王桂英 張紅梅 魏永濤 許愛(ài)華 崔 震 張守忠

(1.濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，濟(jì)南 250102；2.山東省計(jì)量科學(xué)研究院，濟(jì)南 250014)

注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀為阿莫西林鈉與克拉維酸鉀按標(biāo)示量之比5∶1均勻混合制成的無(wú)菌粉末，目前已廣泛用于臨床，主要治療由產(chǎn)酶耐藥菌引起的呼吸及泌尿系統(tǒng)的感染。作為β-內(nèi)酰胺類抗生素，過(guò)敏反應(yīng)是其在臨床上不容忽視的問(wèn)題[1，2]，文獻(xiàn)研究表明，藥物中存在的高分子雜質(zhì)是引發(fā)各種速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)的過(guò)敏原[3，4]，因此，控制該類制劑中的高分子雜質(zhì)含量具有重要意義。注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀國(guó)內(nèi)現(xiàn)行有效的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是《中國(guó)藥典》2015年版二部，但未將高分子雜質(zhì)納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本試驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)[5-7]，建立了注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀中高分子雜質(zhì)的測(cè)定方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀( 美國(guó)安捷倫儀器有限公司)；賽多利斯ME5 BT125D電子天平[d=0.01mg]；阿莫西林對(duì)照品(批號(hào)130409-201512，含量86.9%)；克拉維酸對(duì)照品(批號(hào)130429-201708，含量95.1%)；乙腈為色譜純；其它試劑為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

流動(dòng)相為0.005 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)-乙腈(80:20)。色譜柱為TSK GEL 2500 PWXL(300 mm*7.8 mm,5 μm)，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫：25 ℃，進(jìn)樣量20 μL，流速：0.5 mL·min-1。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取供試品適量，加水溶解并稀釋制成含阿莫西林1.0 mg·mL-1的溶液。0.45 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取阿莫西林對(duì)照品適量,精密稱定,加流動(dòng)相溶解并稀釋制成含阿莫西林10 μg·mL-1的溶液,作為對(duì)照品溶液。精密量取供試品溶液與對(duì)照品溶液各20 μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖。

2.4 強(qiáng)制降解試驗(yàn)

精密稱取注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀適量，按“2.2”項(xiàng)下方法配制成含阿莫西林鈉1.0 mg·mL-1的溶液，分別進(jìn)行強(qiáng)酸(加0.1 mol·L-1鹽酸溶液1 mL，室溫放置5 min)、強(qiáng)堿(加0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液1 mL，室溫放置5 min)、強(qiáng)光(4500 lx，6 h)、高溫(65 ℃水浴加熱10 min)、氧化(加入1%雙氧水2 mL，放置5 min)等強(qiáng)制降解試驗(yàn)，得各降解試驗(yàn)溶液。精密量取上述各降解溶液各20 μL，分別注入色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果供試品經(jīng)破壞后，高分子雜質(zhì)均有增加，其中經(jīng)氧化破壞后高分子雜質(zhì)增加尤為明顯。結(jié)果表明，高分子雜質(zhì)峰與主峰有效分離，本色譜系統(tǒng)專屬性良好。結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 典型色譜圖A.供試液；B.阿莫西林對(duì)照品；C.克拉維酸對(duì)照品；D.溶劑

圖2 破壞降解試驗(yàn)色譜圖A.強(qiáng)酸降解；B.強(qiáng)堿降解；C.強(qiáng)光降解；D.高溫降解；E.氧化降解；F.雙氧水溶劑

2.5 線性

精密稱取阿莫西林對(duì)照品，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋制成3.84、9.59、19.19、47.97、95.94 μg·mL-1系列濃度的對(duì)照品溶液。精密稱取克拉維酸對(duì)照品，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋制成4.04、10.11、20.22、50.54、101.09 μg·mL-1系列濃度的對(duì)照品溶液。分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。分別以阿莫西林鈉、克拉維酸鉀濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得阿莫西林回歸方程為y=6.02668x-0.165586(相關(guān)系數(shù)r=1.0000)，克拉維酸回歸方程為y=1.19874x+0.501622(相關(guān)系數(shù)r=0.99998)。結(jié)果表明，阿莫西林在3.84～95.94 μg·mL-1、克拉維酸在4.04～101.09 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.6 檢出限與定量限

分別將阿莫西林、克拉維酸對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋，記錄色譜圖，阿莫西林檢出限為0.24 μg·mL-1，定量限為0.80 μg·mL-1；克拉維酸檢出限為1.35 μg·mL-1，定量限為4.50 μg·mL-1。

2.7 精密度和重復(fù)性

精密吸取阿莫西林鈉對(duì)照品(9.59 μg·mL-1)、克拉維酸鉀對(duì)照品(10.11μg·mL-1)各20μL，按“2.1”色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，峰面積的RSD分別為0.25%和0.47%，表明儀器精密度良好。

平行制備供試品溶液6份，按“2.1”色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀中高分子雜質(zhì)的總量，平均結(jié)果為1.75%，RSD=0.8%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性

取供試品溶液，按“2.1”色譜條件，分別于 0、0.5、1、2、3 h 時(shí)進(jìn)樣，計(jì)算得RSD=8.4%(n=5)，說(shuō)明供試品不穩(wěn)定，提示應(yīng)臨用新制。

精密稱取克拉維酸鉀原料0.02 g，用水溶解配制濃度為含克拉維酸200 μg·mL-1的溶液，按“2.1”色譜條件，分別于 0、1、2、3、5 h時(shí)進(jìn)樣，峰面積無(wú)顯著變化，說(shuō)明克拉維酸鉀溶液5 h內(nèi)基本穩(wěn)定，對(duì)樣品高分子雜質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果計(jì)算無(wú)影響，故本實(shí)驗(yàn)高分子雜質(zhì)的結(jié)果按外標(biāo)法以阿莫西林計(jì)算。

2.9 樣品測(cè)定結(jié)果

3家企業(yè)9批注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀，按“2.1”項(xiàng)下的方法進(jìn)行測(cè)定，用外標(biāo)法按阿莫西林計(jì)算高分子雜質(zhì)的含量。結(jié)果見(jiàn)表1。高分子雜質(zhì)含量平均值為1.46%。

表1 注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀中高分子雜質(zhì)含量情況

3 討論

3.1 磷酸鹽緩沖液濃度的選擇

流動(dòng)相中磷酸鹽緩沖液的濃度最初考慮0.005、0.01、0.05 mol·L-13個(gè)方案，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)濃度為0.005 mol·L-1時(shí)，主峰與相鄰雜質(zhì)峰已能較好的分離，綜合考慮，選擇濃度較低的磷酸鹽緩沖液作為流動(dòng)相。

3.2 耐用性試驗(yàn)

通過(guò)改變波長(zhǎng)±2nm、柱溫±5℃、pH±0.2來(lái)考察分析方法的耐用性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在波長(zhǎng)、柱溫、pH等條件發(fā)生微小變化時(shí)，兩主峰與相鄰雜質(zhì)峰均能良好分離，說(shuō)明本方法耐用性較好。

3.3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了一種檢測(cè)注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀中高分子雜質(zhì)的TSK凝膠色譜法，并對(duì)方法進(jìn)行了評(píng)價(jià)，試驗(yàn)表明該方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，重現(xiàn)性好，為L(zhǎng)C-MS鑒別注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀中的高分子雜質(zhì)分析奠定了基礎(chǔ)，也為制劑的質(zhì)量研究提供參考。