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氣管切開(kāi)法銅綠假單胞菌肺部感染動(dòng)物模型的建立及評(píng)價(jià)*

2021-04-17 06:11李夏霖黎俊康韋麗霜李金壟
關(guān)鍵詞:無(wú)菌氣管肺部

李夏霖,黎俊康,韋麗霜,李金壟,王 可,閆 萍

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院,南寧 530021)

銅綠假單胞菌(PA)屬于一種廣泛存在的機(jī)會(huì)致病菌,常引起各種急、慢性感染,其中以肺部感染多見(jiàn),常見(jiàn)于慢性阻塞性肺?。–OPD)、支氣管擴(kuò)張、囊性纖維化(CF)等結(jié)構(gòu)性肺病的患者[1]。PA可以形成生物膜,進(jìn)而保護(hù)細(xì)菌免受宿主免疫和抗菌藥物的清除[2]。PA 肺部感染發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、治療棘手,為研究該病,許多PA肺部感染動(dòng)物模型已經(jīng)被建立[3]。本實(shí)驗(yàn)在國(guó)內(nèi)、外學(xué)者經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,使用改良低熔點(diǎn)瓊脂糖包裹PA,以氣管切開(kāi)方式注入大鼠肺部,建立大鼠PA肺部感染模型,并根據(jù)細(xì)菌學(xué)、病理學(xué)特點(diǎn)和炎癥因子含量來(lái)對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)分析,從而為PA 肺部感染的研究提供理想的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 菌株 PA標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)AO1,由丹麥哥本哈根大學(xué)醫(yī)院臨床微生物科惠贈(zèng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6~8 周齡健康清潔級(jí)雄性SD 大鼠36只,體重190~210 g,由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK桂2020-0004;動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK桂2020-0003。所有大鼠置于SPF 級(jí)無(wú)菌動(dòng)物房?jī)?nèi),分籠飼養(yǎng),自由飲水、攝食。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已通過(guò)廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理審查委員會(huì)審批。

1.3 主要試劑與儀器 磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂、LB肉湯(北京索萊寶科技有限公司);1%瓊脂糖(美國(guó)BIO BASIC公司);3%戊巴比妥鈉、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-17A 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(武漢華美公司)。超低溫冰箱(Thermo 995);生物安全柜(蘇凈安泰);生化培養(yǎng)箱(恒宇SPX-300-11);磁力攪拌器(德國(guó)IKA)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組與處理 將36只大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,每組18只。實(shí)驗(yàn)組通過(guò)氣管切口注入PA瓊脂糖包裹體懸液,建立PA肺部感染模型,對(duì)照組注入等量無(wú)菌瓊脂糖包裹體懸液。

1.5 瓊脂糖包裹體的制備[4]將PAO1 菌株從-80 ℃超低溫冰箱中復(fù)蘇至LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板,置于37 ℃培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)24 h,取單個(gè)菌落接種于10 mL的LB 營(yíng)養(yǎng)肉湯,放入恒溫(37 ℃)搖床中培養(yǎng)18 h。實(shí)驗(yàn)組的離心管中加入2 mL菌液(對(duì)照組為無(wú)菌等量LB 營(yíng)養(yǎng)肉湯)及無(wú)菌1 mL、50 ℃的瓊脂糖,迅速攪拌均勻后轉(zhuǎn)移至無(wú)菌5 mL、50 ℃的石蠟油中,通過(guò)磁力攪拌器于室溫下1 500 r/min攪拌6 min,置于碎冰上冷卻10 min。將所制得瓊脂糖包裹體轉(zhuǎn)移至

1.5 mL 離心管,4 ℃下9 000 r/min 離心20 min,棄上清液,用PBS 沖洗3 次后振蕩混勻于PBS。將瓊脂糖包裹體懸液按梯度稀釋,接種到LB 營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板,于37 ℃培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)24 h,行菌落計(jì)數(shù)。將瓊脂糖包裹體懸液稀釋成1×108CFU/mL濃度后,置于4 ℃冰箱中保存待用。

1.6 肺部感染模型建立 3%戊巴比妥鈉按30 mg/kg劑量麻醉大鼠,仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上,墊高頭端,頸部備皮,用碘伏消毒3次,于頸前正中線上切一小口,逐層鈍性分離組織暴露氣管,用彎鑷挑起氣管,在軟骨環(huán)之間開(kāi)一小口,將12 G彎頭灌胃針通過(guò)切口伸入,用1 mL注射器連接灌注0.15 mL PA瓊脂糖包裹體懸液,然后注入少量空氣確保灌胃針中殘留的懸液完全進(jìn)入肺中,縫合氣管和皮膚切口后消毒。動(dòng)物分籠飼養(yǎng),每日觀察大鼠的進(jìn)食情況與活動(dòng)精神狀態(tài)。

1.7 標(biāo)本采取與處理 分別于接種后的第1、第3、第5 天,每組隨機(jī)選取6 只大鼠麻醉后無(wú)菌條件下行腹主動(dòng)脈采血并處死,將血液標(biāo)本常溫靜置2 h后,2 500 r/min,離心10 min,取上層血清,置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。開(kāi)胸觀察肺臟大體病變并評(píng)分,無(wú)菌分離肺組織,放入無(wú)菌含2 mL PBS 的離心管或10%福爾馬林中。

1.8 肺細(xì)菌學(xué)檢查 取PBS離心管中的肺組織,于4 ℃下制成肺組織勻漿,梯度稀釋后從中取0.1 mL用涂布棒均勻地涂在瓊脂平板上,37 ℃下培養(yǎng)24 h,計(jì)算肺組織中的細(xì)菌菌落總數(shù)(CFU)。即CFU/mL=平板上菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×20。

1.9 肺大體病理觀察 打開(kāi)大鼠胸腔后觀察肺大體病理改變,根據(jù)肺大體病理改變以及炎癥嚴(yán)重程度分為4 級(jí)[5]:(1)Ⅰ級(jí):正常;(2)Ⅱ級(jí):充血、腫脹、肺不張;(3)Ⅲ級(jí):胸膜黏連、實(shí)變或肺不張;(4)Ⅳ級(jí):膿腫、出血、大面積實(shí)變或肺不張。

1.10 肺組織病理觀察 將所取肺組織常規(guī)包埋切片及蘇木精-伊紅(HE)染色,光學(xué)顯微鏡下觀察。根據(jù)炎癥嚴(yán)重程度,將肺組織病理改變分為4 級(jí)[6]:(1)Ⅰ級(jí):正常肺;(2)Ⅱ級(jí):輕度炎癥;(3)Ⅲ級(jí):中到重度炎癥伴有正常肺組織;(4)Ⅳ級(jí):重度炎癥到壞死或整個(gè)肺為重度炎癥。另外,根據(jù)鏡下觀察病灶內(nèi)浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞,多形核白細(xì)胞(PMN)≥90%、單核細(xì)胞(MN)≤10%為急性炎癥,MN≥90%、PMN≤10%或伴淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞和肉芽腫出現(xiàn)為慢性炎癥。

1.11 肺組織和血清中TNF-α、IL-17A含量檢測(cè)

將肺勻漿離心后取上清液,與血清標(biāo)本采用ELISA法檢測(cè)TNF-α和IL-17A水平,檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,呈偏態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示,等級(jí)資料比較采用秩和檢驗(yàn),正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物一般狀況 實(shí)驗(yàn)組在接種PA瓊脂糖包裹體后的第1 天,出現(xiàn)精神萎靡、食量減少、體重減輕以及眼、口、鼻分泌物增加等現(xiàn)象;第3 天實(shí)驗(yàn)組大鼠精神狀態(tài)差,伴有明顯喘鳴音;第5天實(shí)驗(yàn)組大鼠仍有喘鳴,毛發(fā)雜亂無(wú)光澤。對(duì)照組接種無(wú)菌瓊脂糖包裹體后第1天,大鼠除體重下降外,無(wú)其他明顯癥狀;第3、第5天大鼠體重恢復(fù),狀況良好。

2.2 肺組織細(xì)菌學(xué)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組接種后第1、第3、第5天均培養(yǎng)出較高濃度PA,分別為1.34×108CFU/mL(9.01×107~2.32×108)CFU/mL、2.90×107CFU/mL(4.50×106~7.15×107)CFU/mL、1.48×106CFU/mL(5.88×105~4.85×106)CFU/mL,對(duì)照組均未培養(yǎng)出PA。

2.3 肺組織大體病理改變 實(shí)驗(yàn)組肺多為Ⅳ級(jí)病變。實(shí)驗(yàn)組接種后第1 天可見(jiàn)肺大體嚴(yán)重充血、水腫、出血;第3 天肺局部實(shí)質(zhì)變和結(jié)節(jié)形成等表現(xiàn);第5天肺大面積實(shí)變,有膿腫形成,或伴肺外胸壁黏連等;對(duì)照組接種后第1 天肺有輕度充血,第3、第5天為肺正常組織外觀,見(jiàn)圖1、表1。

2.4 肺組織病理改變 實(shí)驗(yàn)組肺多為Ⅲ~Ⅳ級(jí)病變,接種后第1 天肺組織中大量PMN 浸潤(rùn),呈急性炎癥反應(yīng),并出現(xiàn)肺泡出血、肺血管擴(kuò)張和氣管腔及肺泡腔內(nèi)大量膿性分泌物等,第3天可見(jiàn)PMN減少,MN 逐漸增多,肺泡壁較前增厚,氣管腔和肺泡腔膿性分泌物減少;第5天可見(jiàn)大量MN浸潤(rùn),以單核巨噬細(xì)胞為主,并伴有淋巴細(xì)胞增生,呈慢性炎癥反應(yīng),并有纖維組織增生、肺泡間隔增粗等。對(duì)照組接種后第1天,肺局部可見(jiàn)少許炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),第3、第5天恢復(fù)為正常肺組織,見(jiàn)圖2、表2。

2.5 兩組TNF-α、IL-17A含量比較 接種后第1、第3、第5天,實(shí)驗(yàn)組血清和肺組織中TNF-α、IL-17A含量均高于對(duì)照組(P<0.05),且第5天血清和肺組織TNF-α、IL-17A 含量均高于接種后第1 天(P<0.01),見(jiàn)圖3。

圖1 兩組肺組織大體病理改變

表1 兩組肺組織大體病理評(píng)級(jí)比較 n

圖2 兩組肺組織病理改變(HE染色,×250)

表2 兩組肺組織病理評(píng)級(jí)比較 n

圖3 兩組血清和肺組織TNF-α和IL-17A含量比較

3 討論

PA 引起患者感染時(shí),常處于生物膜狀態(tài)[7]。為模擬PA 的生物膜狀態(tài),Cash 等[8]使用瓊脂包裹PA,但瓊脂熔點(diǎn)高,較易凝固,包裹PA的效果差,故本實(shí)驗(yàn)改良該方法,使用1%濃度的低熔點(diǎn)瓊脂糖包裹PA感染大鼠,建立PA肺部感染動(dòng)物模型。

按照Pearson 等[9]肺部感染模型標(biāo)準(zhǔn),當(dāng)肺組織勻漿培養(yǎng)均有PA 生長(zhǎng),含菌量>1×103CFU/mL,且肺組織病理可見(jiàn)肺組織水腫、實(shí)變、纖維滲出、大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和肺泡出血等則可認(rèn)為該肺部感染模型建立成功。本實(shí)驗(yàn)中的實(shí)驗(yàn)組大鼠各個(gè)時(shí)間點(diǎn)肺組織勻漿菌落計(jì)數(shù)結(jié)果均遠(yuǎn)高于1×103CFU/mL;在病理學(xué)檢查結(jié)果方面本實(shí)驗(yàn)?zāi)P鸵卜仙鲜瞿P蜆?biāo)準(zhǔn)。并且,肺部病理學(xué)結(jié)果顯示大鼠在接種PA瓊脂糖包裹體后的第1天,肺組織可見(jiàn)大量PMN浸潤(rùn),呈急性炎癥反應(yīng),第3、第5天,肺組織PMN逐漸減少,而單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等慢性炎癥細(xì)胞逐漸增多,并伴有肺泡間隔增厚和纖維組織增生等慢性炎癥表現(xiàn)。大鼠的肺部感染呈現(xiàn)了從急性炎癥表現(xiàn)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槁匝装Y的過(guò)程。因此,本實(shí)驗(yàn)采用氣管切開(kāi)法建立的大鼠PA 肺部感染模型可用于PA急慢性感染的研究。

PA 引起的肺部感染與多種細(xì)胞因子有關(guān)[10]。TNF-a 主要由活化的單核-巨噬細(xì)胞分泌,對(duì)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞具有較強(qiáng)的趨化作用[11]。而IL-17A主要由Th17細(xì)胞分泌,通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞因子、趨化因子和抗菌肽的表達(dá)來(lái)清除微生物感染。Bayes 等[12]研究表明,IL-17A 在PA 感染中能誘導(dǎo)TNF-α的產(chǎn)生并與之有協(xié)同作用,增強(qiáng)宿主的抗菌免疫應(yīng)答,但這種促炎作用的長(zhǎng)期維持會(huì)導(dǎo)致慢性炎癥。本研究中,實(shí)驗(yàn)組大鼠接種PA瓊脂糖包裹體后第1、第3、第5 天,大鼠肺、血清TNF-α、IL-17A含量逐漸上升,由此推測(cè),PA 促進(jìn)中性粒細(xì)胞和單核—巨噬細(xì)胞的募集和激活,分泌大量TNF-a、IL-17A,從而導(dǎo)致肺組織的急、慢性炎癥。這與本實(shí)驗(yàn)病理觀察結(jié)果(接種后第1 天肺組織大量PMN 浸潤(rùn),第3、第5 天肺組織PMN 逐漸減少,單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞逐漸增多)相一致。

目前,PA肺部感染動(dòng)物模型沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。動(dòng)物接種PA常用的方式有經(jīng)皮氣管穿刺、噴霧[13-14]、滴鼻[15-16]和插管[17-18]等。經(jīng)皮氣管穿刺對(duì)實(shí)驗(yàn)人員技術(shù)及設(shè)備要求較高,操作復(fù)雜;噴霧、滴鼻則不能準(zhǔn)確掌握動(dòng)物感染菌量,且易造成實(shí)驗(yàn)人員污染,成功率和安全性低;經(jīng)口插管易誤插食管,無(wú)法準(zhǔn)確判斷PA是否接種至肺部。本實(shí)驗(yàn)建立的PA肺部感染動(dòng)物模型具有以下特點(diǎn):第一,使用可塑性更好、包裹效果更均勻的低熔點(diǎn)瓊脂糖包裹PA,不但有效地避免宿主的免疫反應(yīng)清除,還能夠形成持續(xù)的感染,更類似于臨床PA肺部感染狀況;第二,接種部位固定于左肺下葉深部,大鼠不易發(fā)生接種物倒流而窒息死亡,PA 瓊脂糖包裹體也不易被清除,從而保證接種量的穩(wěn)定,因此更易造成肺部感染,形成肺的局部感染病灶,有利于實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)使用低熔點(diǎn)瓊脂糖包裹PA,通過(guò)氣管切開(kāi)法將PA 瓊脂糖包裹體注入到大鼠肺部,可成功建立操作安全、死亡率低、重復(fù)性好的大鼠PA肺部感染模型。這對(duì)深入研究PA肺部感染的發(fā)病機(jī)制、宿主免疫反應(yīng)、PA耐藥機(jī)制和尋找、研發(fā)新藥具有重要意義。

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