陳換換，宋超杰，唐 聰(綜述)，張小莉(審校)

1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)是一種慢性自身免疫性疾病，由自身抗原導(dǎo)致產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷。T1DM是兒童糖尿病的主要類型，根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟(International Diabetes Federation,IDF)最新統(tǒng)計(jì)[1]，2019年全球約有110萬20歲以下青少年和兒童患有T1DM。T1DM有許多并發(fā)癥，如糖尿病酮癥酸中毒、視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病等。其具體發(fā)病機(jī)制尚未完全了解，可能的解釋是遺傳易感性與環(huán)境因素的結(jié)合引發(fā)自身免疫反應(yīng)，最終導(dǎo)致T1DM功能性β細(xì)胞量減少和高血糖癥。先天性免疫和適應(yīng)性免疫都參與了T1DM的發(fā)生發(fā)展，Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是先天性免疫的重要參與者，TLRs的主要功能是誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)并建立適應(yīng)性免疫,能參與自身免疫性疾病[2]。T1DM的典型病理變化是胰島炎，目前TLRs在T1DM自身免疫誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞損傷的作用已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注和研究，本文就TLRs介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程與T1DM發(fā)生發(fā)展過程中胰島β細(xì)胞損傷進(jìn)行綜述，旨在為T1DM的防治提供理論依據(jù)。

1 T1DM炎癥反應(yīng)與胰島β細(xì)胞損傷

T1DM的病理特征是胰島炎癥，身體的免疫系統(tǒng)攻擊胰島β細(xì)胞，在胰島周圍和胰島實(shí)質(zhì)內(nèi)觀察到炎癥細(xì)胞，導(dǎo)致胰島β細(xì)胞的破壞。有研究[3]表明，T1DM中首先由β細(xì)胞觸發(fā)的反應(yīng)是抗病毒反應(yīng)、模式識(shí)別受體激活、蛋白修飾和主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類抗原提呈。在胰腺炎的晚期階段，T細(xì)胞的募集和激活以及β細(xì)胞試圖通過激活抗炎通路(即IL-10、IL-4/13)和免疫檢查點(diǎn)蛋白來保護(hù)自身占主導(dǎo)地位。Bulek等[4]研究表明CD8+T細(xì)胞通過自身反應(yīng)的T細(xì)胞受體1E6識(shí)別人類白細(xì)胞抗原HLA-A*0201限制性葡萄糖敏感胰島素原多肽，剛性的“鎖和鑰匙”結(jié)合支撐了1E6-HLA-A*0201-肽的相互作用，從而殺死T1DM患者的胰島β細(xì)胞。細(xì)胞因子是免疫和炎癥過程的重要調(diào)節(jié)劑，胰腺內(nèi)免疫細(xì)胞釋放的特定細(xì)胞因子如IL-1β和TNF-α通過直接引起β細(xì)胞損傷而促進(jìn)T1DM[5]。而且在最近發(fā)作的T1DM中，TNF-α水平與殘余胰島β細(xì)胞功能相關(guān)，并可作為疾病緩解和進(jìn)展的預(yù)后生物標(biāo)志物[6]。TLRs相關(guān)的先天免疫反應(yīng)可調(diào)節(jié)T細(xì)胞及相關(guān)炎癥因子，加劇T1DM的胰島β細(xì)胞損傷。例如，TLR9激活可通過增加IFN-α的水平，促進(jìn)CD8+T細(xì)胞激活從而促進(jìn)非肥胖型糖尿病(non-obese diabetic,NOD)小鼠胰島炎，有助于NOD小鼠糖尿病的自發(fā)發(fā)作[7]。

2 TLRs

2.1TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) TLRs是一種模式識(shí)別受體，在啟動(dòng)對(duì)微生物的固有免疫反應(yīng)以抵抗感染和維持體內(nèi)平衡方面起著至關(guān)重要的作用。目前，已在小鼠中鑒定出12種TLR(TLR1-TLR9和TLR11-TLR13)，在人類中鑒定出10種TLR(TLR1-TLR10)。其中TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10位于細(xì)胞表面，而TLR3、TLR7、TLR8和TLR9位于細(xì)胞內(nèi)體中。TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活將導(dǎo)致一系列下游信號(hào)事件，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子的激活，最終釋放各種促炎性細(xì)胞因子，趨化因子和干擾素并激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。TLRs家族的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方式主要有兩種:一種是髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)依賴型TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；另一種是誘導(dǎo)干擾素β的含TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TIR-domain-containing adapter inducing IFN-β，TRIF)依賴型信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。除TLR3外，所有TLRs均可激活MyD88依賴型途徑。TLR2和TLR4募集一個(gè)類似MyD88的銜接分子Mal，核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)二聚體通過非共價(jià)鍵的形式與其抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB)結(jié)合而分散在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，通過IκB激酶復(fù)合體激活NF-κB。然后，NF-κB易位至細(xì)胞核，轉(zhuǎn)錄、產(chǎn)生和釋放炎性細(xì)胞因子(如TNF-α、IL-1β和IL-6)。TLR3通過TRIF激活干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)。IRF3發(fā)生二聚化并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，并與干擾素刺激應(yīng)答元件(interferon-stimulated response element，ISRE)基序結(jié)合，促進(jìn)IFN-α/β的表達(dá)。TLR4還可以利用TRIF相關(guān)接頭分子(TRIF-related adaptor molecule，TRAM)激活NF-κB和IRF3。另一方面，TLR9也可以激活I(lǐng)RF3相關(guān)分子，如IRF7，從而導(dǎo)致IFN-α/β的表達(dá)。

2.2TLRs與炎癥反應(yīng) TLRs的主要功能是誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，TLRs激活組織駐留的巨噬細(xì)胞以產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子，可協(xié)調(diào)局部和全身性炎癥反應(yīng)。通過細(xì)胞因子激活周圍的細(xì)胞以產(chǎn)生趨化因子或黏附分子，從而將數(shù)個(gè)炎癥細(xì)胞募集到炎癥部位。招募的巨噬細(xì)胞或中性粒細(xì)胞被激活，并通過內(nèi)化模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor,PRR)攝入入侵的病原體。之后，這些細(xì)胞通過產(chǎn)生一氧化氮、活性氧或防御素來殺死病原體[8-9]。

3 TLRs與T1DM

TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在T1DM的發(fā)展中起關(guān)鍵作用，T1DM動(dòng)物模型和人體研究表明，胰島細(xì)胞(包括分泌胰島素的β細(xì)胞)能表達(dá)所有的TLRs，并且它們與病原體衍生的配體的結(jié)合顯著增強(qiáng)了促炎性趨化因子的產(chǎn)生。近年來，TLR2-4和TLR9與T1DM的關(guān)系研究較多，引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，為T1DM的治療尋找新的突破點(diǎn)。

3.1TLR2與T1DM TLR2可以識(shí)別多種微生物來源的成分和某些內(nèi)源性配體。TLR2的配體包括細(xì)菌的脂蛋白、脂多肽、脂壁酸、阿拉伯甘聚糖及酵母多糖等。有研究[10]表明，TLR2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在自身免疫性疾病中起重要作用，與對(duì)照組相比，T1DM患者TLR2在單核細(xì)胞亞群中表達(dá)異質(zhì)性及其在經(jīng)典單核細(xì)胞中明顯上調(diào)，且與T1DM的持續(xù)時(shí)間呈正相關(guān)。鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠隨著自身病程的進(jìn)展，免疫功能狀態(tài)發(fā)生改變[11]，與野生型(wild type,WT)小鼠相比，鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的T1DM小鼠中巨噬細(xì)胞TLR2表達(dá)和MyD88依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增加，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)[12]。有研究[13]表明，凋亡的β細(xì)胞通過TLR2依賴性抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cell,APC)的激活以及炎性細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，從而引發(fā)自身反應(yīng)性T細(xì)胞，促進(jìn)T1DM發(fā)生發(fā)展。在TLR2缺陷的NOD小鼠中，致糖尿病性T細(xì)胞的啟動(dòng)和自身免疫性糖尿病的發(fā)展受到顯著抑制，這表明TLR2對(duì)于調(diào)節(jié)T細(xì)胞反應(yīng)和疾病的發(fā)展起重要作用[14]。這些研究表明，β細(xì)胞損傷及其通過TLR2的轉(zhuǎn)導(dǎo)可能是刺激APC和自身免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致糖尿病臨床發(fā)作的重要事件。

3.2TLR3與T1DM TLR3基因編碼識(shí)別雙鏈核糖核酸(double-stranded RNA,dsRNA)的PRR家族的內(nèi)質(zhì)受體，在病毒感染觸發(fā)的先天免疫應(yīng)答中起重要作用。與其他TLR配體不同，TLR3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通過不依賴MyD88的途徑發(fā)生。研究[15]表明，TLR3在病毒誘導(dǎo)的T1DM中可能發(fā)揮作用。TLR3對(duì)雌性NOD小鼠中柯薩奇病毒B4(Coxsackievirus B4,CVB4)誘導(dǎo)的T細(xì)胞介導(dǎo)的胰島炎至關(guān)重要，在CVB4感染的WT NOD小鼠胰島中T細(xì)胞豐富，β細(xì)胞損傷嚴(yán)重，加速病毒誘導(dǎo)的T1DM進(jìn)程。TLR3是已知的識(shí)別病毒成分并誘導(dǎo)1型干擾素用于抗病毒防御的基因，暴發(fā)型T1DM發(fā)病后不久胰腺中表達(dá)多種TLR，尤其是TLR3和腸道病毒RNA的表達(dá)明顯上調(diào)[16]。胞內(nèi)和胞外dsRNA均可與TLR3結(jié)合，觸發(fā)促炎細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，通過激活NF-κB和IRF-3導(dǎo)致β細(xì)胞凋亡[17]。研究[18]表明由腸病毒感染觸發(fā)的暴發(fā)型T1DM中，滲透到胰島的單核細(xì)胞中TLR3的表達(dá)增加，β細(xì)胞中的維甲酸誘導(dǎo)型基因I(retinoic acid-induced gene I,RIG-I)樣受體和黑素瘤分化相關(guān)基因5(melanoma differentiation-associated gene 5,MDA5)表達(dá)強(qiáng)烈上調(diào)，胰島Treg細(xì)胞表達(dá)缺失，IFN-γ誘導(dǎo)因子IL-18廣泛表達(dá)，先天免疫力與適應(yīng)性免疫力一起加速了暴發(fā)性T1DM患者的β細(xì)胞死亡。以上研究表明，TLR3在病毒感染觸發(fā)的T1DM中起重要作用。

3.3TLR4與T1DM TLR4多在單核細(xì)胞中廣泛表達(dá)，可以結(jié)合革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),LPS是革蘭陰性細(xì)菌外膜的重要結(jié)構(gòu)成分，并且已成為細(xì)菌研究最多的刺激成分之一。LPS與TLR4結(jié)合，通過MyD88依賴性和TRIF依賴性途徑啟動(dòng)免疫應(yīng)答的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，以誘導(dǎo)1型干擾素和促炎性細(xì)胞因子(如IL-1β和TNF-α)的產(chǎn)生。TLR4參與了自身免疫性疾病，例如小鼠關(guān)節(jié)炎模型和實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎。最近，TLR4也被證實(shí)在T1DM的發(fā)展過程中參與了促炎狀態(tài)和胰島內(nèi)β細(xì)胞的自身免疫破壞。越來越多的證據(jù)表明，在T1DM患者和動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了TLR信號(hào)失調(diào)。臨床研究[19]發(fā)現(xiàn)，與健康個(gè)體比，T1DM患者TLR4基因表達(dá)水平顯著上調(diào)。TLR4的轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)NF-κB信號(hào)的活性并增加促炎細(xì)胞因子的分泌。Devaraj等[20]研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，T1DM單核細(xì)胞TLR4表面表達(dá)及mRNA均顯著增加，并且TLR4的下游靶標(biāo)MyD88、NF-κB的表達(dá)顯著上調(diào)，炎癥細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的釋放增加且與TLR4的表達(dá)相關(guān)?，F(xiàn)有研究[21]顯示，TLR4是β細(xì)胞的主要受體，在自身免疫性糖尿病的發(fā)展過程中，通過TLR4信號(hào)通路選擇性地?fù)p傷β細(xì)胞而不是α細(xì)胞。以上研究表明，TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與T1DM胰島β細(xì)胞的損傷有關(guān)。

3.4TLR9與T1DM TLR9能識(shí)別微生物核酸，特別是CpG基序，激活B淋巴細(xì)胞和APC的免疫刺激特性，并且信號(hào)通過MyD88途徑發(fā)生，進(jìn)而激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。TLR9表達(dá)于不同的免疫細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DC)、B細(xì)胞和T細(xì)胞，但高度免疫表達(dá)于漿細(xì)胞樣DC(plasmacytoid dendritic cells,pDC)。目前，越來越多的證據(jù)表明TLR9在T1DM的發(fā)生發(fā)展中起作用。鄭超等[22]發(fā)現(xiàn)人工合成的病毒模擬物未甲基化寡聚脫氧核苷酸CpG-ODN可通過激活天然免疫的TLR9/MyD88通路引起系統(tǒng)性或局部炎癥，繼而影響到獲得性免疫中Th1/Th2的平衡，破壞胰島細(xì)胞，最終誘導(dǎo)T1DM發(fā)病。TLR9激活pDC并增加IFN-α的分泌，進(jìn)一步損傷胰腺β細(xì)胞，導(dǎo)致NOD小鼠糖尿病早期發(fā)生發(fā)展[23]。目前研究證明TLR9-/-NOD小鼠受到顯著保護(hù)，免受T1DM的侵害。CD73在糖尿病保護(hù)中起著重要作用，在TLR9缺失的情況下，NY8.3 NOD雄性小鼠的糖耐量顯著高于WT小鼠，顯著增強(qiáng)外周淋巴組織中CD73+T細(xì)胞的免疫抑制功能，NOD小鼠的β細(xì)胞功能得到了改善[24]。僅次于pDC，TLR9在B細(xì)胞中也高度表達(dá)。TLR9信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的B細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的改變有助于T1DM的發(fā)病機(jī)理[25]。糖尿病患者B細(xì)胞中TLR功能的改變可通過兩種機(jī)制增加炎癥：促炎性IL-8升高和抗炎性IL-10產(chǎn)生不足[26]。TLR9缺陷型B細(xì)胞對(duì)先天免疫和適應(yīng)性免疫刺激均反應(yīng)低下，Sha等[27]研究發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞中的TLR9通過改變產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞的頻率和功能，導(dǎo)致NOD小鼠免受T1DM的攻擊。因此，TLR9可能成為人類T1DM免疫治療干預(yù)的重要有效靶點(diǎn)。作為先天免疫的重要組成部分，TLRs是連接先天免疫和適應(yīng)性免疫的重要紐扣。胰島細(xì)胞能表達(dá)TLR2-4、TLR9，被認(rèn)為與包括T1DM在內(nèi)的自身免疫疾病的發(fā)病機(jī)理有關(guān)，NOD小鼠和大鼠模型研究以及T1DM患者中TLRs表達(dá)研究的結(jié)果均支持該觀點(diǎn)，但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

4 T1DM發(fā)生過程中的腸道菌群參與TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

腸道微生物除了能維持胃腸道的完整性和功能外，其結(jié)構(gòu)和數(shù)目的改變還可刺激TLRs，促發(fā)其下游通路，發(fā)揮促炎作用，促進(jìn)各種炎癥的發(fā)生。越來越多的研究表明，腸道菌群參與T1DM的發(fā)生發(fā)展過程，T1DM中存在益生菌豐度下降、有害菌豐度上升的現(xiàn)象。Henschel等[28]通過調(diào)節(jié)胃腸道微生物區(qū)系，例如增加厚壁菌/擬桿菌的比例，增加乳酸菌和丁酸產(chǎn)生菌的相對(duì)豐度，使與自身免疫性糖尿病易感性相關(guān)的TLR4活性水平、細(xì)胞因子水平、促炎性胰島轉(zhuǎn)錄組和β細(xì)胞趨化因子表達(dá)正?；档蚑1DM發(fā)病率。TRIF是TLR3和TLR4信號(hào)下游的重要銜接子蛋白，有研究數(shù)據(jù)表明，TRIF缺乏可通過改變腸道菌群(變形桿菌的相對(duì)豐度顯著降低)和降低免疫細(xì)胞的促炎表型和功能來保護(hù)NOD小鼠免于發(fā)展為糖尿病[29]。腸道菌群DNA通過TLR9參與腸道動(dòng)態(tài)平衡，Hall等[30]研究表明TLR9-/-小鼠顯示腸道效應(yīng)位點(diǎn)內(nèi)CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的頻率增加，而產(chǎn)生IL-17和IFN-γ的效應(yīng)T(Teff)細(xì)胞減少，腸道菌群DNA在體外限制了固有層DC誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化。上述研究表明T1DM發(fā)生發(fā)展過程中改變腸道菌群可通過TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)影響疾病的發(fā)展進(jìn)程，為干預(yù)腸道菌群預(yù)防或逆轉(zhuǎn)T1DM提供有前途的治療策略。

5 TLRs治療T1DM的相關(guān)進(jìn)展

TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程為T1DM免疫治療提供了多個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。寡聚脫氧核苷酸和氯喹是TLR9的拮抗劑，在NOD小鼠模型中使用TLR9拮抗劑寡聚脫氧核苷酸或氯喹抑制了骨髓衍生的DC激活和CD8+T細(xì)胞的激活，延遲NOD小鼠自身免疫性糖尿病[7]。同時(shí)氯喹阻斷TLR9可改善雄性和雌性NOD小鼠的β細(xì)胞功能，并顯著減輕其胰島素炎癥[24]。高遷移率族蛋白B1(high-mobility group-B1,HMGB1)是一種核內(nèi)蛋白，與組蛋白結(jié)合，在炎癥期間幫助“打開”核小體，使基因啟動(dòng)子與促炎轉(zhuǎn)錄因子如INF-β和RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。此外，HMGB1在組織間隙和血漿中釋放可通過與TLRs結(jié)合起到促炎細(xì)胞因子的作用。Dandona等[31]通過抑制HMGB1可抑制促炎轉(zhuǎn)錄因子的作用和促炎基因的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)抑制HMGB1的血漿濃度可通過TLR2和TLR4抑制其促炎細(xì)胞因子作用。a1-抗胰蛋白酶(a1-antitrypsin,AAT)是一種蛋白酶抑制劑，通常由肝細(xì)胞和單核吞噬細(xì)胞產(chǎn)生，能抑制感染和炎癥。研究[32]表明AAT可抑制TLR2和TLR4的表面表達(dá)，下調(diào)單核細(xì)胞和髓系樹突狀細(xì)胞中TLRs誘導(dǎo)的促炎反應(yīng)，降低血清IL-1β水平，改善部分近期發(fā)作T1DM患者的胰島β細(xì)胞功能。

6 結(jié)語

目前T1DM的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，但隨著發(fā)生率越來越高，有效的預(yù)防以及尋找治療靶點(diǎn)已經(jīng)成為當(dāng)下研究的熱點(diǎn)。臨床上通常給予胰島素來調(diào)節(jié)血糖，但是外源提供的胰島素不能像內(nèi)源性胰島素一樣精確地調(diào)節(jié)血糖。目前胰島移植已被認(rèn)為是一種有前途的替代治療方法，但需要持續(xù)免疫抑制，加上大多數(shù)患者由于自身免疫/同種異體免疫排斥，代謝應(yīng)激和免疫抑制的細(xì)胞毒性作用而導(dǎo)致胰島移植功能逐漸喪失。TLRs家族是一類古老的受體家族，在固有免疫中發(fā)揮重要作用，同時(shí)與適應(yīng)性免疫和某些自身免疫性疾病的致病機(jī)制密切相關(guān)。本文綜述了TLRs在T1DM胰島β細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制，并指出TLRs的表達(dá)也可能受腸道微生物的影響，進(jìn)而促進(jìn)T1DM的發(fā)生發(fā)展。目前隨著TLRs在T1DM中的不斷挖掘，極有可能成為T1DM發(fā)生機(jī)制的一個(gè)突破口，為研發(fā)防治T1DM的新藥物提供理論依據(jù)。