王瑩 王華 賈紀(jì)萍 丁寧

摘要 重金屬超標(biāo)是食品安全的重要問(wèn)題之一，因此，需通過(guò)嚴(yán)格的監(jiān)測(cè)，確保食品中的重金屬含量在限量范圍之內(nèi)。傳統(tǒng)的重金屬檢測(cè)方法靈敏度高、重復(fù)性好，但操作較為復(fù)雜，檢測(cè)費(fèi)用高，不適用于大量樣本的快速篩選。近年來(lái)，隨著酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，酶聯(lián)免疫（ELISA）法已廣泛應(yīng)用于食品中重金屬的檢測(cè)。從樣品前處理、重金屬人工抗原及特異性抗體的制備、ELISA法的選擇三個(gè)方面介紹了該法在重金屬檢測(cè)方面的最新研究成果，并對(duì)ELISA法的發(fā)展進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞 酶聯(lián)免疫;重金屬;抗原;抗體

中圖分類號(hào) TS207.5+1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2021）05-0010-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.05.003

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Research Progress in Rapid Detection of Heavy Metals in Food by Enzyme-linked Immunosorbent Assay

WANG Ying1，WANG Hua2，JIA Ji-ping1 et al

（1.Department of Pharmacy， Jiangsu Animal Husbandry and Veterinary Science College， Taizhou， Jiangsu 225300; 2. School of Pharmaceutical Sciences， Taizhou Institute of Sci.&Tech.， NJUST.， Taizhou， Jiangsu 225300）

Abstract Excessive heavy metal is one of the important problems of food safety. Therefore， strict monitoring is needed to ensure that the content of heavy metals in food is within the limit. The traditional heavy metal detection method has high sensitivity and repeatability， but its operation is complex and the detection cost is high， so it is not suitable for rapid screening of a large number of samples. In recent years， with the rapid development of enzyme-linked immunosorbent assay， enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） has been widely used in the detection of heavy metals in food. We mainly introduced the latest research results in heavy metal detection from three aspects： sample pretreatment， preparation of heavy metal artificial antigen and specific antibody， and selection of ELISA， and prospected the development of ELISA.

Key words Enzyme-linked immunosorbent assay;Heavy metal;Antigen;Antibody

近年來(lái)，隨著我國(guó)工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的迅猛發(fā)展，環(huán)境污染較嚴(yán)重，重金屬超標(biāo)已成為食品質(zhì)量安全的主要因素，重金屬經(jīng)食物鏈逐步沉積，最后進(jìn)入人體，并在人體內(nèi)與蛋白質(zhì)和酶發(fā)生作用，使它們失去活性，從而產(chǎn)生致癌致畸等毒性作用，甚至危害生命[1-3]。目前，我國(guó)食品重金屬超標(biāo)問(wèn)題時(shí)常發(fā)生，2015年山東省青島市食品藥品監(jiān)督管理局對(duì)十類食品進(jìn)行抽檢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)早餐和燒烤食品中存在鉛超標(biāo)，貝類產(chǎn)品和辣椒中存在鎘超標(biāo)。因此，對(duì)重金屬含量進(jìn)行測(cè)定顯得尤為重要。目前，重金屬檢測(cè)方法主要有原子熒光光譜法（AFS）、原子吸收光譜法（AAS）、電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）、高效液相色譜法（HPLC）等[4-9]。這些技術(shù)靈敏度高、重復(fù)性好，但操作較復(fù)雜，檢測(cè)費(fèi)用高，不適用于大批量樣本的快速篩選。隨著酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，酶聯(lián)免疫（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法已廣泛應(yīng)用于食品中鎘、汞、鉛等多種重金屬檢測(cè)[10-12]，該法是一種將抗體與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物與固相載體上的抗原反應(yīng)后，加上酶的相應(yīng)底物，根據(jù)反應(yīng)的顏色對(duì)重金屬進(jìn)行定性或定量分析的方法，ELISA法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，檢測(cè)時(shí)間短，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。該研究從樣品前處理、重金屬人工抗原及特異性抗體的制備、ELISA法的選擇三個(gè)方面介紹了該法在重金屬檢測(cè)方面的最新研究成果，并對(duì)ELISA法的發(fā)展進(jìn)行了展望。

1 樣品前處理

ELISA法可用于快速檢測(cè)重金屬離子，該方法對(duì)試樣有一定的要求，只能在液態(tài)環(huán)境中進(jìn)行。故要實(shí)現(xiàn)食品中重金屬的ELISA檢測(cè)，需通過(guò)前處理使食品中的重金屬離子釋放到液相環(huán)境中，同時(shí)還需除去干擾離子的影響，故選擇合適的樣品前處理方法至關(guān)重要。目前，ELISA法快速檢測(cè)食品中重金屬含量的前處理方法主要有微波消解法、稀酸浸提法、濕法消化法等[13-15]。

1.1 微波消解法

微波消解法是指利用微波加熱消解罐中的樣品和消解試劑（如HNO 3和H 2O 2），在高溫條件下，使樣品快速消解，釋放出離子。該方法在快速消解樣品有機(jī)物的同時(shí)，避免了待測(cè)元素的損失，且酸用量較少，環(huán)境污染小。李霞雪等[13]考察了硝酸、硝酸+過(guò)氧化氫、硝酸+鹽酸這3種消解液對(duì)蔬菜樣品中重金屬離子的消解效果，發(fā)現(xiàn)硝酸、硝酸-過(guò)氧化氫消解液對(duì)樣品有較好的消解效果，硝酸-鹽酸體系不能將蔬菜樣品中的有機(jī)物質(zhì)全部消解，但過(guò)氧化氫的加入使反應(yīng)過(guò)于劇烈，易造成樣品損失，故選用硝酸作為消解液，同時(shí)研究了消解液用量、消解溫度、消解時(shí)間等因素對(duì)消解結(jié)果的影響，通過(guò)正交試驗(yàn)確定了最佳消解條件。開建榮等[14]比較了微波消解法和濕法消解法在處理大米粉樣品中重金屬的優(yōu)劣，結(jié)果發(fā)現(xiàn)微波消解和濕法消解均符合分析要求，但從準(zhǔn)確度、精密度、試劑消耗等方面來(lái)看，微波消解優(yōu)于濕法消解。微波消解法根據(jù)所測(cè)基質(zhì)的不同，采用不同的消解程序，具體見表1。

1.2 稀酸浸提法

稀酸浸提法通常采用稀鹽酸、稀硫酸和稀硝酸作為浸提劑，該法簡(jiǎn)單易行，可作為樣品前處理的輔助手段，應(yīng)用于樣品的初篩。汪慧等[17-18]采用稀酸浸提法分別浸提水產(chǎn)（近江牡蠣、翡翠貽貝和基圍蝦）和禽畜肉產(chǎn)品（雞肉、鴨肉、豬肉和牛肉）中的重金屬Cu、Pb和Cd，發(fā)現(xiàn)稀硝酸的浸提效果最好，稀鹽酸的浸提效果最差，之后采用ELISA檢測(cè)稀酸浸提液中的重金屬離子，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果線性相關(guān)良好，說(shuō)明稀酸浸提法滿足ELISA檢測(cè)水產(chǎn)品和禽畜肉中重金屬前處理要求。周明慧等[19]采用稀硝酸提取大米中的Cd，并對(duì)提取方法進(jìn)行了優(yōu)化，與微波消解法相比，該法可在常溫下提取，提取時(shí)間縮短，簡(jiǎn)化了前處理步驟，大米中Cd元素的檢測(cè)效率和分析準(zhǔn)確度高，降低成本。

1.3 濕法消化法

濕法消化法是指通過(guò)加入硫酸、硝酸、高氯酸等氧化劑，加熱消煮，使樣品中的金屬離子釋放出來(lái)。Sasaki等[20]通過(guò)加入濃硝酸將植物、土壤、肥料等物質(zhì)中的重金屬離子釋放出來(lái)，通過(guò)C 18硅膠螯合物柱純化后進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)。楊亞君等[21]采用濕法消解法測(cè)定香菇中鎘的含量，在香菇樣品中加入硝酸和高氯酸，加熱消解至一定程度趕酸，最后用水定容即可，相比于國(guó)標(biāo)法，濕法消解法處理樣品操作簡(jiǎn)易，耗時(shí)短，回收率高。高加龍等[22]采用濕法消化法測(cè)定貝肉中鎘的含量，在貝肉樣品中加入硝酸和硫酸，低溫消解，再加入過(guò)氧化氫繼續(xù)消化，趕酸，該法處理貝肉樣品，鎘加標(biāo)回收率較高，檢出限低，線性關(guān)系好，精密度和準(zhǔn)確度均滿足貝類樣品的測(cè)定。

以上總結(jié)了ELISA法快速檢測(cè)食品中的前處理方法，其優(yōu)缺點(diǎn)如表2所示。

2 重金屬人工抗原及特異性抗體的制備

2.1 人工抗原的合成

重金屬分子量小，無(wú)免疫原性，不足以引起免疫動(dòng)物產(chǎn)生特異性抗體，且金屬離子帶有電荷，能與生物分子發(fā)生強(qiáng)烈的不可逆反應(yīng)而導(dǎo)致動(dòng)物中毒，故選用與目標(biāo)金屬離子具有高度親和性的雙功能螯合物制備重金屬螯合物，再與合適的載體蛋白偶聯(lián)，制備成重金屬-螯合物-載體蛋白的復(fù)合物作為免疫原[23]。郭建軍等[24]以2-S-（4-氨基苯）-1，4，7 三氮雜環(huán)壬烷-1，4，7-三乙酸（NOTA）作為雙功能螯合劑，采用戊二醛法將Cu2+分別與載體蛋白牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）偶聯(lián)制備免疫原和包被原，具體銅人工抗原合成路線如圖1所示。

徐譽(yù)等[25]以ITCBE為螯合劑，將砷與載體蛋白BSA和OVA偶聯(lián)，制備人工免疫抗原As3+-ITCBE-BSA和人工鑒定抗原As3+-ITCBE-OVA，通過(guò)鑒定，證實(shí)抗原合成成功。

目前，常采用的雙功能螯合劑主要有谷胱甘肽（GSH）、二乙基三胺五乙酸（DTPA）、異硫氰酸芐基乙二胺四乙酸（ITCBE）、2-S-（4-氨基苯）-1，4，7 三氮雜環(huán)壬烷-1，4，7-三乙酸（NOTA）等。常見的載體蛋白有鑰孔血藍(lán)蛋白（KLH）、牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）等，常見的評(píng)定方法有紫外分光光度法（UV）、SDS-PAGE電泳、原子熒光光譜法（AFS）等，常見金屬離子人工抗原的合成方法見表3。

2.2 特異性抗體的制備

ELISA法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)便快速等優(yōu)點(diǎn)，建立ELISA法需要的核心試劑是高效價(jià)和高特異性的抗體，抗體可分為多克隆抗體、單克隆抗體。Reardan等[29]在1985年首次采用螯合劑將In3+和BSA偶聯(lián)制備完全抗原，并成功制備In3+特異性抗體，為重金屬的免疫檢測(cè)提供了參考。孫勇等[30]采用已合成的Cu2+人工抗原Cu2+-ITCBE-BSA免疫Balb/C小鼠，通過(guò)間接ELISA和阻斷ELISA篩選備用小鼠，用細(xì)胞融合技術(shù)制備抗Cu2+的單克隆抗體，該抗體除了與Zn2+-EDTA的交叉反應(yīng)率為26.0%，與其他金屬螯合物沒(méi)有交叉反應(yīng)，證實(shí)抗體具有不錯(cuò)的特異性。王亞楠等[31]用Cr3+-ITCBE-BSA免疫Balb/C小鼠，制備了抗Cr3+單克隆抗體（Cr3+mAb），效價(jià)為1∶（5.12×105），親和常數(shù)2.69×109 L/mol，且與其他金屬離子無(wú)交叉反應(yīng)，表明Cr3+mAb親和力高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，為Cr3+殘留免疫學(xué)檢測(cè)法的建立奠定了基礎(chǔ)。翟一凡等[32]采用合成的完全抗原（Pb-DTPA-OVA）免疫小鼠，制備多克隆抗體，抗血清效價(jià)高達(dá)1∶400 000，與Fe3+有近5%的交叉反應(yīng)，與其他金屬離子的交叉反應(yīng)率均小于1%，表明鉛離子多克隆抗體制備成功，且特異性強(qiáng)。翟璐等[27]成功制備了免疫抗原（Pb-NOTA-BSA）與包被抗原（Pb-NOTA-OVA），以免疫原免疫兔子制備了高效價(jià)的多克隆抗體，并建立了間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，其IC 50和IC 20分別為157.89、13.30 ng/mL，說(shuō)明制備的多抗具有較高的檢測(cè)靈敏度，交叉反應(yīng)試驗(yàn)顯示：該抗體與鎘交叉反應(yīng)率為12.3%，與重金屬鐵、銅和鋅的交叉反應(yīng)率小于5.3%，具有較好的特異性。

3 ELISA法檢測(cè)重金屬常用方法

3.1 間接競(jìng)爭(zhēng)法

間接競(jìng)爭(zhēng)法的原理是將包被抗原包被在固相載體上，同時(shí)加入待檢樣品和抗體，使待檢樣品和包被抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體的結(jié)合位點(diǎn)，加入酶標(biāo)二抗顯色，底物顯色后可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待檢樣品中重金屬含量。該法易受多種因素干擾，造成檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性。Wang等[33]制備了抗Hg2+的特異性多克隆抗體，建立了間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法，測(cè)定水樣、牛奶、青菜、海帶中的Hg2+，ELISA分析結(jié)果表明，靈敏度IC 50為1.12 ng/mL，最低檢測(cè)限（IC 10）為0.08 ng/mL，回收率為80%～113%，與Hg+、Au3+的交叉反應(yīng)率分別為11.5%和4.4%，其他金屬離子如Cu2+、Sn2+、Ni2+、Mn2+、Pb2+、Cd2+、Zn2+均未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)，與CV-AFS檢測(cè)結(jié)果相比，液體樣品（水樣）的相關(guān)系數(shù)為0.97，其他樣品的相關(guān)系數(shù)為0.98，進(jìn)一步證明了汞間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確性。易翠平等[34]建立了Cd2+間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，靈敏度IC 50為1 150 ng/mL，最低檢測(cè)限為260 ng/mL（R2=0.991 6），可通過(guò)優(yōu)化ELISA條件提高該方法的檢測(cè)限，擴(kuò)大應(yīng)用范圍;與Hg2+有較強(qiáng)交叉，與Zn2+、Cu2+、Ca2+交叉較弱，與Mg2+、Ni2+、Al3+、Pb2+、Ba2+幾乎無(wú)交叉。Xu等[35]制備了Pb2+單克隆抗體，建立了間接競(jìng)爭(zhēng)法，測(cè)定水、食品和飼料中Pb2+含量，結(jié)果表明靈敏度IC 50為9.4 ng/mL，檢測(cè)限為0.7 ng/mL，且Pb2+單克隆抗體對(duì)其他金屬離子的交叉反應(yīng)率小于0.943%，表明所制得的單抗具有較高的靈敏度和特異性，回收率為82.1%～108.3%，表明該方法專屬性強(qiáng)，簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，可用于樣品中痕量鉛的測(cè)定。

3.2 直接競(jìng)爭(zhēng)法

直接競(jìng)爭(zhēng)的原理是將單克隆抗體包被于固相載體上，同時(shí)加入待檢樣品與已知濃度的酶標(biāo)半抗原，二者共同競(jìng)爭(zhēng)抗體的結(jié)合位點(diǎn)，顯色后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中所含重金屬離子的濃度。研究表明，直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA比間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA更加方便，檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確，其檢測(cè)pH范圍更寬。劉艷梅等[36]采用純化后的鎘單克隆抗體建立直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)，其靈敏度為 19 ng/mL，檢測(cè)限為2.1 ng/mL，檢測(cè)范圍為3.6～98.2 ng/mL，與石墨爐原子吸收法相比較，2種方法的線性相關(guān)系數(shù)R2=0.998，說(shuō)明該方法具有較高的準(zhǔn)確性，可用于實(shí)際樣品的快速檢測(cè)。

ELISA法因價(jià)格低廉、檢測(cè)速度快，被廣泛應(yīng)用于大規(guī)模樣品中的重金屬檢測(cè)。目前常見重金屬ELISA法檢測(cè)見表4。

4 展望

ELISA法是檢測(cè)食品中重金屬離子的一種新方法，與傳統(tǒng)方法相比，具有耗時(shí)短、費(fèi)用低、易操作等優(yōu)點(diǎn)，適用于大量樣品重金屬離子的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。目前，ELISA法檢測(cè)樣品中重金屬離子已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，但其研究尚處于起步階段，亟待解決的問(wèn)題主要有以下三點(diǎn)。

（1）進(jìn)一步優(yōu)化樣品前處理方法，在保證重金屬離子浸提效果的同時(shí)，盡量減小環(huán)境污染。

（2）如何進(jìn)一步合成新型螯合劑來(lái)螯合金屬離子，制備重金屬半抗原，是合成特異性強(qiáng)抗體的基礎(chǔ)。

（3）如何進(jìn)一步提高抗體的特異性，減小抗體與其他金屬離子的交叉反應(yīng)，是ELISA法快速檢測(cè)重金屬離子的關(guān)鍵。

可以預(yù)見，隨著以上問(wèn)題的逐步解決，ELISA法將會(huì)有更加廣闊的應(yīng)用前景。

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