也會隨之降低。建議鳥巢蕨保護應以就地保護為主，可選擇鳥巢蕨種群遺傳多樣性較高的黎母山保護區(qū)區(qū)域（如本研究的黎母山LMS3 區(qū)域）建立級別更高的自然保護區(qū)，加大保護和自然恢復力度，擴大保護邊界。針對鳥巢蕨孢子不易于長距離遷徙導致不同種群之間遺傳分化較大這一現(xiàn)象，可對不同自然群體中鳥巢蕨個體遷地保護，結合采用重引入技術進行自然居群恢復，提高種群競爭力和多樣性，擴大群體間基因交流，最大限度保障鳥巢蕨遺傳多樣性，促進熱帶雨林國家公園建成。