吳慧如，梁曉磊，邵洋洋，謝青梅，李鴻鑫

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由 ASF 病毒(African swine fever virus，ASFV)感染而引起的一種豬急性、烈性傳染病，傳播速度極快，死亡率可達100%，嚴重危害生豬養(yǎng)殖業(yè)[1]。ASFV屬非洲豬瘟病毒科，是一種大型雙鏈DNA病毒，長度從170 kb到190 kb不等。該病毒粒子呈二十面體對稱，平均直徑為260～300 nm，由內(nèi)到外分別為核質(zhì)體、核衣殼、囊膜，可編碼不少于167種蛋白，且其中仍有多種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能未確定。ASFV最早于1921年出現(xiàn)在肯尼亞，我國于2018年8月首次報道該病毒存在，現(xiàn)已擴散到全國各地并呈現(xiàn)蔓延態(tài)勢，也是目前我國規(guī)定的一類動物疫病[2]。受其影響，2019 年我國生豬產(chǎn)能總體下降了約40%，生豬存欄量同比下降27.5%，能繁母豬存欄下降了約50%[3]。遺憾的是，因該病毒結(jié)構(gòu)復(fù)雜、基因型多樣以及對該病毒結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能了解有限，盡管過去幾十年已開展了多種類型疫苗研發(fā)，從滅活病毒、重組蛋白/肽和DNA疫苗到減毒活疫苗(LAV)候選物，但因候選疫苗保護效果不理想、副作用嚴重或臨床試驗未完成等原因，迄今為止仍未研制出針對ASFV有效的商品化疫苗[3]。面對日趨嚴峻的ASF疫情，安全有效的疫苗是防控ASF的亟需工具。本文總結(jié)了ASF滅活疫苗、減毒活疫苗、病毒活載體疫苗、亞單位疫苗、DNA疫苗研究進展及其難點和突破點，為我國ASF疫苗研發(fā)和防控提供參考。

1 滅活疫苗

滅活疫苗是利用加熱或甲醛等理化方法，使病原喪失感染能力和毒性而保留其免疫原性，并結(jié)合相應(yīng)的免疫佐劑制備而成。滅活疫苗具有制備方法簡單、價格低等優(yōu)勢，是很多疫病疫苗制備首選的工藝。ASF滅活疫苗早在1960年就開始研制，但已有的研究表明這類疫苗基本不能對ASFV感染起到保護作用[4]。即使使用高效新型佐劑，如Polygen(TM)或Emulsigen(R)-D配制ASF滅活疫苗，并在感染豬體內(nèi)檢測到了抗ASFV的特異性抗體，但仍不能誘導(dǎo)免疫豬產(chǎn)生保護性免疫反應(yīng)，抵御不住ASFV的攻擊，甚至可能出現(xiàn)癥狀加強現(xiàn)象[5-6]。因此，根據(jù)目前的研究結(jié)果顯示ASF滅活疫苗無法提供有效保護效力。這可能與ASFV在宿主細胞內(nèi)外具有不同的病毒生物學(xué)特性有關(guān)，在宿主細胞內(nèi)外不同區(qū)域成熟ASFV粒子的病毒顆粒表面蛋白有著巨大差異，可能導(dǎo)致免疫原性改變從而影響滅活疫苗效果[7]。當然準確的、具體的原因還需要進一步深入研究。

2 減毒活疫苗

減毒活疫苗是病原體經(jīng)過各類處理后，毒性亞單位的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，病原致病力減弱但仍保留其免疫原性的疫苗，具有使用劑量小、免疫持續(xù)周期長、成本低和使用方便等優(yōu)點。豬感染ASFV耐受后能夠一定程度抵抗ASFV再次感染，表明減毒活疫苗免疫可能對ASFV有保護效果。目前研制的ASF減毒活疫苗按來源可分為自然弱化活疫苗(包括連續(xù)傳代致弱活疫苗)和重組致弱活疫苗。ASFV 可在Vero與CV1細胞內(nèi)復(fù)制傳代，并可通過連續(xù)傳代來降低其毒力。Krug等[8]在Vero細胞系中連續(xù)傳代ASFV-G株，至110代次時ASFV-G喪失毒力，但是弱化的ASFV-G株也丟失了保護性免疫抗原，即傳代弱化的ASFV毒株因病毒外膜脂質(zhì)的差異不具備毒株原本的中和活性，使得此類疫苗研發(fā)受阻。自然弱化的毒株代表為OURT88/3和HN/P86，該類毒株免疫豬群后可獲得抗親本毒株的免疫保護，并對不同基因型ASFV具有部分交叉保護，保護率為66%～100%[9-10]。其中OURT88/3可以抵御 OUR/T88/1、genotype X Uganda、Benin 97/1株的攻擊，但是隨著CD8+T淋巴細胞的消耗，會使免疫效果減退，造成不完全保護[9,11]；HN/P86可促進細胞毒性T淋巴細胞與NK細胞的活性，并抵御 ASFV/L60 強毒株的攻擊但會引發(fā)部分豬群出現(xiàn)慢性感染現(xiàn)象[12-13]。雖然這些弱毒疫苗沒有研制成功，但這些研究提示CD8+T淋巴細胞、細胞毒性T淋巴細胞和NK細胞在ASFV的保護性免疫中可能有重要作用。另外也有研究表明，不同免疫劑量對免疫效果也有影響[14]，提示免疫方式與劑量會對自然弱化活疫苗免疫效果產(chǎn)生影響。歷史上自然弱化活疫苗最早于上世紀60年代在葡萄牙和西班牙開始使用，但隨著疫苗的大量推廣，免疫豬群出現(xiàn)越來越多的慢性ASFV感染，還出現(xiàn)了不同程度的副作用，主要癥狀包括關(guān)節(jié)炎、肺炎、流產(chǎn)、運動障礙及死亡等，后續(xù)研制雖然改進了疫苗的保護效力，但依然有出現(xiàn)低病毒血癥或關(guān)節(jié)炎等副反應(yīng)[9,12,15]。出于安全考慮，在沒有解決這些副作用之前，自然弱化的ASF疫苗推廣和使用會暫時受到限制。

重組致弱活疫苗是通過現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對病毒的基因或結(jié)構(gòu)進行改造從而實現(xiàn)病毒的毒力減弱，并以此制備成疫苗?，F(xiàn)有研究表明ASFV在缺失TK、9GL、UK、EP402R、NL或MGF 360/505基因后，病毒仍具有較好的免疫原性且病毒毒力顯著下降，以此制備為減毒活疫苗，可不同程度抵御不同來源的ASFV強毒株的感染[7,16-17]。TK基因缺失能致弱ASFV毒力，但不同毒株缺失TK基因后免疫原性有差異，Malwi和Gorigia缺失TK基因后致病力均減弱，但只有Malwi株誘導(dǎo)免疫豬產(chǎn)生保護性免疫反應(yīng)[18]。流行毒株Georgia 2007/1敲除9GL和MGF360/505基因后病毒毒力減弱，但保護效果不理想，而當9GL和UK基因缺失時，卻具有很好的免疫原性，該毒株制備成的減毒活疫苗能有效抵抗同源強毒株的感染，對不同基因型強毒株有一定的交叉保護效果[19]。BA71毒株缺失CD2v基因后，其毒力明顯減弱，將其制備成的基因缺失減毒活疫苗同樣對同源的強毒株具有強抵抗力，也對不同基因型毒株(如Georgia 2007/1)具有一定的交叉保護作用[20]。NL基因缺失同樣可使部分毒株毒力變?nèi)酰敋W洲株E70缺失該基因后毒力完全致弱[21]。此外，缺失A224L、A238L、A276R基因的NH/P68毒株對多種基因型毒株也可提供保護(保護率為60%～100%)，但對部分豬免疫后產(chǎn)生病毒血癥等副作用[22]。值得重點關(guān)注的是我國哈爾濱獸醫(yī)研究所正在研發(fā)的七基因缺失ASFV疫苗進展順利，通過敲除DP148R、EP402R、9GL、UK等基因使病毒毒力減弱，在完成實驗室研究和中試工作后，于黑龍江、河南和新疆等地啟動了疫苗臨床試驗，且免疫豬群后表現(xiàn)出良好的安全性和有效性[23]。目前，制約ASF重組致弱活疫苗研發(fā)的主要因素是ASFV毒力相關(guān)基因研究不足，但隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和優(yōu)化，ASFV的各基因序列和功能將越來越清晰，可通過DNA重組技術(shù)、病毒反向遺傳操作及基因編輯等技術(shù)進行基因組序列定點替換或敲除，實現(xiàn)對目標病毒關(guān)鍵毒力基因的改造(缺失或修改)，促使毒株致弱、變安全，從而得到候選疫苗株。綜上研究，ASF重組致弱活疫苗可能會是我國最早實現(xiàn)商品化供應(yīng)的候選疫苗。

3 病毒活載體疫苗

重組活載體疫苗是利用基因工程技術(shù)將編碼病原體保護性抗原的基因插入活載體中并使之表達的活疫苗，主要包括重組病毒載體活疫苗和重組細菌載體活疫苗。其兼具滅活疫苗的安全性和活疫苗的效果好、成本低等優(yōu)點。目前常作為動物病毒重組活載體疫苗的載體有：痘病毒活載體、皰疹病毒活載體、腺病毒活載體、新城疫病毒活載體及水泡性口炎病毒活載體等[24]。以痘病毒、腺病毒、甲病毒和新城疫病毒為表達載體的ASFV活載體疫苗也已廣泛開展。Jancovich等[25]通過痘病毒載體鑒定出47種ASFV保護性抗原，并篩選出能有效刺激機體體液免疫和細胞免疫的p30、p72等抗原，以痘病毒為載體制備了候選疫苗，但因免疫豬群有嚴重的副反應(yīng)，需進一步改進。Netherton等[26]通過ASFV OUR/T33株預(yù)測出133個抗原肽，并從中篩選出能激活細胞免疫反應(yīng)的肽段，以此肽段對應(yīng)基因構(gòu)建腺病毒和痘病毒載體疫苗，免疫豬群可明顯降低血液中病毒滴度，但未能起到攻毒保護作用。Lopera-Madrid等[27]將ASFV的p72、p54、p12、EP153R、EP402R分別插入減毒牛痘病毒載體中構(gòu)建重組病毒表達ASFV多個抗原，采取“雞尾酒”式混合免疫和加強免疫豬群，可誘導(dǎo)針對ASFV抗原的強烈抗體反應(yīng)和T細胞反應(yīng)。Lokhandwala 等[28-29]通過構(gòu)建人5型腺病毒載體和復(fù)制缺陷型腺病毒載體表達ASFV保護性抗原基因(p32、p54、p62和p72)，同樣以“雞尾酒”式混合免疫豬群，也誘導(dǎo)了強烈抗體反應(yīng)。Murgia等[30]利用甲病毒載體分別構(gòu)建表達ASFV p30、p54、p72抗原的載體，并通過Vero細胞進行病毒拯救，最終找到了免疫原性特別強的重組毒株ASFV p30。Chen等[31]將ASFV的p72基因插入新城疫病毒構(gòu)建重組病毒，并證實該重組病毒能在雞胚中復(fù)制，在免疫小鼠中可產(chǎn)生高抗體，且能誘導(dǎo)T細胞增殖和分泌IFN-γ和IL-4。但上述研究均尚未有完整的豬群攻毒保護試驗數(shù)據(jù)，免疫效果需進一步驗證。病毒活載體疫苗能誘導(dǎo)免疫動物產(chǎn)生體液免疫、細胞免疫，甚至黏膜免疫，載體中還可以插入多個外源基因(可以是不同病原的抗原基因)并同時表達，是多價疫苗和多聯(lián)疫苗的開發(fā)的重點方向，并能利用成熟的疫苗載體快速制備新發(fā)毒株或流行毒株的載體疫苗候選毒株，縮短研制周期，提高保護效果。因此，病毒活載體疫苗是未來ASF疫苗研發(fā)的重點方向。

4 亞單位疫苗

亞單位疫苗是通過可控制性的蛋白質(zhì)分解或水解方法，再純化、篩選出具有免疫活性的片段制成的疫苗。該類疫苗克服了傳統(tǒng)減毒活疫苗毒力返強問題以及滅活疫苗滅活不完全的安全性問題，是目前尚不能培養(yǎng)或繁殖有困難的病毒相關(guān)疫苗研發(fā)的重要途徑。ASF亞單位疫苗是將特定ASFV保護性抗原基因在合適的系統(tǒng)中進行亞單位表達，純化制備成疫苗，可誘導(dǎo)免疫豬群產(chǎn)生針對ASFV的保護性中和抗體。但ASFV可編碼167種蛋白，使得保護性抗原篩選變得非常困難。而且ASFV蛋白結(jié)構(gòu)、功能復(fù)雜，有些蛋白既是病毒中和靶位也具有誘導(dǎo)機體產(chǎn)生保護性免疫的潛能。目前，已證實ASFV p30、p54、p72 和CD2v等蛋白是病毒粒子重要的免疫原[32-34]。利用重組桿狀病毒表達CD2v蛋白所制備的疫苗對同源的ASFV強毒株具有部分的免疫保護效果[35]。利用桿狀病毒表達p12蛋白所制備的亞單位疫苗能夠以劑量依賴的形式抑制ASFV在豬肺泡細胞上的增殖，但無法提供免疫性保護[36]。用p30或p54蛋白所制備的亞單位疫苗可誘導(dǎo)免疫豬產(chǎn)生中和抗體，但沒能改變病程，也沒能阻止免疫豬群的感染死亡，而用p30和p54聯(lián)合制備的疫苗，可使免疫豬群體內(nèi)產(chǎn)生中和抗體，并在一定程度上改善病程，實現(xiàn)部分免疫保護作用[37]，提示ASFV不同的蛋白組合或抗原數(shù)量會影響保護效果。但利用重組桿狀病毒同時表達p30、p54和 p72蛋白所制備的亞單位疫苗免疫豬群后仍無法抵御ASFV強毒攻擊[38]。而Ruiz-Gonzalvo等[35]利用桿狀病毒表達CD2v、p54和p30蛋白來免疫豬群可誘發(fā)豬體不僅產(chǎn)生中和抗體，而且攻毒后全部存活下來，可惜免疫豬群可能會出現(xiàn)病毒血癥。表明ASFV的p72、p54、p30等蛋白誘發(fā)產(chǎn)生的抗體，能夠在一定程度上中和病毒，抑制病毒復(fù)制過程。另外，ASFV蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜也可能是影響亞單位疫苗免疫效果的重要因素，如p72蛋白作為感染豬體內(nèi)能檢測到的主要抗原之一，體外單獨表達的p72蛋白會出現(xiàn)錯誤折疊構(gòu)象，只有在輔助蛋白B602L共同表達時才可能得到正確折疊構(gòu)象的p72蛋白。這些研究提示制備ASF亞單位疫苗時需要注意ASFV抗原蛋白的選擇、組合及種類。隨著ASFV編碼蛋白功能的研究越來越多，通過選擇合適的基因及合適的載體研制亞單位疫苗是能夠獲得成功的。

5 DNA疫苗

核酸疫苗是將含有編碼抗原蛋白的外源基因直接導(dǎo)入宿主細胞內(nèi)，并利用宿主表達系統(tǒng)合成特異性抗原蛋白，激活宿主的細胞或體液免疫，以達到預(yù)防和治療疾病的目的疫苗。核酸疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗，目前開發(fā)的核酸疫苗主要為DNA疫苗。與傳統(tǒng)的滅活疫苗或減毒活疫苗相比，DNA疫苗具有安全、高效、制備便捷等潛在優(yōu)勢，特別是可通過對靶基因的改造從而選擇抗原決定簇，人為實現(xiàn)同種異株交叉保護的疫苗株出現(xiàn)。前期研究已表明CTL免疫反應(yīng)在疫苗抗病毒過程發(fā)揮著重要作用[9,11-13]，而DNA疫苗在誘導(dǎo)細胞介導(dǎo)的CTL免疫反應(yīng)上效果顯著。Argilaguet 等[39]將編碼p54和p30基因的真核表達質(zhì)粒制成DNA疫苗，免疫豬群時既不產(chǎn)生T細胞反應(yīng)也無法抵抗ASFV強毒的攻擊。用編碼豬白細胞抗原基因SLAII與p30/p54融合的DNA疫苗免疫豬群則能產(chǎn)生廣泛的免疫反應(yīng)(包括特異性抗體和T細胞)，但不能誘導(dǎo)抗病毒性感染的中和抗體，將CD2v、p30和p54組合免疫豬群也可以增強體液和細胞免疫，但也無法提供免疫保護，然而將p30、p54、CD2v和泛素基因串連起來制備為DNA疫苗，可強烈誘導(dǎo)免疫豬群產(chǎn)生細胞免疫，并給免疫豬群提供了攻毒保護效果(無檢測到抗體產(chǎn)生條件下)，再次證明細胞免疫在疫苗抗病毒中發(fā)揮的重要作用[40]。為進一步刺激CD8+T細胞的潛在免疫保護區(qū)，Lacasta等[41]構(gòu)建了幾千個表達質(zhì)粒，通過DNA表達文庫識別參與ASFV保護性免疫的T細胞靶點，并以此制備成DNA疫苗免疫機體，但攻毒保護率僅60%，而幸運的是免疫攻毒后存活的豬群沒有出現(xiàn)排毒現(xiàn)象。這些研究表明T細胞在ASFV刺激機體產(chǎn)生的免疫保護中發(fā)揮重要作用，ASFV存在多種具有潛在保護能力的抗原。但目前已報道的可應(yīng)用于構(gòu)建DNA疫苗的ASFV保護性抗原仍不足以對免疫豬群提供完全保護。未來ASF DNA疫苗的研發(fā)，需要對ASFV未知的保護性抗原進行更全面篩選和研究。尋找出更適合的保護性抗原以及優(yōu)化表達載體，有效結(jié)合體液免疫和細胞免疫，提高疫苗的保護率。

6 小結(jié)

從ASF發(fā)現(xiàn)至今已近百年，對養(yǎng)豬行業(yè)更是帶來了無比沉重的打擊，但對ASFV各方面的研究和認識還急需進一步探索。雖然在ASFV基因的功能結(jié)構(gòu)、入侵方式及宿主抗ASFV免疫反應(yīng)等方面取得了一定成果，也嘗試開發(fā)了多種疫苗，但都因為不能提供完全保護或存在不良反應(yīng)等副作用而無法推廣。以目前的研究進展看，減毒活疫苗能相對完整地保留病毒結(jié)構(gòu)，可在豬群體內(nèi)正常復(fù)制，刺激機體產(chǎn)生中和抗體，且能顯著控制病毒毒力，成為最有希望可以實現(xiàn)的高效、安全、商品化的ASF候選疫苗。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展和對ASFV致病機制、免疫逃逸機制、毒力基因等研究、認識的不斷加深，更加可靠的、可控的非洲豬瘟疫苗將會在不遠的將來成功面世。