張沁怡 楊美雪 張婷 程林潔 黎燁 張羽杉 李景虹 藍(lán)燦華 田寶玉 李欣

摘 要：從油菜中分離鑒定根內(nèi)生細(xì)菌菌株，檢測評估其促生、抑菌潛力和機(jī)制，為開發(fā)具有植物促生和病害防控的微生物肥料提供依據(jù)。以油菜為研究對象，通過分離純化和16S rRNA基因擴(kuò)增分離和鑒定油菜根內(nèi)生細(xì)菌，并進(jìn)一步通過平板法、酶活法以及抑菌試驗(yàn)等分析分離其木制纖維素降解能力、促生作用以及抑菌活性等益生特性及其機(jī)理。結(jié)果表明：根據(jù)細(xì)菌菌落形態(tài)、顏色和大小，挑取純化得到14株油菜根內(nèi)生細(xì)菌菌株。經(jīng)16S rRNA基因測序和鑒定分析，分別為假單胞菌、腸桿菌、芽孢桿菌、葡萄球菌和萊略特菌。在分離純化的14株內(nèi)生菌株中，除菌株Y-7、Y-8外都具有明顯的木聚糖酶活性，除菌株Y-1、Y-7、Y-8、Y-9、Y-10外都具有纖維素分解能力，進(jìn)一步對14株內(nèi)生菌株的植物益生作用進(jìn)行初步篩選和評價(jià)，得到產(chǎn)鐵載體菌株Y-2、Y-4、Y-6、Y-10、Y-11、Y-13、Y-14，具有穩(wěn)定固氮能力的固氮菌株Y-1、Y-2、Y-10、Y-13、Y-14。在拮抗內(nèi)生菌篩選中，得到拮抗大腸桿菌菌株Y-1、Y-6、Y-7、Y-8、Y-12，拮抗金黃色葡萄球菌菌株Y-3、Y-4，拮抗枯草芽孢桿菌菌株Y-1以及拮抗黑曲霉菌株Y-3、Y-4、Y-6、Y-9、Y-10、Y-14。大多數(shù)分離的油菜根內(nèi)生菌具有一定的木質(zhì)纖維素降解能力。分離的油菜根內(nèi)生菌具有廣泛而多樣性的植物益生特性，如促生長和抑菌活性，這些益生特性可能與其具有的產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)IAA以及固氮能力有關(guān)。結(jié)果表明油菜根內(nèi)生菌可以作為篩選和開發(fā)具有植物促生和病害防控作用的微生物菌劑的重要來源。

關(guān)鍵詞：油菜根內(nèi)生菌;16S rRNA基因;分子鑒定;植物益生作用

中圖分類號：S 476.1 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ??文章編號：0253-2301（2021）11-0033-11

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.11.006

Isolation and Identification of Endophytic Bacteria from the Roots of Brassica Napusand the Screening for the Probiotic Effects of Plants

ZHANG Qin-Yi， YANG Mei-Xue， ZHANG Ting， CHENG Lin-Jie， LI Ye， ZHANG Yu-shan，LI Jing-hong， LAN Can-hua， TIAN Bao-Yu， LI Xin*

（Fujian Key Laboratory in Universities of Cellular Stress Response and Metabolic Regulation/College

of Life Science， Fujian Normal University， Fuzhou， Fujian 350108， China）

Abstract： The endophytic bacterial strains were isolated and identified from the roots of Brassica napus， and their growth promotion and antibacterial potential and mechanism were detected and evaluated， thus to provide the basis for the development of microbial fertilizers with the abilities of plant growth promotion and disease prevention. By taking Brassica napus as the research object， the endophytic bacteria in the roots of Brassica napus were isolated and identified by the isolation and purification and 16S rRNA gene amplification. The probiotic characteristics of lignocellulose， such as the degradation ability， growth-promoting effect and antibacterial activity， and its mechanism were further analyzed by using the plate method， enzyme activity method and antibacterial test. The results showed that 14 strains of endophytic bacteria were selected and purified from the roots of Brassica napus according to the morphology， color and size of bacterial colonies. By 16S rRNA gene sequencing and identification & analysis， they were Pseudomonas， Escherichia coli， Bacillus， Staphylococcus and Lelliottia. Among the 14 isolated and purified endophytic strains， all the strains except Y-7 and Y-8 had significant xylanase activity， and all the strains except Y-1， Y-7， Y-8， Y-9 and Y-10 had the cellulose decomposition ability. The preliminary screening and evaluation on the plant probiotic effects of the 14 endophytic strains were further carried out， and the iron carrier-producing strains including strain Y-2， Y-4， Y-6， Y-10， Y-11， Y-13 and Y-14 were obtained， and the azotobacters including strain Y-1， Y-2， Y-10， Y-13 and Y-14 with stable nitrogen fixation ability were also obtained. In the screening of antagonistic endophytic bacteria， the strains Y-1， Y-6， Y-7， Y-8 and Y-12 against Escherichia coli， the strains Y-3 and Y-4 against Staphylococcus aureus， the strain Y-1 against Bacillus subtilis and the strains Y-3， Y-4， Y-6， Y-9， Y-10 and Y-14 against Aspergillus niger were obtained. Most of the endophytic bacteria isolated from the roots of Brassica napus had certain ability of lignocellulose degradation. The endophytic bacteria isolated from the roots of Brassica napus exhibited a wide range of probiotic properties such as growth promotion and bacteriostatic activity， which might be related to their abilities to produce iron carriers & IAA and the nitrogen fixation ability. The results showed that the endophytic bacteria from the roots of Brassica napus could be used as the important source for screening and developing the microbial agents with the abilities of plant growth promotion and disease prevention and control.

Key words： Endophytic bacteria from the roots of Brassica napus; 16S rRNA gene; Molecular identification; Probiotic effects of plants

油菜Brassica napus L.是世界上食用植物油和植物蛋白的主要來源之一，廣泛種植于中國、加拿大、印度及歐盟等各地，在國際農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易中占有極為重要的地位[1]。在化石資源儲量有限以及全球能源需求日益增加的狀況下，油菜作為新替代型可再生能源，是緩解我國石油儲備與供應(yīng)矛盾的一個(gè)重要替代方案[2-3]。油菜在生長發(fā)育過程中，容易受到根腫病、菌核病、白銹病、莖腐病、黑脛病等病蟲害、病菌引起的生物脅迫以及環(huán)境變化引起的非生物脅迫影響，使得產(chǎn)量下降，質(zhì)量不佳[4-6]。由于缺乏有效的抗性品種，加上我國土地資源有限，復(fù)種指數(shù)高，以及多種高毒高殘留化學(xué)農(nóng)藥的使用受到限制等原因，發(fā)展具有高效、環(huán)境友好和人畜安全的油菜病害生物防治策略迫在眉睫。植物內(nèi)生菌是指其生活史的一定階段或全部階段定殖于植物器官、組織內(nèi)部以及細(xì)胞間隙，但并不會引起明顯的外在感染癥狀的一類微生物，主要包括內(nèi)生真菌、內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生放線菌[7-11]。作為一類非常重要的微生物資源，植物內(nèi)生菌具有獨(dú)特的生理和代謝機(jī)制，可產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，幫助植物抵御病原微生物的侵害，如抗旱、抗霜凍、抗病蟲害及對病原體拮抗等，并可以通過產(chǎn)生吲哚乙酸、赤霉素以及細(xì)胞分裂素等植物激素來直接促進(jìn)宿主植物的生長、促進(jìn)宿主植物中有效活性成分的產(chǎn)生等。郎多勇等[12]對寧夏產(chǎn)甘草根莖葉中內(nèi)生菌分離純化得到內(nèi)生細(xì)菌100株，經(jīng)鑒定和進(jìn)一步研究表明對多種病原菌具有拮抗效果。王紅珠等[13]以生長于麗水市某村重金屬污染區(qū)的植物為材料，分離篩選出鏈球菌菌株GZ01，經(jīng)鑒定其能夠通過分泌IAA、產(chǎn)鐵載體、溶磷以及合成ACC脫氨酶等功能來促進(jìn)宿主植物生長。這些具有植物益生特性的內(nèi)生細(xì)菌，是目前商品化生防制劑或微生物肥料的主要來源，已在農(nóng)業(yè)實(shí)踐中得到了廣泛應(yīng)用[14-19]。研究表明，油菜根內(nèi)含有豐富的內(nèi)生菌菌群，在促進(jìn)油菜種子的萌發(fā)以及后期生長發(fā)育中發(fā)揮重要的作用。同時(shí)油菜的根系分泌物也可增強(qiáng)土壤微生物和土壤生化活性作用，并能溶解和利用土壤中的難溶性磷，提高土壤的有效磷水平[20-21]。油菜不僅是十字花科的主要代表性植物，也是一種重要的蔬菜和油料經(jīng)濟(jì)作物。對油菜根內(nèi)生細(xì)菌菌株的分離及益生特性的篩選不僅豐富了十字花科植物和油料經(jīng)濟(jì)作物的益生菌資源，而且將為發(fā)展高效、環(huán)境友好和人畜安全的生防制劑或微生物肥料奠定材料和理論基礎(chǔ)。本研究從油菜根中分離鑒定內(nèi)生細(xì)菌菌株，并檢測其植物益生作用，以篩選具有植物益生作用的菌株，系統(tǒng)評估油菜植物益生菌資源及其潛力。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

油菜采集于福建省福州市閩侯油菜種植地。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 油菜根內(nèi)生菌的分離、純化和分子鑒定 采集的油菜植物去掉根部浮土，自來水沖洗干凈，并用無菌水沖洗3次。將預(yù)處理的根置于無菌培養(yǎng)皿中，75%酒精消毒2 min后，用無菌水清洗3次。將預(yù)處理的油菜根充分研磨靜置后得菌懸液，菌懸液梯度稀釋后涂布于TSA固體培養(yǎng)基上，每個(gè)處理重復(fù)3次，28℃培養(yǎng)24～36 h。當(dāng)平板長出菌落時(shí)，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色及大小的差異挑取單克隆進(jìn)行多次純化。純化后菌株于搖床28℃振蕩培養(yǎng)18～24 h。取適量純菌液與已滅菌的20%甘油混合于-20℃保藏，剩余部分用于試驗(yàn)。

按Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA試劑盒說明提取油菜根內(nèi)生菌基因組DNA。以提取的基因組DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物（27f：5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;1492r：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增[22]。擴(kuò)增產(chǎn)物用SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化回收后，送至上海生工測序。獲得的序列用SeqMan查看并進(jìn)行序列拼接，利用EzBioCloud數(shù)據(jù)庫分析并確定其分類地位，最后在Mega 7.0中用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 油菜根內(nèi)生菌木質(zhì)纖維素和木聚糖降解能力測定 纖維素酶和木聚糖酶活性測定：分別取4 mL于TSA培養(yǎng)基中活化的菌懸液，離心棄上清收集菌體接種于CMC培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48 h后，革蘭氏碘液染色3～5 min。分別取10 μL纖維素酶液（10 mg·mL-1）滴加于打孔的CMC平板上，10 μL木聚糖酶液（10 mg·mL-1）滴加于打孔的木聚糖平板作為陽性對照。無菌水作陰性對照。

1.2.3 油菜根內(nèi)生菌促生及產(chǎn)IAA活性的測定 產(chǎn)IAA內(nèi)生菌對植物種子發(fā)芽的影響：分別吸取8 μL于TSA培養(yǎng)基活化的菌懸液接種于裝有2 mL含L色氨酸的King氏培養(yǎng)基（酵母浸粉0.5 g、胰蛋白胨0.5 g、酪蛋白氨基酸0.5 g、葡萄糖0.5 g、可溶性淀粉0.5 g、丙酮酸鈉0.3 g、K2HPO4 0.3 g、 MgSO4·7H2O 0.05 g、 L色氨酸0.5 g，蒸餾水定容至1000 mL，pH為7.2±0.2，121℃滅菌）和不含L色氨酸的King氏培養(yǎng)基（酵母浸粉0.5 g、胰蛋白胨0.5 g、酪蛋白氨基酸0.5 g、葡萄糖0.5 g、可溶性淀粉0.5 g、丙酮酸鈉0.3 g、K2HPO4 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.05 g，蒸餾水定容至1000 mL，pH為7.2±0.2，121℃滅菌）的試管中，28℃培養(yǎng)5 d，離心后保留上清液待用。小麥種子用5%次氯酸鈉消毒30 s，無菌水沖洗1次，充分吸干水分。將處理后的5～7顆種子放入鋪有濕潤濾紙的無菌培養(yǎng)皿中，并滴加100 μL上述過程獲得的內(nèi)生菌菌株上清液，28℃黑暗保濕催芽48 h，而后于28℃光照溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)8～10 d，定期觀察濾紙濕潤程度并滴加適量的無菌水，分別統(tǒng)計(jì)測定不同菌液培養(yǎng)下種子的發(fā)芽率、芽長度、植物根的長度（根尖到根部）和植物葉的長度（葉尖到葉根部）。

產(chǎn)IAA內(nèi)生菌的比色篩選：將200 μL于TSA培養(yǎng)基活化的菌懸液接種于裝有5 mL含L色氨酸的King氏培養(yǎng)基和不含L色氨酸的King氏培養(yǎng)基的試管中，28℃培養(yǎng)5 d，離心后收集上清液，分別將等量的上清液和Salkowski比色液混合，室溫避光靜置15 min后觀察，顏色變紅者為能夠分泌IAA的陽性菌株。

1.2.4 油菜根內(nèi)生菌抑菌活性的測定 細(xì)菌和真菌平板制備：分別將靶標(biāo)細(xì)菌大腸桿菌、芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌挑取少許接種于含2 mL TSB液體培養(yǎng)基的試管中，30℃培養(yǎng)12～18 h后，取0.1 mL菌懸液分別在TSA固體培養(yǎng)基上涂布，晾干，用槍頭在TSA固體培養(yǎng)基距離中心位置相同的4個(gè)點(diǎn)進(jìn)行打孔備用。真菌黑曲霉接種到PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，28℃培養(yǎng)3 d后收集孢子用0.9%生理鹽水制備真菌孢子懸液。取0.1 mL孢子懸液分別在PDA固體培養(yǎng)基上涂布，28℃培養(yǎng)過夜，用槍頭在距離中心位置相同的4個(gè)點(diǎn)進(jìn)行打孔備用。

抑菌活性檢測：挑取內(nèi)生菌單菌落接種于含2 mL TSA培養(yǎng)基的試管中，30℃培養(yǎng)12～18 h后，取0.5 mL菌懸液10000 r·min-1離心5 min，保留上清液。取100 μL待測的培養(yǎng)上清液分別加至已經(jīng)制備好的細(xì)菌和真菌平板的孔內(nèi)，每個(gè)平板接入4種內(nèi)生細(xì)菌，28℃培養(yǎng)24～48 h，檢查孔周邊是否產(chǎn)生抑菌圈，記錄其抑菌圈的大小及菌株編號。對測試菌株和初篩中產(chǎn)生抑菌圈的菌株進(jìn)行活化后，按初篩的步驟進(jìn)行復(fù)篩，每個(gè)菌株3個(gè)平行，分別以無菌水和TSB培養(yǎng)基作為陰性對照。

1.2.5 油菜根內(nèi)生菌固氮和產(chǎn)載體能力的測定 內(nèi)生固氮菌篩選：將內(nèi)生菌菌株分別接種于TSA固體培養(yǎng)基，28℃活化培養(yǎng)1～2 d后，挑取單菌落接種在無氮培養(yǎng)基上[22]，28℃培養(yǎng)至第3 d和第7 d后觀察其生長情況。挑取可在該無氮培養(yǎng)基中生長的菌株進(jìn)行繼代培養(yǎng)，連續(xù)傳代3次后仍能在無氮培養(yǎng)基中生長的菌株為具有固氮能力的內(nèi)生細(xì)菌。將篩選出的內(nèi)生菌重新接種在無氮培養(yǎng)基上，挑取單克隆進(jìn)行轉(zhuǎn)接，每3～7 d轉(zhuǎn)接1次，連續(xù)轉(zhuǎn)接5次以上，觀察待測菌株的生長狀況，生長狀況良好則認(rèn)為其具有較穩(wěn)定的固氮能力。

產(chǎn)鐵載體菌篩選：取4 mL于TSB培養(yǎng)基中活化的菌懸液，離心后棄上清保留菌體。用槍頭吸取菌體點(diǎn)于CAS檢測平板[23]（每個(gè)菌3個(gè)平行），30℃培養(yǎng)12 h，以無菌水作為對照。菌體周圍由亮藍(lán)色變?yōu)槌壬淳哂需F載體分泌圈，隨后進(jìn)行復(fù)篩。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜根內(nèi)生菌的分離純化與分子鑒定

根據(jù)平板上菌落的形態(tài)、大小及顏色差異，挑取單克隆并在新的平板劃線，最終得到純化的油菜根內(nèi)生菌菌株14株。擴(kuò)增分離篩選得到的細(xì)菌菌株的16S rRNA基因，測序后序列上傳通過EzBioCloud數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分子鑒定，其結(jié)果如表1所示。

從表1可知，分離得到的14株菌株分別屬于假單胞菌屬Pseudomonas、大腸桿菌屬Enterobacter、芽孢桿菌屬Bacillus、葡萄球菌屬Staphylococcus以及萊略特菌屬Lelliottia。其中，大腸桿菌屬Enterobacter在油菜根分離得到的菌株中所占比例最高，為42.86%，其次為假單胞菌屬Pseudomonas，所占比例為35.71%。利用Mega 5.0對測序的16S rRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果與分子鑒定結(jié)果基本一致（圖1），菌株Y-2、Y-3、Y-4、Y-13、Y-14均為假單胞菌屬Pseudomonas，相似性較高，且菌株

Y-2、Y-3、Y-4、Y-14在同一分支上，親緣關(guān)系更為接近。菌株Y-1、Y-5、Y-6、Y-7、Y-8、Y-12都為腸桿菌屬Enterobacter，親緣關(guān)系很近，菌株Y-11為萊略特菌屬Lelliottia。其他的如Y-10為葡萄球菌屬Staphylococcus，菌株Y-9為芽孢桿菌屬Bacillus，各自單獨(dú)聚為一支。

2.2 油菜根內(nèi)生菌木質(zhì)纖維素和木聚糖降解能力測定

以分離篩選得到的14株油菜根內(nèi)生菌菌株為材料，進(jìn)一步篩選能夠分解纖維素和木聚糖的菌株。結(jié)果表明，Y-2、Y-3、Y-4、Y-5、Y-6、Y-11、Y-12、Y-13、Y-14等9株菌株能分解纖維素，具有纖維素酶活性，且Y-2、Y-12、Y-13、Y-14等4株菌株的纖維素酶活性相對較高（圖2、圖3）。Y-1、Y-2、Y-3、Y-4、Y-5、Y-6、Y-9、Y-10、Y-11、Y-12、Y-13、Y-14等12株菌株能分解木聚糖，具有木聚糖酶活性，且Y-2、Y-4、Y-9、Y-10、Y-12、Y-13、Y-14等7株菌株的木聚糖酶活性相對較高（圖4、圖5）。

2.3 油菜根內(nèi)生菌促生及產(chǎn)IAA活性的測定

以小麥種子為材料，分別檢測14株油菜根內(nèi)生菌菌株的促生長活性。結(jié)果表明，在添加色氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，有些菌株可以促進(jìn)根的生長，如菌株Y-8、Y-12;在不添加色氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，有些菌株可以促進(jìn)根的生長，比如菌株Y-1、Y-4、Y-5、Y-7、Y-10、Y-12、Y-13等;有些菌株則可以促進(jìn)莖的生長，如菌株Y-5。就發(fā)芽率而言，添加色氨酸培養(yǎng)基培養(yǎng)的油菜發(fā)芽率整體上比不添加色氨酸培養(yǎng)基培養(yǎng)的油菜發(fā)芽率低（表2）。

在添加色氨酸的King氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，假單胞菌屬Y-3及腸桿菌屬Y-7、Y-8共3株菌株培養(yǎng)上清液顯紅色，說明3株油菜根內(nèi)生菌可以通過色氨酸途徑利用色氨酸合成分泌IAA（表3、圖6）。其中，腸桿菌屬菌株Y-8產(chǎn)IAA的能力相對較強(qiáng)。然而，在沒有添加色氨酸的King培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，檢測的14株油菜根內(nèi)生菌培養(yǎng)上清液均沒有顯色，說明根內(nèi)生菌在沒有色氨酸存在的情況下不分泌生長素IAA。

2.4 油菜根內(nèi)生菌抑菌活性測定

以分離篩選得到的14株油菜根內(nèi)生菌株為材料，進(jìn)一步篩選內(nèi)生拮抗菌株并測定其抑菌活性。結(jié)果表明，菌株Y-1、Y-6、Y-7、Y-8、Y-12可以拮抗大腸桿菌，且Y-7拮抗大腸桿菌的能力相對較強(qiáng)，5株菌株均為腸桿菌屬Enterobacter;菌株Y-1能拮抗枯草芽孢桿菌;菌株Y-3、Y-4能拮抗金黃色葡萄球菌，2株菌株均為假單胞菌屬Pseudomonas;

Y-3、Y-4、Y-6、Y-9、Y-10、Y-14可拮抗黑曲霉，且菌株Y-3、Y-6拮抗黑曲霉的能力相對較強(qiáng)，其中Y-9為芽孢桿菌屬Bacillus，Y-10為葡萄球菌屬Staphylococcus，Y-14為假單胞菌屬Pseudomonas。

2.5 油菜根內(nèi)生菌固氮和產(chǎn)載體能力測定

以分離篩選得到的14株油菜根內(nèi)生菌株為材料，進(jìn)一步測定其內(nèi)生固氮菌和產(chǎn)鐵載體的能力。菌株Y-1、Y-2、Y-6、Y-10、Y-13、Y-14有一定的固氮能力，且菌株Y-1、Y-2、Y-10、Y-13、Y-14固氮能力較為穩(wěn)定（圖7、圖8）。菌株Y-2、Y-4、Y-6、Y-10、Y-11、Y-13、Y-14等7株菌都可以產(chǎn)生鐵載體分泌圈，且菌株Y-12和Y-16產(chǎn)鐵載體的能力較強(qiáng)（圖9）。

總體來說，從油菜根中分離得到的14株根內(nèi)生菌具有一定的產(chǎn)鐵載體、固氮、纖維素酶和木聚糖酶活性以及抑菌能力，且這些有益的植物特性對植物生長發(fā)育具有一定的促進(jìn)作用（表3）。

3 結(jié)論與討論

植物體內(nèi)廣泛分布著內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生放線菌和內(nèi)生真菌，不僅分布廣泛、種類繁多，同時(shí)具多樣性的功能特性，如促植物生長、生物固氮、增加宿主植物抗病害能力等，具有巨大的利用潛能[24]。目前關(guān)于植物益生菌的篩選及其應(yīng)用方面的報(bào)道大多集中在模式作物擬南芥、農(nóng)作物和蔬菜等，包括促生菌、抗植物病害菌、固氮菌、產(chǎn)鐵載體菌等功能菌的分離篩選及鑒定[25]。本研究以重要油料經(jīng)濟(jì)作物油菜為試驗(yàn)材料，從油菜根中分離純化獲得14株油菜根內(nèi)生菌，經(jīng)鑒定14株菌株分別隸屬于假單胞菌屬、腸桿菌屬、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬以及萊略特菌屬。對分離純化的14株內(nèi)生菌株的篩選及其功能機(jī)制的初步研究表明，14株內(nèi)生菌具有豐富而多樣的植物益生作用，包括促生、拮抗病害菌、固氮、產(chǎn)鐵載體等。對油菜植物根內(nèi)生菌益生特性及其作用機(jī)制的初步研究，不僅豐富了現(xiàn)有的益生菌資源，也為功能性內(nèi)生細(xì)菌的開發(fā)和利用奠定材料和理論基礎(chǔ)。試驗(yàn)結(jié)果表明油菜根內(nèi)生菌可以作為篩選和開發(fā)具有植物促生和病害防控作用的微生物菌劑的重要來源。

本研究篩選得到9株具有分解纖維素能力的菌株并篩選得到12株具有分解木聚糖能力的菌株，分別占所測試菌株64.3%和85.7%，表明大多數(shù)分離的油菜根內(nèi)生菌具有一定的木質(zhì)纖維素降解能力。該結(jié)果與前人關(guān)于植物內(nèi)生菌來源的研究基本一致，有研究認(rèn)為是通過降解植物細(xì)胞纖維素，破壞細(xì)胞壁，進(jìn)入植物體內(nèi)而成為內(nèi)生菌[23，26]。纖維素酶和木聚糖酶在油菜內(nèi)生菌種的廣泛存在也從側(cè)面說明具有分解木質(zhì)纖維素的能力是內(nèi)生菌的一個(gè)重要特征，同時(shí)也應(yīng)作為評價(jià)內(nèi)生菌在植物根組織內(nèi)定殖的一個(gè)重要指標(biāo)。植物內(nèi)生細(xì)菌主要通過兩種機(jī)制促進(jìn)植物生長，一方面是內(nèi)生細(xì)菌可以通過直接產(chǎn)生吲哚乙酸（IAA）或其他植物激素來促進(jìn)植物生長，一方面內(nèi)生菌通過生物固氮、促進(jìn)植物對礦物質(zhì)氮、磷等營養(yǎng)元素的吸收利用和對有害病原生物的防控等間接機(jī)制促進(jìn)植物生長[27]。對油菜內(nèi)生菌的篩選表明，內(nèi)生菌菌株對測試的小麥根和芽的生長具有一定的促進(jìn)作用。進(jìn)一步對內(nèi)生菌的促生機(jī)制進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明，所有的內(nèi)生菌菌株在不含色氨酸的培養(yǎng)基中均不能產(chǎn)生IAA，但含在色氨酸存在的情況下，3株內(nèi)生細(xì)菌菌株Y-3、Y-7、Y-8具有分泌吲哚乙酸（IAA）的能力，表明油菜內(nèi)生菌可以通過色氨酸途徑合成吲哚乙酸（IAA）。然而，3株產(chǎn)IAA的菌株處理小麥之后芽長沒有顯著大于對照組，可能是產(chǎn)生了抑制作用。同時(shí)一些沒有分泌IAA的供試菌株也顯示了明顯的植物促生作用，表明內(nèi)生菌株可通過其他途徑促生植物的生長，比如生物固氮為植物提供營養(yǎng)，或者抑制植物病害等，比如在試驗(yàn)中至少有5株內(nèi)生菌表明了具有穩(wěn)定的固氮能力。

本研究還發(fā)現(xiàn)油菜根內(nèi)生菌具有種類多樣性，同時(shí)具有多樣性的益生特性，比如1株菌株可能具有多種功能，對于宿主植物，1株菌株發(fā)揮的作用可能是一種，也可能是多種，表明油菜內(nèi)生菌在植物促生和病害防控中具有很大的開發(fā)和應(yīng)用潛力。然而，要將內(nèi)生菌株應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和病害防治，不僅需要將內(nèi)生菌株產(chǎn)生的高效穩(wěn)定的益生功能特性，同時(shí)也要保證益生菌在植物內(nèi)穩(wěn)定定殖，比如分離的內(nèi)生菌具有多種的抑菌活性表明了植物內(nèi)生菌之間復(fù)雜的相互作用，這些因素會影響內(nèi)生菌功能作用的發(fā)揮。進(jìn)一步通過采用大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌及黑曲霉4種測試菌株，篩選得到多株拮抗內(nèi)生細(xì)菌，也表明了分離的油菜內(nèi)生菌表現(xiàn)出了對多種待測細(xì)菌和真菌菌株有明顯的抑制作用。有研究表明，微生物在限鐵的條件下，能夠產(chǎn)生一種對Fe3+具有較高螯合特性的低分子量化合物，即鐵載體，可以向寄主植物提供可利用的鐵元素，并有效的抑制致病真菌對鐵的需求，所以植物內(nèi)生細(xì)菌能夠通過產(chǎn)生鐵載體抑制植物病害[28]。本研究篩選獲得7株內(nèi)生細(xì)菌能夠分泌產(chǎn)生鐵載體，但其分泌能力只有隸屬于假單胞菌屬的Y-13菌株及隸屬于葡萄球菌屬的Y-10菌株較強(qiáng)，其余菌株均不明顯，篩選所得菌株是否具有植物促生作用以及生防作用還需待進(jìn)一步的研究。

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