茅峰 劉建文 陳靜云 姜宏

椎間盤(pán)退變(IDD)是各種脊柱退行性疾病的病理基礎(chǔ)，包括椎間盤(pán)突出癥，椎體滑脫，椎管狹窄等，也是導(dǎo)致慢性腰背痛(LBP)的一個(gè)重要原因[1-2]。一般認(rèn)為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的丟失，椎間盤(pán)細(xì)胞減少和炎癥反應(yīng)在椎間盤(pán)退變中起重要作用[3-4]。髓核細(xì)胞的減少是導(dǎo)致椎間盤(pán)退變的直接原因，隨著髓核(NP)細(xì)胞過(guò)度凋亡，細(xì)胞外基質(zhì)合成減弱，導(dǎo)致正常椎間盤(pán)結(jié)構(gòu)和生理功能的破壞，進(jìn)而加重椎間盤(pán)退變[5-7]。近年來(lái)通過(guò)誘導(dǎo)髓核細(xì)胞自噬來(lái)拮抗凋亡，延緩椎間盤(pán)退變，逐漸成為熱點(diǎn)[8-9]。本文綜述了最近幾年，椎間盤(pán)組織中凋亡及自噬的研究，重點(diǎn)指出兩者介導(dǎo)椎間盤(pán)退變過(guò)程中分子機(jī)制及相互串?dāng)_機(jī)制，為治療椎間盤(pán)退變提供新思路。

1 凋亡與椎間盤(pán)退變

1.1 凋亡分子機(jī)制

凋亡包含兩個(gè)核心途徑——死亡受體介導(dǎo)(外源性)途徑和線粒體依賴(lài)性(內(nèi)源性)途徑。外源性途徑是由腫瘤壞死因子受體(TNFRs)、TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體受體(TRAILRs)和死亡受體(Fas等)激活引發(fā)的[10-11]。線粒體依賴(lài)性的內(nèi)源性途徑激活以線粒體外膜通透性(MOMP)為標(biāo)志[12]。

1.2 凋亡與椎間盤(pán)變性

髓核細(xì)胞過(guò)量的死亡導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)生成減少，這是椎間盤(pán)變性最明顯的生物學(xué)變化。此外，在椎間盤(pán)退變期間，促炎因子在髓核細(xì)胞中高表達(dá)，這些病理變化加劇了機(jī)體脊柱原有結(jié)構(gòu)破壞和生物力學(xué)變化[13-15]。內(nèi)源性和外源性的凋亡途徑均在髓核細(xì)胞變性中起關(guān)鍵作用，有證據(jù)表明在凋亡的內(nèi)在途徑中機(jī)體主要通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2，Caspase-3，膠原蛋白和蛋白聚糖的水平參來(lái)與髓核細(xì)胞變性。在血清饑餓的情況下，髓核細(xì)胞過(guò)表達(dá)Bcl-2，細(xì)胞凋亡減少，Caspase-3 水平降低，Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖的mRNA水平升高[16]。線粒體功能障礙是ROS產(chǎn)生的主要原因，它的特征是線粒體質(zhì)量減少，呼吸鏈缺陷，線粒體膜通透性增加以及線粒體膜電位的降低，功能異常的線粒體會(huì)泄漏更多的電子以產(chǎn)生ROS。另一方面，ROS累積到一定程度，會(huì)以線粒體為標(biāo)靶發(fā)起攻擊，致使線粒體DNA和呼吸酶遭受氧化性損傷，進(jìn)一步加重線粒體功能障礙。用H2O2處理的髓核細(xì)胞凋亡增加，檢測(cè)到蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的mRNA水平降低[17-18]。相反氧化還原輔助因子輔酶PQQ，可清除細(xì)胞中積聚的活性氧(ROS)并抑制細(xì)胞凋亡[19]。不僅如此，存在PQQ的情況下，盡管髓核細(xì)胞處于誘導(dǎo)凋亡環(huán)境中，仍可維持一定的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生。在研究炎癥誘導(dǎo)椎間盤(pán)退變發(fā)病機(jī)理過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)促炎性細(xì)胞因子(如IL-1β)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)下降，加入抗氧化劑后，IL-1β誘導(dǎo)的椎間盤(pán)退變明顯受到了抑制[20-21]。

在椎間盤(pán)變性過(guò)程中，髓核細(xì)胞還可以通過(guò)調(diào)節(jié)Fas等死亡受體介導(dǎo)凋亡的發(fā)生。髓核細(xì)胞受到刺激后中，較低水平的miR-155即可以通過(guò)表達(dá)具有死亡域的Fas相關(guān)蛋白來(lái)靶向募集Caspase-3，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡。如長(zhǎng)非編碼RNA GAS5通過(guò)該途徑介導(dǎo)Bcl-2下調(diào)和Caspase-3上調(diào)促進(jìn)椎間盤(pán)髓核細(xì)胞的凋亡。Qiu等[22]發(fā)現(xiàn)RIPK1的過(guò)表達(dá)可抑制TNF和Caspase-3活性，具有阻止或延緩椎間盤(pán)疾病變性潛力，因此可開(kāi)發(fā)出毒性低的RIPK1來(lái)治療或延緩椎間盤(pán)退化。

2 自噬與椎間盤(pán)退變

2.1 自噬分子機(jī)制

自噬過(guò)程作為細(xì)胞生存機(jī)制受到AuTophaGy相關(guān)(ATG)蛋白嚴(yán)格調(diào)控，已發(fā)現(xiàn)的ATG基因編碼蛋白中，ATG5是目前被認(rèn)為對(duì)于自噬囊泡的形成是必不可少的，敲除或靶向抑制ATG5會(huì)導(dǎo)致自噬水平的下調(diào)或完全抑制[23-24]。雷帕霉素(mTOR)是一種機(jī)體必需的絲氨酸/蘇氨酸激酶，是PI3K/Akt/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)途徑的下游介質(zhì)，負(fù)調(diào)控自噬，細(xì)胞應(yīng)激后，mTORC1去磷酸化的導(dǎo)致自噬激活[25-28]。AMP激活蛋白激酶(AMPK)是細(xì)胞面對(duì)能量供應(yīng)缺失的中央調(diào)節(jié)器，AMPK的核心是通過(guò)調(diào)控mTORC1活性來(lái)影響自噬過(guò)程[29-30]。不僅如此，AMPK還可以通過(guò)增加ATG表達(dá)，提高自噬體膜結(jié)構(gòu)的募集[31]。Beclin-1基因同樣對(duì)于自噬至關(guān)重要，是延伸自噬體的脂質(zhì)膜，促進(jìn)被消除底物的募集和自噬體的成熟所必需的[32-33]。

2.2 自噬與椎間盤(pán)變性

自噬作為細(xì)胞Ⅱ型程序性死亡機(jī)制存在于各個(gè)組織和器官的發(fā)育過(guò)程中，低水平的自噬在非退行性大鼠的髓核細(xì)胞中被觀察到，驗(yàn)證了自噬和椎間盤(pán)髓核細(xì)胞退變存在聯(lián)系[34]。Zhang等[35]發(fā)現(xiàn)自噬可能有助于髓核細(xì)胞維持外基質(zhì)(ECM)的代謝平衡。也有報(bào)告指出mRNA-129-5P的甲基化通過(guò)靶向Beclin-1調(diào)節(jié)椎間盤(pán)退變來(lái)調(diào)節(jié)髓核細(xì)胞自噬，阻止了髓核細(xì)胞的凋亡[36]。Shen等[37]證實(shí)，IL-1β本身不會(huì)誘導(dǎo)纖維環(huán)(AF)細(xì)胞自噬，但當(dāng)血清剝奪誘導(dǎo)的自噬作用明顯增強(qiáng)，凋亡細(xì)胞減少，證明了細(xì)胞的自噬作用可保護(hù)部分AF細(xì)胞免受凋亡。Zheng等[38]使用亞精胺促進(jìn)髓核自噬作為對(duì)抗細(xì)胞凋亡的保護(hù)機(jī)制成功的改善椎間盤(pán)退變。在根據(jù)MRI確定的人類(lèi)變性椎間盤(pán)的等級(jí)，檢查了重要的自噬通量標(biāo)志物L(fēng)C3和p62的表達(dá)。LC3-Ⅱ在Pfirrmann等級(jí)Ⅲ中表達(dá)最高，而其他等級(jí)的表達(dá)水平則明顯更低，而p62與椎間盤(pán)退變級(jí)別同向升高，直至Ⅴ級(jí)，從這些結(jié)果中我們可以看出，隨著Pfirrmann等級(jí)的升高自噬反應(yīng)逐漸減弱，甚至自噬功能障礙[39]。Miyazaki等[40]通過(guò)減少椎間盤(pán)髓核細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)供給誘導(dǎo)凋亡，而rhSIRT1阻止了這種凋亡并誘導(dǎo)了自噬，用抑制劑阻斷自噬后，觀測(cè)到細(xì)胞凋亡顯著增加，該實(shí)驗(yàn)證明rhSIRT1通過(guò)誘導(dǎo)自噬高表達(dá)而表現(xiàn)出抗凋亡作用。髓核細(xì)胞在遭受外界壓力刺激下，可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬水平提高細(xì)胞存活率，從而改善椎間盤(pán)退變。然而在糖尿病患者的椎間盤(pán)退變實(shí)驗(yàn)中，在高葡萄糖濃度下，髓核、AF細(xì)胞自噬標(biāo)記物表達(dá)均隨著劑量和時(shí)間而增加，證實(shí)自噬與成年糖尿病患者椎間盤(pán)退變的潛存在正相關(guān)，預(yù)防自噬可被認(rèn)為是延緩成人糖尿病患者椎間盤(pán)變性的治療方案[41]。所以，自噬可能擁有決定細(xì)胞命運(yùn)的雙重作用，取決于響應(yīng)外部刺激時(shí)不同細(xì)胞內(nèi)途徑的激活和基因表達(dá)譜的特定變化。

3 自噬與凋亡在椎間盤(pán)退變中共同的分子機(jī)制

3.1 氧化應(yīng)激

ROS對(duì)髓核細(xì)胞的自噬與凋亡均有促進(jìn)作用。隨著椎間盤(pán)退變進(jìn)展，髓核細(xì)胞中線粒體質(zhì)量減少，線粒體呼吸增強(qiáng)，退化性椎間盤(pán)中過(guò)多的產(chǎn)生過(guò)多的ROS，使ROS在椎間盤(pán)細(xì)胞中生成與清除關(guān)系失衡，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生。ROS已經(jīng)被確定為在體外對(duì)髓核細(xì)胞的有效促細(xì)胞凋亡因子[43]?；谶@些發(fā)現(xiàn)，抗氧化可以作為防止椎間盤(pán)細(xì)胞凋亡，增加椎間盤(pán)中細(xì)胞存活潛在措施。不僅如此，椎間盤(pán)細(xì)胞自噬過(guò)程同樣有ROS參與，已發(fā)現(xiàn)H2O2刺激大鼠髓核細(xì)胞通過(guò)ERK/mTOR信號(hào)通路激發(fā)下游效應(yīng)器進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的自噬。血清剝奪同樣引起的細(xì)胞中產(chǎn)生ROS，通過(guò)AMPK/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)的自噬[44]。Bai等[45]認(rèn)為自噬可幫助椎間盤(pán)細(xì)胞清除過(guò)量ROS以及受損的細(xì)胞器等，減少髓核細(xì)胞凋亡，從而使椎間盤(pán)細(xì)胞在一定程度下氧化損傷中存活。然而，過(guò)多的ROS產(chǎn)生導(dǎo)致自噬的過(guò)度激活，可能造成的椎間盤(pán)細(xì)胞自噬性死亡，加重椎間盤(pán)退變的進(jìn)程。

3.2 胱天蛋白酶

胱天蛋白酶對(duì)細(xì)胞自噬及凋亡均有調(diào)節(jié)作用，其作為細(xì)胞中的非活性前體存在，通過(guò)寡聚，調(diào)節(jié)前結(jié)構(gòu)域的裂解或與內(nèi)源性抑制劑的解離而被激活。胱天蛋白酶識(shí)別并切割多種ATG，導(dǎo)致自體吞噬功能的廢除，有利于體內(nèi)平衡偏向于凋亡[46-49]。然而，胱天蛋白酶介導(dǎo)的ATG的裂解并不總是沒(méi)有活性的產(chǎn)物，已經(jīng)顯示了幾種ATG片段具有新的活性，這些具有活性的新片段以多種方式影響凋亡和自噬，所以胱天蛋白酶也存在對(duì)自噬有促進(jìn)作用的可能[50-51]。已發(fā)現(xiàn)Caspase-1可能引起的LC3和Beclin-1的上調(diào)激活自噬[52]。Caspase-2控制線粒體ROS水平過(guò)防止ROS積累，導(dǎo)致mTORC的去磷酸化啟動(dòng)自噬。Caspase-3、6、8證明會(huì)切割A(yù)TG5和Beclin-1，其解離的Beclin-1片段具有促凋亡功能[53-55]。雖然胱天蛋白酶調(diào)節(jié)自噬的精確機(jī)制仍然未知，筆者認(rèn)為除非最初引起壓力的刺激力超過(guò)了閾值，否則大多數(shù)細(xì)胞在死亡之前將首先通過(guò)發(fā)自噬反應(yīng)來(lái)生存[56-57]。相反地，在過(guò)度自噬中，某些胱天蛋白酶可以通過(guò)降解ATG來(lái)充當(dāng)分子制動(dòng)器，以防止該過(guò)程達(dá)到無(wú)法恢復(fù)的地步，例如Caspass-8降解RIPK1，從而抑制自噬通量[58]?？傮w而言，由于胱天蛋白酶用對(duì)自噬的效應(yīng)似乎在很大程度上取決于微環(huán)境，因此需要進(jìn)一步的工作來(lái)描述椎間盤(pán)細(xì)胞面對(duì)外部刺激時(shí)自噬蛋白與凋亡蛋白之間的復(fù)雜關(guān)系。

3.3 Beclin-1基因

Beclin-1基因被證實(shí)與自噬基因Atg6同源，可以與Ⅲ型PI3K形成復(fù)合物，募集胞漿中自噬體膜形成所需結(jié)構(gòu)蛋白，并引導(dǎo)其他自噬相關(guān)蛋白結(jié)合于前自噬小體上，促進(jìn)自噬體成熟。Bcl-2和Bax是調(diào)控凋亡的主要蛋白，Beclin-1可以與抗凋亡蛋白Bcl-2直接結(jié)合形成新的聚合體，導(dǎo)致Beclin-1不能激活自噬[59]。促凋亡蛋白通過(guò)BH3結(jié)構(gòu)域與Bcl-2結(jié)合，從蛋白聚合物中釋放Beclin-1，DAPK磷酸化Beclin-1，JNK磷酸化Bcl-2，自噬過(guò)程被激活，所以抗凋亡蛋白Bcl-2過(guò)表達(dá)可抑制自噬[60]。在調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞(CSCs)的凋亡中抗凋亡蛋白Bcl-2起著關(guān)鍵作用，主要通過(guò)與Beclin-1的結(jié)合，從而阻止了后者與Ⅲ型PI3K結(jié)合在自噬中的相互作用。腫瘤干細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間暴露于Rottlerin中會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡(主要與抗凋亡蛋下調(diào)相關(guān))和自噬行為，Rottlerin誘導(dǎo)的自噬可導(dǎo)致腫瘤干細(xì)胞死亡即自噬性死亡[61]。另外凋亡抑制自噬可以通過(guò)Caspase-3等對(duì)Beclin-1剪切功能，形成短的失活蛋白，進(jìn)而自噬被抑制。因此，凋亡與自噬之間相互作關(guān)系，可以通過(guò)對(duì)Beclin-1基因的進(jìn)行調(diào)節(jié)，這主要取決于擁有BH3結(jié)構(gòu)域蛋白之間的爭(zhēng)奪以及部分Caspase關(guān)鍵蛋白的相關(guān)活性。

4 小結(jié)與展望

目前臨床上使用藥物和物理療法可緩解大部分椎間盤(pán)退變所致的癥狀，但仍有不少患者因盤(pán)源性疼痛接受手術(shù)治療。在過(guò)去的10 a中，大量研究報(bào)告使人們對(duì)自噬和凋亡途徑有了深刻的理解，這些結(jié)論都驗(yàn)證了自噬與凋亡之間存在相互串?dāng)_、緊密聯(lián)系，提高椎間盤(pán)細(xì)胞的自噬水平減少椎間盤(pán)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而預(yù)防椎間盤(pán)退變的提供新方向。但是過(guò)度自噬也引發(fā)椎間盤(pán)細(xì)胞自噬性死亡，導(dǎo)致椎間盤(pán)退變加重，如何尋求自噬與凋亡之間的平衡則極為重要[62]。隨著對(duì)椎間盤(pán)退變中自噬與凋亡機(jī)制研究的越發(fā)深入，期待能夠從分子水平理解椎間盤(pán)細(xì)胞的自噬與凋亡關(guān)系，從而為延緩椎間盤(pán)退變的發(fā)展及臨床治療提供更有效的手段。