楊德麗 王娟娟 龐海龍 孫 坤 馮漢青

（西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070）

殼聚糖（chitosan，CTS）是一種天然的高分子聚合物，具有無毒、抑菌、生物相容及生物降解等多種優(yōu)良特性［1］。研究表明，殼聚糖可作為植物的生長調(diào)節(jié)劑，促進(jìn)植物種子的萌發(fā)、根的伸長和幼苗的生長發(fā)育［1］。此外，也有許多研究結(jié)果表明，殼聚糖還可誘導(dǎo)植物脅迫抗性的提高，有利于植物抵抗各種真菌、細(xì)菌、昆蟲等生物脅迫以及鹽、干旱、重金屬等非生物脅迫［1，2～5］。

大量研究表明，在殼聚糖調(diào)節(jié)植物生長及激活植物抗性反應(yīng)過程中通常會(huì)激發(fā)兩種植物細(xì)胞的生理學(xué)反應(yīng)：①殼聚糖可誘導(dǎo)植物細(xì)胞活性氧（ROS）的產(chǎn)生［6～8］；ROS 作為植物體內(nèi)一類重要信號(hào)分子，可參與調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)；同時(shí)也可直接作用于各種病原微生物抑制其生長［9］。②殼聚糖可激活植物苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性［8，10］；PAL 是苯丙烷途徑的關(guān)鍵酶和限速酶，廣泛參與植物生長發(fā)育的多種生理活動(dòng)［11］，其通過提高木質(zhì)素的合成從而參與了植物生長發(fā)育和抵御病原微生物；此外，PAL 參與合成植物花青素和黃酮等物質(zhì)的產(chǎn)生，從而提高了植物抵御生物和非生物脅迫的能力［12～13］。因此，ROS水平和PAL 活性變化被認(rèn)為是殼聚糖所引起的植物標(biāo)志性生理學(xué)響應(yīng)。

三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）是生物體內(nèi)重要的分子，參與多種代謝反應(yīng)。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為ATP 主要在細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮功能，作為能量分子參與細(xì)胞的代謝活動(dòng)。但近年來的研究表明，細(xì)胞內(nèi)部的部分ATP 可通過ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白、陰離子通道或膜泡運(yùn)輸?shù)姆绞奖晦D(zhuǎn)運(yùn)到胞外，從而形成了胞外ATP（extracellular ATP，eATP）［14］。Choi 等［15］在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)胞外ATP 受體DORN1，為闡明植物細(xì)胞胞外ATP 信號(hào)傳導(dǎo)過程奠定了基礎(chǔ)。和細(xì)胞內(nèi)部的生理學(xué)角色不同，胞外ATP 主要作為一種重要的信號(hào)分子，在植物生長發(fā)育和細(xì)胞基礎(chǔ)代謝中發(fā)揮重要功能，并且參與植物細(xì)胞對(duì)重金屬脅迫、滲透脅迫、機(jī)械刺激等多種脅迫的響應(yīng)［16～21］。

大量研究表明，胞外ATP 水平對(duì)于植物細(xì)胞的活性氧水平具有明顯的調(diào)節(jié)作用［16～17，20］。盡管沒有對(duì)PAL 的生理學(xué)活性進(jìn)行測(cè)量，但Wu［22］等的研究表明胞外ATP 的水平對(duì)植物PAL 編碼基因具有調(diào)節(jié)作用。上述研究表明，植物ROS 和PAL 受到了胞外ATP 水平的調(diào)節(jié)。而如上所述，ROS 水平和PAL 活性變化是殼聚糖所激發(fā)的典型的植物細(xì)胞生理學(xué)反應(yīng)，但胞外ATP 對(duì)殼聚糖誘導(dǎo)的這些生理學(xué)變化是否具有影響在國內(nèi)外尚無報(bào)道?；诖?，本實(shí)驗(yàn)以煙草懸浮細(xì)胞為材料，初步探討了胞外ATP對(duì)殼聚糖引起細(xì)胞ROS水平和PAL活性變化的影響，以期能夠進(jìn)一步了解胞外ATP 的生理學(xué)作用，也為殼聚糖誘導(dǎo)的植物生理學(xué)變化的調(diào)控機(jī)制提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

煙草懸浮細(xì)胞（Nicotiana tabacum L.cv.Bright Yellow-2）由姜里文教授（中國香港大學(xué)）饋贈(zèng)。使用添加了質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%蔗糖和0.4 mg·mL-12，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）的MS（Murashige-Skoog）液體培養(yǎng)基在25℃、130 r·min-1黑暗條件下振蕩培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)中使用繼代培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的懸浮細(xì)胞，所有步驟均在無菌條件下完成。殼聚糖購自北京索萊寶科技有限公司，來源于蝦蟹殼，脫乙酰度約為90%。使用1%的乙酸溶解，放于60℃至完全溶解，用1 mol·L-1NaOH 調(diào)pH 至5.7，之后用無菌水定容，高壓滅菌后備用［23］。

1.2 煙草懸浮細(xì)胞的處理

取一定體積繼代培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的煙草懸浮細(xì)胞，進(jìn)行以下處理：①在煙草懸浮細(xì)胞中加入終濃度為5、10、15、20μg·mL-1殼聚糖；②在煙草懸浮細(xì)胞中加入終濃度為10、20、30、40 μmol·L-1ATP；③在煙草懸浮細(xì)胞中分別加入20 μmol·L-1ATP、20 μmol·L-1ATP+10 μg·mL-1的殼聚糖溶液或10μg·mL-1的殼聚糖溶液，對(duì)照中加入等體積的無菌水。在25℃黑暗條件下振蕩孵育30 min 后，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.3 細(xì)胞內(nèi)ROS水平的測(cè)定

參照NavdeepKaur 等［24］報(bào)道的方法。取待測(cè)的細(xì)胞懸浮液475 μL，加入25 μL H2DCFDA（2′，7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate），黑暗孵育5 min，繼而加入800 μL 磷酸緩沖液，離心3 min（3 000 r·min-1），棄上清液，將樣品置于熒光顯微鏡下（Leica，DM5000 B，Wetzlar，德國）進(jìn)行成像觀察（20×），并采用Image J軟件分析細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度。

1.4 細(xì)胞PAL活性的測(cè)定

參照王敬文等［25］改進(jìn)的方法。取煙草細(xì)胞，每0.2 g 細(xì) 胞 加 入1 mL 預(yù) 冷 的0.05 mol·L-1pH 為8.8 的硼酸緩沖液（含5 mmol·L-1巰基乙醇）和0.02 g聚乙烯吡咯烷酮，冰浴研磨成漿，在4℃，10 000 r·min-1下離心15 min，抽取上清液為酶提取液。檢測(cè)液組成為0.5 mL 酶提取液、2.5 mL pH8.8 硼酸緩沖液、1 mL 0.02 mol·L-1L-苯丙氨酸（用0.1 mol·L-1pH8.8 硼酸緩沖液配制）和1 mL 蒸餾水，總體積為5 mL。反應(yīng)液置于30℃水浴中，反應(yīng)30 min 后加6 mol·L-1HCl 0.1 mL 終 止 反 應(yīng)。在290 nm 下 測(cè)OD 值，以每分鐘每毫升酶液OD 值變化0.01 為1個(gè)酶活性單位。

1.5 細(xì)胞eATP水平的測(cè)定

取待測(cè)懸浮細(xì)胞加入1 mL 離心管中，離心4 min（4℃，4 000 r·min-1），吸取上清，每100μL 待測(cè)樣品加入100μL 螢火蟲尾部提取物溶液，迅速混勻，測(cè)定其熒光強(qiáng)度，根據(jù)測(cè)定熒光的強(qiáng)弱，得出相應(yīng)ATP的濃度［26］。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft office Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用Ori?gin 9.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行雙總體t檢驗(yàn)，在P<0.05 上有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖和外源ATP 對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平和PAL活性的影響

隨著殼聚糖（CTS）濃度的升高，細(xì)胞內(nèi)ROS的熒光強(qiáng)度逐漸升高（見圖1：a～e，圖2）。且均顯著高于CK，其中5 μg·mL-1殼聚糖處理使細(xì)胞內(nèi)的ROS熒光強(qiáng)度約為CK的1.4倍，而10、15和20μg·mL-1殼聚糖處理使細(xì)胞內(nèi)ROS 水平進(jìn)一步增加，分別增至CK 的3.4、4.6 和6.4 倍。使用5～15μg·mL-1殼聚糖處理，使細(xì)胞內(nèi)PAL 活性顯著增加，且均顯著高于CK，其中15 μg·mL-1殼聚糖處理下PAL 活性最高，為CK 的1.4 倍（見圖3）；當(dāng)殼聚糖濃度達(dá)到20μg·mL-1，PAL 活性有所下降，但仍然高于對(duì)照。不同濃度外源ATP 處理下，細(xì)胞內(nèi)ROS 的熒光強(qiáng)度和PAL 活性均無顯著變化（見圖1：f～j、圖4～5），選擇20μmol·L-1的外源ATP進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 殼聚糖對(duì)細(xì)胞胞外ATP水平的影響

不同濃度的殼聚糖處理下，胞外ATP 水平均顯著低于CK（見圖6）。5 和10 μg·mL-1殼聚糖處理下，胞外ATP 水平分別降低至CK 的0.7 和0.4倍；15μg·mL-1殼聚糖處理下胞外ATP水平降低為CK 的0.09 倍。在20 μg·mL-1殼聚糖處理下，胞外ATP 水平有一個(gè)回升，但仍然顯著低于CK，約為CK的0.3倍。

2.3 外源ATP 對(duì)殼聚糖誘導(dǎo)下細(xì)胞內(nèi)ROS 和PAL活性的影響

本研究選擇在10 μg·mL-1殼聚糖處理濃度下探究外源ATP對(duì)殼聚糖誘導(dǎo)的ROS水平和PAL活性變化的影響。在用10 μg·mL-1殼聚糖處理30 min 后，細(xì)胞內(nèi)ROS 水平急劇升高約為CK 的2.8倍。單獨(dú)用20μmol·L-1的外源ATP 處理未引起細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的顯著變化。而在10μg·mL-1殼聚糖處理的細(xì)胞中加入20μmol·L-1的外源ATP 則使細(xì)胞內(nèi)ROS 水平顯著降低，約降為殼聚糖處理細(xì)胞的0.6倍（見圖1：k～n，圖7）。

用10 μg·mL-1殼聚糖處理使得細(xì)胞PAL 活性顯著升高。單獨(dú)用20μmol·L-1的外源ATP 處理使得細(xì)胞PAL 活性有輕微上升，但未達(dá)到顯著水平。而較之殼聚糖處理的細(xì)胞，在10μg·mL-1殼聚糖處理下加入20μmol·L-1的外源ATP 使PAL 活性顯著降低，約殼聚糖處理的細(xì)胞的0.8倍（見圖8）。

3 討論

活性氧（ROS）可以作為信號(hào)分子調(diào)控植物生長發(fā)育并參與激活防御反應(yīng)。已有研究表明，蛋白或寡糖等激發(fā)子均可誘導(dǎo)煙草ROS 的釋放［27～28］。本研究發(fā)現(xiàn)，在用殼聚糖誘導(dǎo)處理煙草懸浮細(xì)胞30 min 后細(xì)胞內(nèi)ROS 便顯著升高，并且誘導(dǎo)ROS水平的高低與其濃度密切相關(guān)。苯丙氨酸解氨酶（PAL）在植物生長、次生代謝物合成及抗逆過程中有重要作用［13～14］。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，殼聚糖誘導(dǎo)處理后煙草懸浮細(xì)胞PAL 活性先隨殼聚糖濃度的增加而升高，在15μg·mL-1殼聚糖處理下PAL活性達(dá)到峰值，此后在20 μg·mL-1殼聚糖處理下PAL 活性有所下降，但仍然高于對(duì)照。不同濃度外源ATP處理下未引起ROS水平和PAL活性的顯著變化。而和ROS 水平和PAL 活性變化不同的是，殼聚糖處理下煙草懸浮細(xì)胞胞外ATP 含量顯著下降。

Amborabe?［29］等研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖的作用部位主要位于細(xì)胞質(zhì)膜，其能夠激活植物細(xì)胞質(zhì)膜H+-ATP 酶的活性，促進(jìn)生物膜去極化并誘導(dǎo)一系列相關(guān)事件的發(fā)生。因此，殼聚糖可能通過激活植物細(xì)胞質(zhì)膜ATP 酶活性，進(jìn)而促進(jìn)胞內(nèi)ATP 水解，ATP 通過轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白或者胞吐等作用從胞內(nèi)釋放到胞外的ATP 量減少，同時(shí)作為次級(jí)代謝信號(hào)分子，質(zhì)子跨膜流動(dòng)也會(huì)引起ROS 水平升高并伴隨防御基因的表達(dá)及抗性相關(guān)酶PAL 活性的升高。因此，我們認(rèn)為胞外ATP 水平的降低可能是殼聚糖誘導(dǎo)植物早期反應(yīng)的關(guān)鍵條件之一。

為了進(jìn)一步判斷胞外ATP 對(duì)殼聚糖誘導(dǎo)的ROS 和PAL 活性變化是否具有影響，我們?cè)?0μg·mL-1的殼聚糖處理的煙草懸浮細(xì)胞中比較了外源施加ATP和未施加ATP后ROS含量和PAL活性的不同。結(jié)果顯示，在殼聚糖處理的煙草懸浮細(xì)胞中施加20μmol·L-1外源ATP 可顯著降低殼聚糖引起的ROS水平和PAL 活性的升高，這提示，胞外ATP水平可負(fù)向調(diào)節(jié)殼聚糖引起的ROS水平和PAL活性的升高。

研究表明，外源ATP 處理可引起作物的抗氧化酶活性顯著增強(qiáng)，從而減少ROS的積累［30-31］。此外，Chivasa 等［32］發(fā)現(xiàn)，用800 μmol·L-1的外源ATP處理煙草葉片導(dǎo)致了超氧化物歧化酶蛋白含量的顯著性上升。我們實(shí)驗(yàn)室之前的工作也發(fā)現(xiàn)，外源ATP能夠減少鉛脅迫下煙草懸浮細(xì)胞ROS的上升，并顯著上調(diào)植物的抗氧化酶活性［33］。因此，胞外ATP 可能通過提高植物的抗氧化酶活性而減少殼聚糖引起的ROS的升高。Wu等［22］發(fā)現(xiàn)，對(duì)傷處理的番茄葉片施加細(xì)胞外ATP 水解酶（降低了細(xì)胞外ATP 水平）導(dǎo)致了PAL 編碼基因表達(dá)量的上升，提示胞外ATP 負(fù)向調(diào)節(jié)PAL 編碼基因的表達(dá)。因此，推測(cè)在殼聚糖引起的PAL 活性升高過程中胞外ATP 水平可能通過影響PAL 編碼基因的表達(dá)而負(fù)向調(diào)節(jié)了PAL活性。

以上研究表明，胞外ATP 水平至少可負(fù)向調(diào)節(jié)殼聚糖引起的ROS水平和PAL活性的升高。盡管胞外ATP 對(duì)殼聚糖所引起的這些生理學(xué)變化的負(fù)向調(diào)控的意義尚不清楚。但有部分研究發(fā)現(xiàn)，人為增加植物細(xì)胞胞外ATP 水平會(huì)降低植物對(duì)病毒和細(xì)菌的抗性；而降低植物細(xì)胞胞外ATP 水平會(huì)增加植物對(duì)病毒和細(xì)菌的抗性［34～35］。另有研究發(fā)現(xiàn)，減低植物的胞外ATP 水平會(huì)增加植物對(duì)低溫的耐受［36］。

這些工作提示，在某種環(huán)境下植物需要降低胞外ATP 水平以增強(qiáng)自身的抗性反應(yīng)。因此，殼聚糖處理下煙草懸浮細(xì)胞胞外ATP 含量下降可能是植物細(xì)胞加強(qiáng)ROS 水平和PAL 活性所需要的，從而增強(qiáng)了殼聚糖的生理學(xué)效應(yīng)。其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步揭示。