曹 菁，王淑敏，宋鳳瑞，皮子鳳

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)春 130117；2.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所，長(zhǎng)春 130022；3.中藥化學(xué)與質(zhì)譜吉林省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130022）

滿山紅來源于杜鵑花科杜鵑屬植物興安杜鵑（Rhododendron dauricum L.）的葉。滿山紅在治療咳喘方面效果突出[1]，常用來治療慢性氣管炎，慢性支氣管炎等[2]。滿山紅以黃酮類、香豆素類、有機(jī)酸類、揮發(fā)油類等化學(xué)成分為主，其中藥效作用突出的是黃酮類[3]，包括杜鵑素、山奈酚、金絲桃苷等。中藥材含有的化學(xué)成分復(fù)雜，影響其化學(xué)成分種類和含量的因素也很多，因此需要規(guī)范中藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。中藥指紋圖譜可以使得到的有用化學(xué)信息最大化，起到把控中藥產(chǎn)品的質(zhì)量的作用[4]。因此建立中藥指紋圖譜意義重大，也為后續(xù)中藥材研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器

美國(guó)Agilent 公司的1260 型高效液相色譜儀；美國(guó)THERMO 公司的G10S UⅤ-Ⅴis 型紫外分光光度計(jì)；昆山市超聲儀器有限公司的KQ-250DE 型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器；德國(guó)賽多利斯公司的BP211D型天平(d = 0.01 mg)；天津市泰斯特儀器有限公司的98-1-B 型電子控溫電熱套。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 試劑 實(shí)驗(yàn)中高效液相色譜儀使用的是美國(guó)Fishers 公司生產(chǎn)的色譜級(jí)甲醇、乙腈和甲酸，水為超純水；除此之外實(shí)驗(yàn)用到的試劑為分析純。

1.2.2 試藥 杜鵑素（批號(hào)：201605）為中國(guó)藥品生物制品檢定所生產(chǎn)。

1.2.3 飲片來源 滿山紅藥材購(gòu)于黑龍江五林、黑龍江林口、吉林通化，每個(gè)產(chǎn)地5 批藥材，分別是五林01 ～05、林口01 ～05、通化01 ～05，共15批，編號(hào)分別是S1 ～S15。由中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所質(zhì)譜中心皮子鳳副研究員鑒定為興安杜鵑Rhododendron dauricum L.葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

將杜鵑素對(duì)照品精密稱量，取適量甲醇制成每1 mL 含0.1 mg 的溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備

選用滿山紅葉100 g，采用回流法提取2 回，第1 回加入12 倍水，放置30 min，回流提取30 min，過200 目濾布，濾液備用；藥渣第2 回加入10 倍水，提取20 min，過200 目濾布，合并2 次濾液，減壓濃縮至500 mL，凍干，取凍干粉0.1 g，加入20 mL 水超聲提?。üβ?00W，頻率40 KHz）60 min，放至室溫，搖勻，過0.45 μm的微孔濾膜，即得。

2.3 色譜條件的確定

2.3.1 色譜條件 采用Shim-Pack XR-ODS Ⅲ（2.0 mmi.d×150 mm）色譜柱，用甲醇-0.3%甲酸水溶液為流動(dòng)相系統(tǒng)梯度洗脫，流速為0.2 mL·min-1，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為297 nm，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。梯度見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.3.2 空白溶劑干擾考察 將甲醇作為空白溶劑，按照“2.3.1”項(xiàng)色譜條件，開始檢測(cè)。滿山紅葉的指紋圖譜不受空白溶劑影響。見圖1。

圖1 空白溶劑色譜圖

2.3.3 對(duì)照品和供試品峰比對(duì) 將“2.1”項(xiàng)的對(duì)照品溶液和“2.2”項(xiàng)的供試品溶液，按照“2.3.1”項(xiàng)的色譜條件，用高效液相色譜儀檢測(cè)。結(jié)果顯示所選藥材中含有杜鵑素。對(duì)照品色譜圖見圖2，供試品色譜圖見圖3。

圖2 對(duì)照品色譜圖

圖3 供試品色譜圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 取“2.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，加適量甲醇制成每1 mL 含100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg 的對(duì)照品溶液，照“2.3.1”項(xiàng)的實(shí)驗(yàn)條件，用高效液相色譜儀檢測(cè)，峰面積為X 軸，以含量為Y軸，得到杜鵑素的回歸方程為Y=2E+0.9X-492 161，r = 0.999 5，線性范圍3.125 ～100 μg，表明線性良好。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 選用適量的“2.2”項(xiàng)供試品溶液，根據(jù)“2.3.1”項(xiàng)的實(shí)驗(yàn)條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，10 個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD ＜1%，相對(duì)峰面積的RSD ＜3%，供實(shí)驗(yàn)用儀器具有良好的精密度，結(jié)果見表2，表3。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 選用適量的“2.2”項(xiàng)供試品溶液，根據(jù)“2.3.1”項(xiàng)確定的色譜條件，在0、2、5、8、14、18、24 h 依次測(cè)定，10 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD ＜2%，相對(duì)峰面積RSD ＜3%，證明該溶液24 h 內(nèi)化學(xué)成分穩(wěn)定，結(jié)果見表4，表5。2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 根據(jù)“2.2”項(xiàng)確定的供試品制作方式制作6 份，分別根據(jù)“2.3.1”項(xiàng)確定的色譜條件檢測(cè)，分析說明10 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD ＜1%，相對(duì)峰面積的RSD ＜3%，具備良好的重復(fù)性，結(jié)果見表6，表7。

2.5 滿山紅葉中杜鵑素含量測(cè)定

用“2.2”下方法，制備15 批滿山紅葉的供試品溶液；取“2.1”下對(duì)照品適量，用適量甲醇稀釋成每1 mL 含0.05 mg 的對(duì)照品溶液，按照“2.3.1”項(xiàng)的色譜條件，分別用高效液相色譜儀檢測(cè)，結(jié)果見表8。

表2 滿山紅葉精密度試驗(yàn)的相對(duì)保留時(shí)間結(jié)果

表3 滿山紅葉精密度試驗(yàn)的相對(duì)峰面積結(jié)果

表4 滿山紅葉穩(wěn)定性試驗(yàn)的相對(duì)保留時(shí)間結(jié)果

表5 滿山紅葉穩(wěn)定性試驗(yàn)的相對(duì)峰面積結(jié)果

表6 滿山紅葉重復(fù)性試驗(yàn)的相對(duì)保留時(shí)間結(jié)果

表7 滿山紅葉重復(fù)性試驗(yàn)的相對(duì)峰面積結(jié)果

2.6 指紋圖譜建立及分析

2.6.1 指紋圖譜的建立 取“2.1”項(xiàng)的對(duì)照品溶液和“2.2”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)的色譜條件，使用高效液相色譜儀檢測(cè)。所得滿山紅葉HPLC 對(duì)照?qǐng)D譜見圖4，15 批滿山紅葉色譜疊加圖見圖5。

圖4 所示，該指紋圖譜找到10 個(gè)共有峰，通過與對(duì)照品色譜圖對(duì)比，確認(rèn)10 號(hào)峰為杜鵑素，并將9 號(hào)峰作為參照S 峰。

2.6.2 相似度分析 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件”（2012 版），采用中位數(shù)法依次進(jìn)行15 批滿山紅葉指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果見表9。根據(jù)表9 能夠得出，15 批滿山紅葉紋圖譜整體相似度在0.986 ～0.999，均＞0.9，具有較高的一致性。

圖4 滿山紅葉與對(duì)照品溶液指紋圖譜對(duì)比圖

圖5 15 批滿山葉HPLC 圖譜

表8 滿山紅葉中杜鵑素含量測(cè)定結(jié)果

表9 15 批滿山紅葉指紋圖譜的相似度結(jié)果

2.6.3 聚類分析 將15 批滿山紅葉的10 個(gè)共有峰峰面積導(dǎo)入SPSS 20.0，運(yùn)用平均歐式距離法，進(jìn)行聚類分析，見圖6。分類結(jié)果表明不同產(chǎn)地滿山紅藥材在分類距離上較遠(yuǎn)，即使同一產(chǎn)地其分類距離也存在明顯差異性。初步分析，可能與滿山紅藥材采摘時(shí)間、貯存方式、氣候等有關(guān)。15 批滿山紅葉在產(chǎn)地和批次上其主化學(xué)成分種類具有代表性，指紋圖譜能夠反映出樣品的全貌。

圖6 滿山紅葉聚類分析圖

3 討論

本實(shí)驗(yàn)供試品的制作方法，考察了不同提取溶劑和提取方式對(duì)滿山紅葉指紋圖譜的影響。在提取溶劑方面，選取了水、60%甲醇、稀乙醇三種溶劑作為提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，滿山紅凍干粉在三種溶劑中的溶解度都很好，但是以水作提取溶劑的色譜圖無論在出峰數(shù)目還是分離度上均優(yōu)于其他兩種溶劑的色譜圖，因此選擇水作為提取溶劑。在提取方式方面，選擇了超聲提取法和回流提取法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2 種方法提取的滿山紅葉色譜圖差別很小，但是超聲提取方法更加簡(jiǎn)便，因此選擇超聲的方法作為提取方法。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)于色譜條件的確定，考察了色譜柱、檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相系統(tǒng)，流速、柱溫對(duì)滿山紅葉指紋圖譜的影響。在色譜柱方面，選了Shim-Pack XR-ODSⅢ（2.0 mmi.d×150 mm）、Agilent Zorbax SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）和YMC-Pack ODS-A（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，結(jié)果表明樣品 在Agilent Zorbax SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm） 和YMC-Pack ODS-A（4.6 mm×250 mm，5 μm）中不能達(dá)到分離要求，而在Shim-Pack XRODSⅢ（2.0 mmi.d×150 mm）色譜柱中不僅出峰快、數(shù)目多而且分離度符合要求，所以選擇Shim-Pack XR-ODSⅢ（2.0 mmi.d×150 mm）色譜柱作為該實(shí)驗(yàn)色譜柱。在檢測(cè)波長(zhǎng)方面，用二極管陣列檢測(cè)器檢（DAD）中200 ～400 nm 依次掃描對(duì)照品溶液和供試品溶液，結(jié)果顯示在檢測(cè)波長(zhǎng)297 nm 處2個(gè)樣品均有最大吸收，色譜圖信息豐富，杜鵑素峰高較高，所以選用297 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。在流動(dòng)相系統(tǒng)方面，選取不同種類有機(jī)相（甲醇、乙腈）和不同成分水相（0.3%甲酸水溶液、0.3%醋酸水溶液）構(gòu)成的流動(dòng)相系統(tǒng)對(duì)供試品溶液色譜峰分離的影響，篩選乙腈-0.3%甲酸水溶液、甲醇-0.3%甲酸水溶液、甲醇-0.3% 醋酸水溶液等流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果顯示，乙腈-0.3% 甲酸水溶液流動(dòng)相系統(tǒng)不利于樣品的分離，出峰數(shù)目稀少且分離度不好，甲醇-0.3% 甲酸水溶液和甲醇-0.3%醋酸水溶液流動(dòng)相系統(tǒng)對(duì)樣品分離差別不明顯，但是甲醇-0.3%甲酸水溶液流動(dòng)相系統(tǒng)色譜圖信息更豐富，分離度更好，故確定該流動(dòng)相系統(tǒng)作為該實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的流動(dòng)相。在流速方面，選擇了0.1 mL·min-1、0.2 mL·min-1、0.25 mL·min-1進(jìn)行篩選。結(jié)果表明，用0.1 mL·min-1流速檢測(cè)色譜峰出峰不完全，用0.25 mL·min-1流速檢測(cè)色譜峰分離度不好，用0.2 mL·min-1流速檢測(cè)色譜峰出峰數(shù)目完全，分離度較好，故確定流速為0.2 mL·min-1。在柱溫方面，對(duì)25 ℃、30 ℃、35 ℃柱溫進(jìn)行篩選。結(jié)果表明升高柱溫，分離效果變差，因此確定了25 ℃作為檢測(cè)柱溫。

15 批滿山紅葉的指紋圖譜整體相似度范圍0.986 ～ 0.999，均＞0.9，相似度良好，15 批滿山紅葉中杜鵑素含量RSD 為0.11%，表明其含量沒有明顯差異，但是聚類分析結(jié)果將15 批滿山紅葉分為四類，且10 個(gè)共有峰峰面積的RSD 范圍6%～30%，說明杜鵑素的含量對(duì)其整體含量變化影響很小，其他化學(xué)成分含量變化起主要作用，初步分析應(yīng)該與滿山紅中草藥產(chǎn)地、生長(zhǎng)環(huán)境、采摘時(shí)間、放置條件和放置時(shí)間等有關(guān)。

本研究運(yùn)用高相液相色譜分析法，建立了滿山紅葉的指紋圖譜，該指紋圖譜可以全面展現(xiàn)滿山紅葉化學(xué)成分的特點(diǎn)，適用于因產(chǎn)地、批次、生長(zhǎng)環(huán)境等因素的不同，出現(xiàn)的質(zhì)量不均一的滿山紅葉。該方法簡(jiǎn)便易行，指紋峰分離度好，具有較高的可信度，為后續(xù)滿山紅葉的研究開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。