王仁睿 湯玲莉 蘇仕林 劉成才 李 杰

（西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，綿陽(yáng) 621010）

蝴蝶蘭（Phalaenopsis aphrodite）為蘭科（Orchi?daceae）蝴蝶蘭屬（Phalaenopsis）多年生草本植物，花形奇特、花色艷麗、花期長(zhǎng)久，具有極高的觀賞價(jià)值，在觀賞花卉中占有極為重要的地位，被譽(yù)為“蘭中皇后”，深受消費(fèi)者青睞，繼而形成了蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)［1～2］。我國(guó)蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)從20 世紀(jì)80 年代初開始興起，經(jīng)過近幾年的發(fā)展，我國(guó)由以前的蝴蝶蘭輸入國(guó)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樯a(chǎn)輸出大國(guó)，從最北新疆、內(nèi)蒙古到最南端的海南島都有蝴蝶蘭生產(chǎn)基地［3］。但我國(guó)蝴蝶蘭品質(zhì)和蝴蝶蘭生產(chǎn)強(qiáng)國(guó)相比仍有較大的差距，造成該現(xiàn)象最主要的原因是蝴蝶蘭種苗普遍感染病毒，品質(zhì)不佳［4～5］。

目前已報(bào)道感染蝴蝶蘭病毒有25 種，其中建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus，CymMV）是侵染蝴蝶蘭最主要病毒之一，國(guó)際上已認(rèn)識(shí)到這種病毒的危害，多數(shù)國(guó)家現(xiàn)已推行了種苗植物檢疫證書制度，對(duì)進(jìn)口蝴蝶蘭嚴(yán)格規(guī)定不能攜帶此類病毒［6］。植物感染CymMV 后，葉片和花瓣出現(xiàn)褪綠條紋或壞死斑點(diǎn)，抑制植物生長(zhǎng)［7］。植株一旦感染病毒無法根治，長(zhǎng)期的無性繁殖導(dǎo)致病毒不斷積累，蝴蝶蘭感染CymMV 病毒的情況十分普遍。栽培無毒苗是目前生產(chǎn)上防治病毒的有效方法，生產(chǎn)無毒苗是實(shí)現(xiàn)無毒化栽培的核心技術(shù)［8］。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)CymMV 病毒的脫除主要有莖尖培養(yǎng)［9～10］、化學(xué)藥劑法［11～12］、化學(xué)藥劑結(jié)合莖尖培養(yǎng)法［4，13］和熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)法［4，14］，其中以化學(xué)藥劑結(jié)合莖尖培養(yǎng)最常用。此外，還有納米技術(shù)應(yīng)用于CymMV 的脫除研究，用以降低病毒濃度，并增強(qiáng)植物對(duì)CymMV 的抗性［15］。以上幾種主要的脫毒方法存在三方面的問題：①分生組織過小易褐化，據(jù)研究表明，蝴蝶蘭的莖尖小于1 mm以下時(shí)褐化率和死亡率均為100%［10，14］；②化學(xué)藥劑對(duì)植物具有毒害作用［10，16］；③化學(xué)藥劑易引起種苗變異［17］。由此可見，對(duì)蝴蝶蘭建立高效、安全的新型脫毒技術(shù)對(duì)于實(shí)際生產(chǎn)和科研研究均具有重要的意義。

超低溫脫毒是在超低溫保存技術(shù)上延伸出來、目前發(fā)展迅猛的一種新型脫毒技術(shù)［18～19］，指將感染病原體（病毒、植原體、細(xì)菌）的材料經(jīng)液氮短暫處理后脫除病原體。迄今為止，超低溫脫毒技術(shù)已在15 種植物上有所應(yīng)用，成功脫除了25 種病毒、2 種植原體、1 種類病毒和1 種細(xì)菌［20］。與傳統(tǒng)脫毒方法相比，超低溫脫毒技術(shù)具有不需要?jiǎng)內(nèi)∵^小的莖尖［18～19］、對(duì)植物不產(chǎn)生毒害、再生植株遺傳穩(wěn)定［21］等優(yōu)勢(shì)。超低溫脫毒技術(shù)尚未應(yīng)用于蝴蝶蘭脫毒，建立該技術(shù)體系有望解決蝴蝶蘭脫毒存在的以上問題。

本研究擬以感染CymMV 的蝴蝶蘭品種“滿天紅”為試驗(yàn)材料，分別從蔗糖預(yù)培養(yǎng)濃度、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間和PVS2 處理時(shí)間三個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)行篩選，PVS2 是指不含生長(zhǎng)激素的MS（Murashige and Skoog medium）液體培養(yǎng)基+30%甘油（w/v）+15%乙二醇+15%DMSO（dimethyl sulfoxide）+0.4 mol·L-1蔗糖，pH為5.8［22］，超低溫莖尖誘導(dǎo)類原球莖，再誘導(dǎo)成苗，再生植株經(jīng)過RT-PCR 方法進(jìn)行病毒檢測(cè)，驗(yàn)證CymMV 的脫毒情況，脫毒苗進(jìn)行增殖和生根，建立蝴蝶蘭莖尖小滴玻璃化超低溫脫毒體系，為蘭科植物脫除CymMV 的后續(xù)研究提供了技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料選用本實(shí)驗(yàn)室收集的蝴蝶蘭品種“滿天紅”，建立組培體系。蝴蝶蘭增殖培養(yǎng)基為BM+BA 3.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂7 g·L-1，pH值為6.0。BM成分為花寶1號(hào)（Hy?ponex No.1，氮、磷、鉀含量分7∶6∶9）3 g·L-1+Fe.Na.EDTA 10 ml·L-1+有機(jī)物（肌醇20 000 mg·L-1+煙酸100 mg·L-1+鹽酸吡哆醇100 mg·L-1+鹽酸硫胺素20 mg·L-1+甘氨酸400 mg·L-1，配成100 倍母液）10 ml·L-1+蛋白胨1.5 g·L-1。培養(yǎng)溫度為26±2℃，光照強(qiáng)度45μmol·m-2·s-1，光照周期14 h·d-1。

1.2 病毒檢測(cè)

將超低溫脫毒前、超低溫脫毒后的再生植株（6 個(gè)月）各取8 株，3 次重復(fù)，經(jīng)過RT-PCR 分子檢測(cè)，確定病毒情況。稱取0.1 g植物葉片，在研缽中添加液氮進(jìn)行研磨，采用RNA試劑盒（天根生化科技有限公司）按照試劑盒說明書提取植物總RNA，采用紫外吸收法檢測(cè)RNA 質(zhì)量。以合格的RNA為模板，用Takara 反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cD?NA，進(jìn)行質(zhì)量檢查后將符合條件的cDNA 作為模板，離心管 中依次添加10×PCR buffer 2.0 μL、dNTPs（2.5 mmol·L-1）1.6 μL、cDNA 模 版1 μL、rTaq DNA 聚合酶0.2 μL，病毒正反引物（CymMVF： GTCGACCGCTTACTACGCAAAAGTGGTGTG、CymMV-R： CTGCAGCGACGGCATCGAAGAAGT?CAAAG）［23］各1.0μL，ddH2O 水補(bǔ)足至20μL，瞬時(shí)離心混勻。反應(yīng)體系為：48℃保溫45 min，94℃變性30 s，從60℃開始，每個(gè)循環(huán)遞減0.5℃，退火30 s，72℃延伸2 min，進(jìn)行10 個(gè)循環(huán)，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，21 個(gè)循環(huán)，72℃再延伸7 min。

1.3 蝴蝶蘭莖尖小滴玻璃化超低溫脫毒體系的關(guān)鍵因素篩選

1.3.1 不同濃度的蔗糖預(yù)培養(yǎng)

以確定感染CymMV 病毒的組培苗（6周苗齡）為對(duì)象，在體視顯微鏡下用無菌手術(shù)刀切取5～6 mm 大小的莖尖（見圖1a），在BM+0.3、0.6、0.8、1.0 mol·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)1 d。室溫條件下用加載液（BM+2 mol·L-1甘油+0.4 mol·L-1蔗糖）處理莖尖20 min。在0℃條件下用PVS2 玻璃化溶液浸泡莖尖60 min，用移液槍吸取0℃的PVS2 溶液，在鋁箔條（2×0.8 cm）上形成一個(gè)個(gè)小滴（大小約為2.5 μL）（見圖1b），將莖尖逐個(gè)放入小滴中，用鑷子夾住鋁箔條，投入液氮，再將冷凍管投入液氮，待液氮充滿冷凍管后，將鋁箔條轉(zhuǎn)至冷凍管，液氮保存1 h。夾起鋁箔條，放入卸載液（BM+1.2 mol·L-1蔗糖）室溫卸載20 min。處理完的莖尖放置在無菌的濾紙上吸干卸載液，轉(zhuǎn)入再生培養(yǎng)基BM+GA32.0 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂7 g·L-1，暗培養(yǎng)3 d，轉(zhuǎn)入類原球莖培養(yǎng)基BM+BA 5.0 mg·L-1+NAA 0.7 mg·L-1+活性炭2 g·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂7 g·L-1［24］進(jìn)行誘導(dǎo)，正常光照培養(yǎng)。

在海南建省辦經(jīng)濟(jì)特區(qū)之前，剛碩士畢業(yè)的程立生便登上海南島，任華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)教師、系主任助理、教務(wù)處副處長(zhǎng)、處長(zhǎng)、研究生處處長(zhǎng)。程立生還擔(dān)任過3年樂東縣科技副縣長(zhǎng)。

1.3.2 不同天數(shù)的蔗糖預(yù)培養(yǎng)

剝?nèi)〉那o尖在BM+0.6 mol·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)1、2、3、4 d。再經(jīng)過加載、PVS2 處理、形成小滴、冷凍、卸載、再生培養(yǎng)，步驟同上。

1.3.3 PVS2處理時(shí)間

剝?nèi)〉那o尖在BM+0.6 mol·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)1 d。經(jīng)過加載后，在0℃條件下用PVS2玻璃化溶液浸泡莖尖30、60、90、120、150 min，再形成小滴、冷凍、卸載、再生培養(yǎng)，步驟同上。

1.4 類原球莖的成苗

將誘導(dǎo)的類原球莖切成小塊（>3 mm），轉(zhuǎn)移到BM+BA 3.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂7 g·L-1的培養(yǎng)基［24］進(jìn)行生長(zhǎng)，1 個(gè)月后類原球莖即可變綠成苗。

1.5 再生植株的增殖和生根

將再生植株逐一分成單棵，培養(yǎng)6個(gè)月后隨機(jī)選取8 株，重復(fù)3 次，經(jīng)病毒檢測(cè)，將RT-PCR 陰性結(jié)果的植株轉(zhuǎn)移到BM+BA 3.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂7 g·L-1的培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖，6 周后，將增殖的植株轉(zhuǎn)到1/2BM+BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂7 g·L-1的培養(yǎng)基［14］誘導(dǎo)生根。

1.6 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析

采用單因素實(shí)驗(yàn)篩選蝴蝶蘭莖尖小滴玻璃化超低溫脫毒體系各關(guān)鍵因素，每個(gè)處理選用10 個(gè)莖尖，3 次重復(fù)。超低溫莖尖（+LN）指經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、加載、PVS2 處理、形成小滴、液氮冷凍、卸載和再生培養(yǎng)階段的莖尖，對(duì)照莖尖（-LN）指經(jīng)過其他幾個(gè)階段但不經(jīng)液氮冷凍的莖尖。超低溫處理7 d 后統(tǒng)計(jì)成活率，底部褐色，分生組織綠色的蝴蝶蘭莖尖（見圖1c）記為成活莖尖，整體褐色的蝴蝶蘭莖尖（見圖1d）記為死亡莖尖，長(zhǎng)出葉片的莖尖視為再生。

8周統(tǒng)計(jì)再生率：

再生率（%）=（再生莖尖數(shù)/總莖尖數(shù)）×100%（2）

數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 版進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，同列數(shù)據(jù)中不同字母代表最小顯著性P<0.05，采用Sigmaplot 14.0版進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的蔗糖預(yù)培養(yǎng)

成活的超低溫莖尖在21 d 可觀察到明顯的再生（見圖1e），兩個(gè)月形成類原球莖（見圖1f）。不同濃度的蔗糖預(yù)培養(yǎng)對(duì)超低溫莖尖的成活率和再生率具有顯著影響（見表1）。隨著蔗糖濃度的增加，超低溫莖尖的成活率和再生率出現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。經(jīng)BM+0.6 mol·L-1蔗糖處理1 d 后經(jīng)過超低溫脫毒處理，超低溫莖尖的成活率為76.7%，與0.8～1.0 mol·L-1蔗糖的成活率差異不顯著，再生率為56.7%，顯著高于其他處理。對(duì)照莖尖在0.3～0.6 mol·L-1蔗糖范圍內(nèi)的成活率和再生率均高于0.8～1.0 mol·L-1蔗糖的兩個(gè)處理。

2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間的蔗糖預(yù)培養(yǎng)

隨著蔗糖預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照莖尖和超低溫處理莖尖的成活率和再生率均出現(xiàn)了下降的趨勢(shì)（見表2）。蔗糖預(yù)處理1～3 d，對(duì)照莖尖和超低溫莖尖的成活率、對(duì)照莖尖的再生率并未顯著差異，但蔗糖預(yù)培養(yǎng)1～2 d，超低溫處理莖尖的再生率分別為56.7%和53.3%，顯著高于3～4 d 處理。當(dāng)蔗糖預(yù)培養(yǎng)為4 d 時(shí)，超低溫處理的莖尖降至6.7%。

表1 蔗糖濃度對(duì)莖尖（對(duì)照、超低溫）成活率和再生率的影響Table 1 Effect of sucrose concentration in preculture medium on survival rate and regrowth rate of shoot tips(-LN and+LN)

表2 蔗糖預(yù)培養(yǎng)天數(shù)對(duì)莖尖（對(duì)照、超低溫）成活率和再生率的影響Table 2 Effect of sucrose duration in preculture medi‐um on survival rate and regrowth rate of shoot tips（-LN and+LN）

2.3 PVS2處理時(shí)間

對(duì)照莖尖的成活率和再生率隨著PVS2 處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸下降趨勢(shì)（見圖2）。對(duì)于超低溫莖尖而言，PVS2 處理時(shí)間對(duì)成活率和再生率影響顯著，隨著PVS2 處理時(shí)間的延長(zhǎng)，成活率和再生率均出現(xiàn)先升高再下降的趨勢(shì)。PVS2 處理60-90 min，超低溫莖尖的成活率和再生率分別為66.7%～63.3% 和46.7%～43.3%，顯 著 高 于 其 他時(shí)間。

篩選出最佳蔗糖預(yù)培養(yǎng)濃度、時(shí)間和PVS2 處理時(shí)間三個(gè)關(guān)鍵因素，將類原球莖分割繼續(xù)培養(yǎng)成苗后，通過RT-PCR 進(jìn)行CymMV 的檢測(cè)，陰性結(jié)果的植株進(jìn)行增殖（見圖1g）和生根（見圖1h）。

2.4 蝴蝶蘭莖尖小滴玻璃化超低溫脫毒體系對(duì)CymMV的脫除情況

將超低溫脫毒前、超低溫脫毒后的再生植株先后進(jìn)行RT-PCR 病毒檢測(cè)，結(jié)果顯示，超低溫脫毒前植株全部攜帶CymMV（見圖3a），超低溫脫毒處理后的再生植株有一半未檢測(cè)到CymMV（見圖3b），脫毒率為50%。

3 討論

本研究建立了蝴蝶蘭品種‘滿天紅’莖尖小滴玻璃化超低溫脫毒體系，最佳的蔗糖預(yù)培養(yǎng)是BM+0.6 mol·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)1～2 d；最優(yōu)的PVS2 處理時(shí)間是60～90 min。超低溫脫毒處理后的再生植株經(jīng)RT-PCR 檢測(cè)，CymMV 的脫毒率為50%。

在莖尖培養(yǎng)脫毒研究中，莖尖大小與成活率成正比，但與脫毒率成反比。Lim，et al.［12］報(bào)道采用病毒唑結(jié)合莖尖培養(yǎng)，0.1 mm 的莖尖不能成活和再生，1 mm 的莖尖可以成活但不能脫除Cym?MV。目前在CymMV 的脫毒研究中，主要采用藥劑處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)或熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)，所取的莖尖大小為1～2 mm，剝?nèi)‰y度大，褐化的風(fēng)險(xiǎn)增大［10，13～14］；其次，脫除效率因檢測(cè)手段不同而差異很大，賀嘉［4］報(bào)道藥劑結(jié)合莖尖培養(yǎng)采用含6 g·L-1板藍(lán)根的培養(yǎng)基上培養(yǎng)后剝?nèi)∏o尖培養(yǎng)、38/32℃處理35 d后剝?nèi)∏o尖培養(yǎng)和莖尖在50 mg·L-1病毒唑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周三種方法進(jìn)行脫毒，再生植株經(jīng)RT-PCR 檢測(cè)，脫毒率分別為77.3%、46.7%和33.3%；許傳俊等［25］將幼苗轉(zhuǎn)至含40 mg·L-1病毒唑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 個(gè)月，再剝?nèi)∏o尖進(jìn)行培養(yǎng)，再生植株經(jīng)ELISA 檢測(cè)，脫毒率為30%；李正民［26］報(bào)道腋芽在含1.0 mg·L-1氨基寡糖素或30 mg·L-1病毒唑的增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)60 d，試紙條檢測(cè)再生植株，氨基寡糖素和病毒唑的的脫毒率均為83.3%；劉福秀等［27］報(bào)道花梗組織培養(yǎng)結(jié)合5～15 mg·L-1病毒A，再生植株經(jīng)DAS-ELISA 和RTPCR 檢測(cè)，脫毒率分別為89.6%～100%和63.5%～74%?？梢钥闯觯珼AS-ELISA 的靈敏度不夠，部分研究?jī)H采用ELISA 對(duì)脫毒苗進(jìn)行檢測(cè)，假陰性結(jié)果多，脫毒率比RT-PCR 檢測(cè)的結(jié)果要高，因此在脫毒研究中應(yīng)采用RT-PCR 方法進(jìn)行檢測(cè)，保證結(jié)果的可靠性。本研究中CymMV 的脫毒率為50%，與部分研究結(jié)果接近，證明超低溫療法對(duì)于脫除CymMV 是有效的，而且本研究中所取的莖尖大小為5～6 mm，大大降低莖尖剝?nèi)〉碾y度，有效避免了褐化造成不易成活的問題。

超低溫脫毒目前已經(jīng)應(yīng)用于李［28］、香蕉［29～30］、葡萄［31～32］、馬鈴薯［33～35］等多種植物，成功脫除多種病毒、類病毒、植原體和細(xì)菌。研究者們報(bào)道了品種的差異對(duì)脫毒率有很大影響，如感染了蘋果褪綠葉斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV）的6 個(gè)品種經(jīng)超低溫處理后，脫毒率最低為60%，最高為100%［36］；馬鈴薯10 個(gè)品種經(jīng)超低溫處理后，馬鈴薯S 病毒（Potato Virus S，PVS）的脫毒率為60%～100%［37］。植物莖尖細(xì)胞經(jīng)液氮處理后，絕大部分細(xì)胞被凍死，僅有分生組織頂端幾層細(xì)胞和第一、二葉原基的部分細(xì)胞能成活，病毒侵染莖尖能力不同，對(duì)于不能侵染到莖尖頂端分生組織和第一、二葉原基的病毒，超低溫脫毒的脫除效率很高［38］。感染菊花B 病毒（Chrysanthemum Virus B，CVB）的莖尖經(jīng)超低溫處理后，經(jīng)石蠟切片觀察，頂端分生組織和第1～3 片葉原基細(xì)胞成活，其余區(qū)域死亡，60%的莖尖大部分區(qū)域均有CVB 的分布，包括頂端分生組織和第1～2 片葉原基，40%的莖尖頂端分生組織和第1～2 片葉原基沒有檢測(cè)到病毒的存在，CVB的脫毒率為30.8%［39］。目前超低溫脫毒應(yīng)用于脫除CymMV 的研究尚未見報(bào)道，本研究?jī)H對(duì)蝴蝶蘭一個(gè)品種開展了超低溫脫毒研究，不同品種之間是否存在脫毒差異的現(xiàn)象、超低溫脫毒對(duì)CymMV 的脫除機(jī)理等還有待進(jìn)一步研究。