周潛 韓燕 劉經(jīng)緯 尹躍平

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病醫(yī)院 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病控制中心，南京210042

志賀菌（Shigella）于1898年由Kiyoshi Shiga發(fā)現(xiàn)并命名，是細(xì)菌性痢疾的病原體[1]。根據(jù)菌體抗原的結(jié)構(gòu)不同分為4個(gè)血清群：痢疾志賀菌（S.dysenteriae）、福氏志賀菌（S.flexneri）、鮑氏志賀菌（S.boydii）和宋內(nèi)志賀菌（S.sonnei）[2]。目前已發(fā)現(xiàn)志賀菌對(duì)包括磺胺類、四環(huán)素類、鏈霉素以及喹諾酮類等多種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥[1]。志賀菌耐藥機(jī)制與藥物作用靶位的改變、染色體編碼的外排系統(tǒng)蛋白表達(dá)增強(qiáng)和質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥基因的表達(dá)有關(guān)[3]。2019年，WHO建議將環(huán)丙沙星作為治療志賀菌感染的一線藥物，阿奇霉素、頭孢克肟和頭孢曲松作為二線治療藥物[4]。本文選取喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類與β-內(nèi)酰胺類三類抗菌藥物，綜述了志賀菌耐藥基因及其檢測(cè)方法的研究進(jìn)展和應(yīng)用。

一、志賀菌耐藥基因

1.喹諾酮類耐藥基因

志賀菌耐喹諾酮類藥物的機(jī)制主要包括染色體介導(dǎo)的藥物作用靶位基因的改變與質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因。染色體介導(dǎo)的氟喹諾酮類抗菌藥物的耐藥主要是編碼DNA回旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的基因發(fā)生突變導(dǎo)致，DNA回旋酶由gyrA和gyrB基因編碼，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ由parC和parE基因編碼[5]。突變最常發(fā)生在gyrA基因起始處附近Ala67和Gln107之間的區(qū)域，即喹諾酮類藥物耐藥決定區(qū)（QRDR），以gyrA基因上的Ser83、Asp87和His211突變最為常見(jiàn)[6]，并常與parC上的Ser80突變共同發(fā)生，在parC和gyrA區(qū)域發(fā)生多個(gè)突變能顯著降低志賀菌對(duì)喹諾酮類藥物的敏感性[7]。

質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類抗性區(qū)基因（PMQR），即qnr基因分離物[qnrA、qnrB、qnrS、aac（6’）-Ⅰb-cr]可借助如整合子或插入序列共同區(qū)等可移動(dòng)遺傳元件，通過(guò)接合或轉(zhuǎn)化的方式，在志賀菌與其他腸桿菌科細(xì)菌之間傳播[8]。aac（6’）-Ⅰb-cr和qnrS基因分別于1998年和2002年首次在福氏志賀菌2a型和1a型中發(fā)現(xiàn)[9]。Qnr蛋白能直接與DNA結(jié)合，減少回旋酶與DNA的結(jié)合，并保護(hù)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ免受喹諾酮的侵害，從而逆轉(zhuǎn)喹諾酮類抑制DNA回旋酶的能力，同時(shí)Qnr家族蛋白可以提高細(xì)菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥突變預(yù)防濃度（MPC）值，從而提高耐藥突變的發(fā)生率。aac（6’）-Ⅰb-cr基因編碼與喹諾酮活性降低相關(guān)的氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶，這種雙功能酶能乙?；h(huán)丙沙星、諾氟沙星和其他喹諾酮類藥物，但左氧氟沙星不受這種乙酰轉(zhuǎn)移酶的影響[8]。除此以外，在志賀菌中也發(fā)現(xiàn)了mdfA、acrA和acrB等外排泵編碼基因調(diào)節(jié)的喹諾酮類藥物耐藥性[10]。

2.大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因

大環(huán)內(nèi)酯類藥物通過(guò)阻斷50s核糖體中肽酰轉(zhuǎn)移酶的活性，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成發(fā)揮抑菌作用。以往的研究認(rèn)為志賀菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥主要原因?yàn)樗幬镒饔冒形坏母淖?，如編碼L22核糖體蛋白的rplV與編碼L4核糖體蛋白的rplD和rrlH基因發(fā)生點(diǎn)狀突變；以及由ompA、ompW、mefA和msrA等外排泵介導(dǎo)的耐藥性。近年的研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒介導(dǎo)的阿奇霉素耐藥基因同樣發(fā)揮重要的作用，包括mph、erm和ere基因[11-12]。mph基因編碼的磷酸轉(zhuǎn)移酶可使脫氧二甲胺己糖C-2’位置發(fā)生磷酸化而失活，與阿奇霉素耐藥高度相關(guān)，對(duì)阿奇霉素高度耐藥（MIC>256 μg/mL）的志賀菌中均發(fā)現(xiàn)攜帶有mphA基因[13]。根據(jù)對(duì)mphA相關(guān)質(zhì)粒的研究，志賀菌中mphA耐藥基因的獲得主要來(lái)源于大腸桿菌質(zhì)粒的傳播[14]。法國(guó)的研究篩查到攜帶p2246-CTXM質(zhì)粒的阿奇霉素耐藥志賀菌上帶有IS26-mphA-mrx-mphR（A）-IS6100基因盒[12]。erm基因是紅霉素甲基化酶基因，使核糖體23S rRNA上特定位點(diǎn)的腺嘌呤甲基化以阻止紅霉素結(jié)合，在以色列發(fā)現(xiàn)攜帶ermB基因的2a型福氏志賀菌菌株表現(xiàn)出對(duì)阿奇霉素低敏[15]。

男男性行為者（MSM）人群中發(fā)現(xiàn)的志賀菌表現(xiàn)出對(duì)阿奇霉素的敏感性降低，并篩查出多種攜帶大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因的質(zhì)粒，Darton等[16]研究發(fā)現(xiàn)在MSM中暴發(fā)的宋內(nèi)志賀菌和3a型福氏志賀菌中存在具有顯著的DNA同源性的IncFⅠ和IncFⅡ質(zhì)粒，上有erm基因，該基因通過(guò)編碼rRNA甲基化酶進(jìn)行靶位修飾使志賀菌產(chǎn)生耐藥性。英國(guó)的一項(xiàng)橫斷面研究對(duì)MSM人群中暴發(fā)的3a型福氏志賀菌進(jìn)行全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了攜帶mphA和ermB的質(zhì)粒pKSR100，表現(xiàn)為對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的高水平耐藥性[17]，該質(zhì)粒也被證實(shí)存在于2a型福氏志賀菌與宋氏志賀菌中[18]。

3.β-內(nèi)酰胺類耐藥基因

志賀菌耐β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的重要機(jī)制是質(zhì)粒中的含有超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）基因與AmpC酶基因。ESBLs屬于Ambler分類A類，Bush分類的2be亞群，對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物具有廣泛水解活性。2004年，首次在孟加拉國(guó)發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)ESBLs的志賀菌[19]。迄今為止，已有多個(gè)國(guó)家和地區(qū)的研究發(fā)現(xiàn)志賀菌攜帶不同類型的ESBLs基因，包括blaTEM、blaSHV和blaCTX-M基因[20-21]，其中CTX-M型ESBLs與 耐 藥性的水平傳播最為相關(guān)，CTX-M-15對(duì)哌拉西林、芐青霉素、頭孢曲松和頭孢噻肟具有很高的催化效率[22-23]。在來(lái)自中國(guó)患者的福氏志賀菌分離株中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)偶聯(lián)質(zhì)粒IncHI2和IncF，攜帶有blaCTX-M-123的ESBLs基因，該基因由CTX-M-9和CTX-M-1組成，可在福氏志賀菌中水平傳播[24]。SHV基因型ESBLs是廣譜酶SHV-1的編碼基因核苷酸突變形成的酶，如SHV-2相比SHV-1發(fā)生Gly238→Ser突變，具有超廣譜特性[25]。近年還發(fā)現(xiàn)有攜帶SHV-12等SHV型超廣譜酶的志賀菌流行[26]。TEM型內(nèi)酰胺酶根據(jù)其水解底物譜，可分為4類包括廣譜B內(nèi)酰胺酶、ESBLs、耐酶抑制劑β-內(nèi)酰胺酶和CMT。志賀菌中發(fā)現(xiàn)由質(zhì)粒介導(dǎo)的TEM-1基因發(fā)生水平轉(zhuǎn)移，引起宋氏志賀菌對(duì)氨芐西林的耐藥[27]。

AmpC酶是由染色體或質(zhì)粒介導(dǎo)產(chǎn)生的一類β-內(nèi)酰胺酶，屬于Ambler分類C類，Bush分類的1群，為作用于頭孢菌素且不被克拉維酸抑制的β-內(nèi)酰胺酶。Taneja等[28]研究發(fā)現(xiàn)，有20%對(duì)頭孢曲松或頭孢吡肟具有耐藥性的福氏志賀菌產(chǎn)AmpC酶。在中國(guó)臺(tái)灣的細(xì)菌性痢疾流行期間，也發(fā)現(xiàn)耐頭孢曲松的宋內(nèi)志賀菌分離株中存在CMY-2型AmpC β-內(nèi)酰胺酶質(zhì)粒[29]。

二、志賀菌耐藥基因的檢測(cè)方法

1.常規(guī)PCR法

PCR法是將志賀菌耐藥基因作為靶基因，針對(duì)基因兩端設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)行瓊脂糖電泳或序列測(cè)定以檢測(cè)靶基因是否存在或發(fā)生突變的方法。PCR法在耐藥基因檢測(cè)方面具有操作簡(jiǎn)便、成本低等特點(diǎn)。1994年，Rahman等[30]根據(jù)大腸埃希菌gyrA基因設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)結(jié)合PCR法與一代DNA測(cè)序技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)了喹諾酮耐藥志賀菌gyrA基因上的Ser83突變。之后，更多研究者使用PCR法鑒定出志賀菌耐藥基因，Ezernitchi等[15]使用PCR法對(duì)以色列2014—2016年收集的志賀菌進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)，其中對(duì)阿奇霉素低敏感的志賀菌均帶有mphA和ermB基因。毛聯(lián)鋼等[31]使用PCR法對(duì)寧波地區(qū)腸道感染志賀菌喹諾酮類藥物耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)環(huán)丙沙星耐藥菌中97.59%的分離株帶有Ser83、Asp87和Ser80突變。

2.多重PCR法

多重PCR是在傳統(tǒng)PCR基礎(chǔ)上發(fā)展出的一種檢測(cè)方法，其在同一PCR反應(yīng)體系里加入2對(duì)以上引物，從而可以同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)[32]。對(duì)于志賀菌耐藥基因，可同時(shí)設(shè)計(jì)針對(duì)多個(gè)基因的特異性引物，選擇合適的退火溫度，實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)基因的克隆和鑒定。王倩等[33]使用多重PCR方法，在退火溫度為57.5℃的條件下，可同時(shí)擴(kuò)增出gyrA、parC和毒力致病性基因ipaH用于下一步測(cè)序與鑒定。Zhang等[34]使用多重PCR的方法對(duì)北京、成都和烏魯木齊等地收集的志賀菌菌株β-內(nèi)酰胺酶類抗菌藥物耐藥性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)可同時(shí)對(duì)多種ESBLs基因進(jìn)行檢測(cè)。多重PCR較傳統(tǒng)PCR方法耗時(shí)較短，但由于引物之間的相互作用，對(duì)多重PCR的擴(kuò)增條件要求較高，需要反復(fù)優(yōu)化調(diào)整復(fù)性條件和引物濃度以增加擴(kuò)增效率。

3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（qPCR）

qPCR是在PCR體系中加入熒光基團(tuán)，擴(kuò)增過(guò)程中通過(guò)熒光信號(hào)累積對(duì)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)的方法。根據(jù)RT-qPCR的化學(xué)發(fā)光原理可分為探針類方法（TaqMan探針和分子信標(biāo)）和非探針類方法（SYBR GreenⅠ等熒光染料）。針對(duì)志賀菌的QRDR區(qū)gyrA和parC突變，可設(shè)計(jì)特異性TaqMan MGB探針對(duì)突變堿基進(jìn)行檢測(cè)。Kim等[35]開(kāi)發(fā)了針對(duì)gyrA基因Ser83和Asp87突變與parC基因Ser80和Agr87突變的TaqMan探針，使用qPCR法可檢測(cè)是否存在堿基突變，qPCR法的檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果相同。對(duì)于質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因，qPCR法可定量檢測(cè)耐藥基因及轉(zhuǎn)錄水平。Zhang等[11]對(duì)來(lái)自中國(guó)的392株志賀菌分離株通過(guò)qPCR法進(jìn)行耐藥基因分析，檢測(cè)到55%（44/80）的阿奇霉素低敏志賀菌具有mphA基因，未發(fā)現(xiàn)與阿奇霉素耐藥性相關(guān)的外膜蛋白基因ompA和ompW的過(guò)表達(dá)。相較常規(guī)PCR，qPCR法具有對(duì)待測(cè)基因進(jìn)行快速及精確相對(duì)定量檢測(cè)的特點(diǎn)，并能通過(guò)定量mRNA來(lái)分析待測(cè)基因的表達(dá)水平。

4.基因芯片法

基因芯片法又稱DNA微陣列雜交法，主要基于固體基質(zhì)（載玻片或硅薄膜）上的二維陣列以高通量地定性或定量測(cè)定DNA分子，其探針由數(shù)kb或幾十個(gè)特定核苷酸構(gòu)成，DNA微陣列技術(shù)現(xiàn)主要應(yīng)用分析DNA突變及多態(tài)性、檢測(cè)基因表達(dá)差異、發(fā)現(xiàn)新的致病基因等多個(gè)研究領(lǐng)域[36]。Taitt等[37]開(kāi)發(fā)了ARDM v.2 DNA芯片，該芯片可識(shí)別針對(duì)17種抗菌藥物的236個(gè)耐藥性基因，每個(gè)基因在芯片上包含4或5對(duì)重復(fù)探針，將芯片與生物素化的DNA片段雜交后，使用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素來(lái)產(chǎn)生信號(hào)。Taitt等[38]通過(guò)該芯片對(duì)多種腹瀉致病菌的耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，在2株志賀菌中發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒介導(dǎo)的qnrS基因，同時(shí)檢測(cè)到頭孢耐藥志賀菌株中的blaCTX-M-9和blaCTX-M-1基因。

5.全基因組測(cè)序法（WGS）

WGS可以快速全面地找出個(gè)體基因組上的所有突變，在定義耐藥基因型和預(yù)測(cè)耐藥表型具有很高的靈敏度和特異性。通過(guò)WGS進(jìn)行生物信息學(xué)分析構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，可對(duì)細(xì)菌基因組學(xué)與傳播模式進(jìn)行精確研究。通過(guò)WGS識(shí)別耐藥基因常采用二代測(cè)序方法，形成短讀序列片段以后，使用定制算法將片段映射到參考序列以確定是否存在耐藥基因，耐藥基因的參考序列可在CARD或NCBI等數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得[39]。Baker等[17]通過(guò)全基因組測(cè)序的方法，對(duì)福氏志賀菌3a型進(jìn)行譜系與耐藥基因研究，所有的分離株均攜帶一個(gè)共同的多藥耐藥元件（SRL-MDRE），而MSM相關(guān)譜系中發(fā)現(xiàn)了額外的耐藥相關(guān)可移動(dòng)遺傳元件，編碼了對(duì)其他抗菌藥物的耐藥性。Mook等[40]對(duì)英國(guó)發(fā)現(xiàn)的志賀菌分離株183660進(jìn)行WGS后，發(fā)現(xiàn)在p183660質(zhì)粒上存在超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBL）基因TEM-1和CTX-M，使該分離株獲得對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的高水平耐藥性。

三、展望

志賀菌對(duì)各種抗菌藥物的耐藥性不斷增加，對(duì)其耐藥基因與突變位點(diǎn)的研究與檢測(cè)尤為重要，根據(jù)目前已知的耐藥基因?qū)χ举R菌進(jìn)行檢測(cè)，有助于對(duì)志賀菌感染的有效治療提供依據(jù)。在耐藥基因檢測(cè)方面，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件選擇PCR法、DNA微陣列技術(shù)和全基因組測(cè)序法，在檢測(cè)志賀菌感染同時(shí)進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)。在未來(lái)，隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷更新，有望研究出更多低成本、操作簡(jiǎn)便的耐藥基因檢測(cè)技術(shù)，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對(duì)志賀菌的有效防控。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突